פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים במהלך הבידול המיאלואידי הרגיל של גזע hematopoietic חיובי CD34 ותאי אבי המין. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר התביור של תאים חיוביים CD34 לאורך כל ארבעת שושלת מיאלואידים כולל megakaryocytes, אריתרוציטים, גרנולוציטים, מונוציטים. הדגימה של ההליך תהיה אדיטי באפט, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.
לבידוד תאי מונונוקלארי מדגם דם טבור אנושי, יש לעקר את המשטח החיצוני של שקית דם טבור עם 70% אתנול לפני העברת תכולת השקית לבקבוק פלסטיק סטרילי של 250 מיליליטר בתוך ארון בטיחות ביולוגי. לדלל את הדם עם נפח שווה של טמפרטורת החדר תמיסת מלח במאגר של האנק, ולהוסיף 15 מיליליטר של שבר תאים חד גרעיניים בינוני לכל אחד מחמשת צינורות חרוט סטרילי 50 מיליליטר. לאחר ערבוב עדין, בזהירות לשפוך 30 מיליליטר של דם חבל הטבור מדולל על מדיום שבר mononuclear בכל צינור, מחזיק את צינורות 50 מיליליטר בזווית כדי לסייע במניעת ערבוב השכבות.
להפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות, ולהסיר את העליון 15 כדי 20 מיליליטר של פלזמה מעל שכבת התא mononuclear. השתמש פיפטה להעביר בזהירות את שכבת התא mononuclear חשוף לתוך צינור חדש 50 מיליליטר, צנרת התאים mononuclear משניים עד שלושה צינורות יחד, ולהביא את הנפח הסופי בכל צינור עד 50 מיליליטר עם חיץ PBE קר. גלולה דגימות תא mononuclear על ידי צנטריפוגה, ושואפים את supernatants.
הקש על כל צינור בעדינות כדי לשחרר את כדורי התא, ולדלל את כדורי בחמישה מיליליטר של חיץ PBE קר כקרח. לשלב את התאים משלושה עד ארבעה צינורות לתוך צינור חרוט אחד 50 מיליליטר, ולשטוף את כל הצינורות עם חמישה מיליליטר של חיץ PBE טרי כדי לאסוף את כל התאים הנותרים. לאחר הספירה, להביא את הנפח הסופי בצינור עד 50 מיליליטר עם חיץ PBE קר קרח טרי, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.
כדי לבודד את התאים mononuclear חיובי CD34, להשעות מחדש את גלולה ב 50 מיליליטר של מאגר PBE טרי לפני איסוף התאים עם צנטריפוגה אחרת. לאחר השלכת supernatant, הקש בעדינות כדי לשחרר את גלולה, ולהשעות מחדש את התאים באחת פעמים 10 לשמונה תאים mononuclear לכל 300 microliters של ריכוז חיץ PBE קר כקרח. חסום כל כריכה לא ספציפית עם 100 מיקרוליטרים של קולטן Fc החוסם את הריאגנט, ערבב בעדינות ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטרים של חיידקי CD34 מערכת מיקרוביאד אנושית למיון תאים מגנטיים ל- CD34 לכל אחד פעמים 10 לשמונה התאים עם ערבוב עדין, ודגירה של התאים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בזמן שהתאים דגירה, מקם עמודת LS ומסנן טרום הפרדת צבע בשדה מגנטי מפריד MACS. לצייד את העמודה עם שני מיליליטר של חיץ PBE קר כקרח ואת המסנן לפני ההפרדה עם מיליליטר אחד של חיץ. אפשר לעמודה להתרוקן לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ולהשליך את הזרימה דרך.
בסוף הדגירה, להביא את הנפח הסופי של דגימת תא mononuclear עד 15 מיליליטר עם חיץ PBE קר קרח טרי ומעים את התאים על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של חיץ PBE קר כקרח טען את התאים על המסנן לפני ההפרדה על העמודה. שוטפים את הצינור בשלושה מיליליטר של חיץ PBE קר כקרח ומוסיפים את המאגר למסנן שלפני ההפרדה.
לשטוף את העמוד ארבע פעמים עם שלושה מיליליטר נוספים של חיץ PBE קר כקרח לכל לשטוף ללא המסנן, המאפשר את העמודה לנקז באופן מלא בין כל לשטוף. לאחר הכביסה הסופית, להעביר את העמוד לתוך צינור חדש 15 מיליליטר, לצלול חמישה מיליליטר של PBE קר קרח טרי דרך העמוד לתוך הצינור. כדי לקבוע את שברי אוכלוסיות גזע וצאצאים בגזע cd34 חיובי מבודד ותאי ההמגניטור החיוביים, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה באחת פעמים 10 לשישה תאים לכל 50 microliters של ריכוז חיץ ציטומטריה זרימה.
לאחר מכן, להעביר את התאים ב 50 aliquots microliter לכל צינור פלואורסצנטיות מיליליטר מופעל תאים על פי פרוטוקול תיעוב ציטומטריה זרימה ניסיונית. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים המתאים וכתמים חיים/מתים לתאים, וכוונו את הנפח ל-100 מיקרוליטרים בסך הכל. לאחר 20 דקות בחושך מוגן מפני אור, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של חיץ cytometry זרימה טרייה לכל צינור, ולהשעות מחדש את התאים ב 500 microliters של חיץ cytometry זרימה טרייה לכל צינור.
לאחר מכן לנתח את התאים על ציטומטר זרימה על פי פרוטוקולים ציטומטריים זרימה סטנדרטיים. כדי להבדיל בין תאי גזע חיוביים של CD34 מבודד microbead ותאי אב לתאי שושלת מיאלואידים, יש לציפוי ראשון של בארות של צלחת סטרילית ולא מצופה של 48 בארות עם 200 מיקרוליטרים לבאגם של פתרון פיברונקין אנושי רקומביננטי ב-PBS לשעתיים בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להשליך את פתרון fibronectin מכל באר ולחסום את הבארים עם 200 microliters של אלבומין סרום 2%bovine.
לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את בארות פעמיים עם 500 microliters של PBS סטרילי לכל לשטוף. להשעות מחדש את התאים החיוביים CD34 מבודד טרי בחמש פעמים 10 חמשת התאים למיליליטר של ריכוז בינוני גירוי חם. לאחר מכן, זרע 200 microliters של תאים לתוך כל באר של צלחת מצופה שבר fibronectin ולה מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 48 שעות.
בסוף הדגירה, לאסוף את התאים עם צינורות עדינים, ולשטוף את הבארים עם 500 microliters של מדיום הנשר מחומם של Dulbecco שונה, איגום לשטוף עם ההשעיה התא. לאחר הספירה, להשעות מחדש את התאים ב 2.5 פעמים 10 לארבעת התאים לכל מיליליטר אחד של ריכוז בינוני מיאלואיד. שכבה 200 microliters של תאים חיוביים CD34 ל הבאר בתא MS-5 סטרומה זרע 48 גם צלחת רקמות.
לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התאים, מחליפים בעדינות 100 מיקרוליטרים של העל-טבעי בכל באר עם 100 מיקרוליטרים של מדיום מיאלואידי טרי פי 2 כל שלושה עד ארבעה ימים. ביום 21, לקצור את התאים לניתוח של ביטוי סמן שושלת מיאלואיד על ידי cytometry זרימה כפי שהוכח רק. האחוז האופייני של תאים חיוביים CD34 הכולל מבודד מדם טבור על ידי הפרדת microbead כפי שהוכח נע בין 80 ל 90%ניתוח Immunophenotypic מגלה כי אלה CD34 תאים חיוביים בדרך כלל מורכב כ 20%שושלת שלילי CD34 חיובי CD38 שלילי אוכלוסיית תאי גזע hematopoietic ו 72%שושלת שלילי CD34 חיובי CD38 חיובי רב עוצמה אוכלוסיית תאי progenitor.
בתוך אוכלוסיית תאי הצאצא הרב-עוצמה, כ-25% מהתאים מבטאים סמני אבי מיאלואידים נפוצים, כ-15% מסמני מונוגניטור גרנולוציטים, וכ-56%אקספרס סמני אריתרואיטור מגה-קרויטים. Immunophenotyping גם מדגים כי אחוז תאים חיוביים CD34 מפחית מכ 90% בבידוד פחות מ 25% ביום 21. ניתוח האוכלוסייה השלילית CD34 מדגים עלייה במקביל באחוז התאים המבטאים סמני שושלת מיאלואידיים בוגרים.
יתר על כן, תאים מוכתמים רייט-Giemsa להפגין מאפיינים מורפולוגיים ברורים בימים 1 ו -21 עם תרבויות מובחן המציגים גרעינים גדולים, עגולים, ציטופלסמה קטנה מאוד ואת התרבויות המובחנות המציגות מאפיינים מורפולוגיים של תאי שושלת כולל שהם מונוציטים, גרנולוציטים, אריתרובלסטים. זכור לשפוך את הדם הטבור מדולל על מדיום שבר התא mononuclear מבלי לערבב את השכבות, ולא להפריע MS-5 ו CD34 תאים חיוביים בעת שינוי המדיום. בעקבות פרוטוקול ההידול הזה, ניתן לנתח את תרבות התאים החיוביות של CD34 לשינויים מורפולוגיים, אפקטים אפופטיים, שינויים בדפוסי מחזור התאים ודרגת ההידול.
