מערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד להערכת תרופות פרמקוקנטיות וטוקסיקולוגיות

מערכות מיקרופיזיולוגיות יש את היכולת לחקות פרמקוקינטית ואת התגובה טוקסיקולוגית של גוף האדם לטיפולים ספציפיים של אינטרסים. מערכות מיקרופיזיולוגיות יש פוטנציאל להחליף ניסויים בבעלי חיים כמו השימוש בהם יכול לשפר את כוח החיזוי של שיטות במבחנה ולהפחית את העלות והזמן של מחקרים פרמקוקינטים וטוקסיקולוגיים. 24 שעות לפני ניהול חומר הבדיקה, לפצל aliquot 800 microliter של ויליאם ES בינוני בין התאים הגדולים והקטנים יותר של שני שבבי איברים, ולזאפת את המדיום הבסיסי ואפיקל מכל מחסום מעיים שווה ערך ב 24 צלחות באר מוכן.

באמצעות מדפים סטריליים, לשלב הכנס אחד לכל מעגל שבב איברים לתוך התא הגדול יותר ולהוסיף 200 microliters של DMEMS לצד apical. בעזרת טיפים רחבים, יש לשלב 20 מקבילות כבד לכל מעגל בתא הקטן יותר של שני שבבי האיברים ולחבר את המערכת ליחידת הבקרה. לאחר מכן חבר את יחידת הבקרה לאספקת אוויר בלחץ והגדר את הלחץ לכ-300 חטיפי פלוס או מינוס 300 ותדר שאיבה של 0.3 הרץ.

למחרת לדלל את פתרון פרצטמול המניה לריכוז 12 micromolar. כדי להחליף את המדיום במערכת, שאפו את המדיה הבסיסית והאפילית ממחסום המעי המקביל בשני שבבי האיברים והוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום תרבות מתאים טרי לתא הגדול בצד הבזל האורגנואידי ו-300 מיקרוליטרים לתא הקטן. לאחר בדיקת בועות, לחקות את הממשל אוראלי עם תוספת של 200 microliters של פתרון 12 פרצטמול מיקרומולרית בצד האפי של תרבות המעי מכניס ולחבר את המערכת המיקרופיזיולוגית ליחידת הבקרה.

לאסוף את הנפח הכולל משני הצדדים apical מעיים ובזלת, כמו גם מן התא הקטן ב triplicate בנקודות הזמן שצוינו. לאחר איסוף כל הדגימות, הגדר את כל הפרמטרים הרלוונטיים לניתוח HPLC כמצוין בטבלה וסנן את השלב הנייד באמצעות מסנן קרום מיקרון 0.4 תחת ואקום. לאחר מכן סנן את הדגימות באמצעות מסנן מזרק PVDF בגודל 0.22 מיקרון ומאחסן את הדגימות בבקבוקון לפני שתתחיל במדידת HPLC UV.

כדי להעריך את הכדאיות האורגנואידית, העבר את כל 20 הכדורידים מכל שכפול ל בארות בודדות של צלחת באר 96 ולהעביר את תרבות התא מוסיף בארות בודדות של צלחת 24 באר. לשטוף את הרקמה שווה ערך שלוש פעמים עם DPBS טרי לכל לשטוף ולהוסיף 300 microliters של פתרון MTT מיליגרם אחד למיליליטר לכל באר ניסיונית. לאחר אינקובציה של שלוש שעות באינקובטור תרבות התא, החלף את פתרון MTT עם 200 מיקרוליטרים של isopropanol ל הבאר עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לחלץ את פורמזן MTT מן המעי ואת הכבד שווה ערך.

למחרת בבוקר, להעביר 200 microliters של כל על טבעי ל הבאר המתאימה בצלחת 96 באר ולקרוא את formazan על קורא לוח ב 570 ננומטר כדי לאפשר חישוב של היכולת היחסית של התאים כדי להפחית MTT באמצעות הצפיפות האופטית הממוצעת של כל נקודת זמן לעומת הפקד השלילי. לניתוח ציטוכימי והיסטולוגי של הדגימות, תחילה לתקן את המעי ואת הכבד שווה ערך ב 4% paraformaldehyde ב 0.1 PBS טוחן במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את האורגנואידים חמש פעמים PBS במשך 10 דקות לשטוף, לפני הכתמת המקבילות מעיים וכבד עם tetramethylrhodamine isothiocyanate פאלואין אלקסה פלואור 647 פאלודין במשך שעה בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, מעבירים את הדגימות למדיום הקפאה במשך כמה דקות לפני הצמד מקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי. לאחר מכן, להשתמש cryostat לרכוש 10 עד 12 מיקרון עבה כבד spheroid cryo-סעיפים ולהוות את חלקי הרקמה במדיום הרכבה עם DAPI להדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות confocal. עבור כתמים מיטוכונדריאליים וגוארוניים, לכסות לחלוטין את הדגימות עם פתרון הכתמים המיטוכונדריאלי עבור דגירה 15 עד 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5%פחמן דו חמצני.

בסוף הדגירה, החליפו בזהירות את תספור הכתמים ב-2%-4% paraformaldehyde ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר תיקון, בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם PBS טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף לפני תיוג הדגימות עם חומצה גרעינית מכתים פתרון עבודה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם שלוש, חמש דקות שטיפות PBS מוגן מפני אור, ולהשתמש בכתם חומצת הגרעין כדי להקל על כימות של מספר הכתם המיטוכונדריאלי המביע תאים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערכות המסנן המתאימות.

שילוב מחסום המעי האנושי וכבד שווה ערך למכשיר microfluidic שבב שני איברים מאפשר הערכה של תכונות פרמקוקינטיות וטוקסיקולוגיות של טיפולים מעניינים. לאחר הטיפול, דגימות המדיה ניתן לנתח על ידי HPLC. ניתן לנתח את האורגנואידים על ביטוי הגנים שלהם, ערכי ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל, ביטוי ופעילות החלבון, כמו גם על המאפיינים המורפולוגיים שלהם.

ניתוח MTT יכול להתבצע כדי להעריך את הכדאיות organoid, כמו גם לזהות אירועים רעילים מוקדם מאוד בתגובה לטיפול פרצטמול. זרימת התקשורת אינה משפיעה באופן משמעותי על ספיגת פרצטמול, ואילו זה משפר באופן משמעותי את הפונקציונליות המקבילה לכבד, המציין כי ספיגת פרצטמול מעיים אנושי מטבוליזם הכבד ניתן לחקות במערכת מיקרופיזיולוגית זו. מערכות מיקרופיזיולוגיות יש פוטנציאל להחליף מודלים של בעלי חיים בפיתוח וגילוי תרופות כפי שהם טובים יותר לחקות פיזיולוגיה אנושית והוא יכול לשמש כדי לקדם פיתוח תרופות במהירות גבוהה יותר ועלות נמוכה יותר לסיכון ומורכבות.