Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

המחברים מבקשים להכיר בכך שמחקר זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי לפרויקט PATROLS, במסגרת הסכם מענק מס' 760813

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יישומים עבור דגמי הכבד 3D להשתנות במידה ניכרת בהתאם לנקודת הקצה הביוכימית מסוימת או מסלול תוצאה שלילית להיות ממוקד. לכל דגם יש את היתרונות והמגבלות שלו, החל מווריאציות בין-תאיות במודלים ראשוניים של הפטוציטים אנושיים (PHH) וכלה בפעילות ציטוכרום p450 מופחתת במודלים מבוססי קו תא, אך כולם בעלי ערך בזכות עצמם6,12,18,19. בעת הערכת genotoxicity יש מגבלות בתאימות מודלים עם נקודות קצה שאושרו רגולטורית כגון במבחנה micronucleus assay, כמו התפשטות פעילה נדרשת. זה הכרחי, כמו הערכת genotoxicity דורש כימות של נזק DNA קבוע כדי להיות מוערך לאחר חלוקת התא כאשר יש הזדמנות לתיקון DNA לתקן נגעים חולפים. למרבה הצער, hepatocyte מובחן מאוד (כלומר, HepaRG) מבוסס ספרואידים או microtissues PHH, אשר נחשבים להפגין את המאפיינים הרלוונטיים ביותר מבחינה פיזיולוגית דמויי כבד טופס סטטי (לא שגשוג) מודלים12,19,20. כתוצאה מכך, דגם הכדוריד 3D HepG2 המוצג כאן מספק מודל מתאים ואלטרנטיבי המסוגל לתמוך בבדיקות גנוטוקסיות. Spheroids מבוססי קו התא HepG2 יש מספיק תאים מפרידים באופן פעיל על פני השטח החיצוניים של spheroids תוך שמירה על מאפיינים בסיסיים דמויי כבד, כגון ייצור אלבומין אוריאה וכמה פעילות CYP4505,12,19. בעיקר מודל זה בכבד במבחנה פותחה כדי להשלים את הבדיקה micronucleus, שכן זהו אחד משני מבחני במבחנה מומלץ בסוללה לבדיקת genotoxicity8,10,11,21. עם זאת, המודל יכול להיות מיושם בקלות על ניתוח רצף DNA וטכנולוגיות ביטוי גנים (RNA), בעוד שיש לו פוטנציאל להיות מותאם עוד יותר מנוצל עבור נקודות קצה אחרות נזק DNA, כגון שביט assay. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון את התפקיד שהפרעות ENM ממלאות בניתוחים מסוימים של נקודות קצה. לדוגמה, ניתוחים מבוססי cytometry זרימה לא יכול להיות מתאים להערכת genotoxicity ENM במיוחד עקב הפרעה חלקיקים22.
גורם מגביל אחד של מודלים ספרואידיים שעוברים באופן פעיל חלוקת תאים הוא גודלם. אופטימיזציה של צפיפות הזריעה היא קריטית מכיוון שצריכים להיות מספיק תאים המאפשרים למודל להמשיך להתרבות; אבל לא מספר תא גבוה מדי, מה שמוביל לכך שהספרויד הופך לקומפקטי מדי, מה שמוביל לליבה נמקית מוגברת. הגורם לנמק זה הוא האמין להיות מוגבל חמצן ופיזור מים מזינים, כמו הגבול של דיפוזיה זו נחשבת כ 100 – 150 מיקרומטר של רקמה23,24. עם זאת, הדבר תלוי בסוג התא, מספר התא, אינטראקציות הפיגומים ותנאי התרבות25. מאז, הוכח כי כ 700 קוטר מיקרומטר הוא הגבול למניעת התפרצות מוקדמת של נמק במרכז כדורי C3A, זריעת 4000 תאי HepG2 לכל ספרואיד מבטיח את קוטר הדגם בזמן החשיפה הוא ≤500 מיקרומטר26. יתר על כן, Shah et al. קבע כי תאי HepG2 זרעים מעל 5000 תאים לכל ספרואיד הציג ירידה של 25% בכדאיות לאחר 7 ימים בתרבות, אשר יכול לכלול את הקוטר הממוצע של 680 מיקרומטר וזמינות מוגבלת של חומרים מזינים בירידה תלויה 20 μL5. כדי להתגבר על כך, המודל שהומצא בפרוטוקול הנוכחי עובר שלב קריטי שבו הטיפה התלויה מועברת לבארות מצופות אגרוז לאחר היווצרות ראשונית של הספרואיד. זה מבטיח נפח גדול יותר של מדיום תרבות קיים כדי לקיים את המספר ההולך וגדל של תאים בתוך spheroids. כתוצאה מכך, המודל הכדורי HepG2 נשאר מעל 70% קיימא לאחר 10 ימים בתרבות והוא יכול להיות מנוצל להערכת סכנה לטווח ארוך במבחנה. 
בעוד המודל הכדורי HepG2 יכול לתמוך הן משטרי חשיפה חריפה וארוכת טווח, מרענן את תרבות התא בינוני במהלך תקופות תרבות מורחבת מוגבל עבור מודל זה כמו החלפה מלאה של המדיום לא מומלץ בשל אובדן פוטנציאלי של spheroids. יש להניח כי עם חשיפות ENM, הנטייה לפיזור ENM הומוגנית כדי agglomerate ומשקעים הוא גבוה. עם זאת, ראוי לציין כי הקצב שבו משקעי ENM יכולים להשתנות בהתאם לפרמטרים החלקיקים (למשל, גודל, צורה וצפיפות) וניתן לקבוע באופן תיאורטי באמצעות משקעים במבחנה, דיפוזיה ודוזימטריה (ISDD), או נגזרות האחרונות שלה, המכונה לעתים קרובות כאשר לגבי ENM (השעיה) חשיפה מתקרב27,28. עם זאת הוא המוח, ההנחה היא כי אם רק 50% של מדיום תרבות התא מוסר בזהירות מפני השטח של תרבות התא, ההפרעה והסרה לאחר מכן של מינון ENM צריך בתיאוריה להיות מינימלי. עם זאת, עם תנועה בראונית במשחק, זה לא יכול להיות המקרה בקפדנות ועבודה נוספת לתוך התצהיר ואת משקעים של כל ENM מסוים להיבדק צריך להתבצע כדי להבטיח את הדוזימטריה הנכונה נשמרת לאורך כל משטר החשיפה לטווח ארוך27. בעיקר זוהי מגבלה פוטנציאלית שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע משטרי מנון חוזרים ונשנים שכן זה יכול להיות קריטי לריכוז הסופי, המצטבר. חשיפות מבוססות כימית מצד שני, אמנם לא בלי המגבלות שלהם לשקול, מציעים גישה פשטנית יותר בכך חומרים כימיים נוטים להישאר בתמיסה ובכך החלפה ישירה של הריכוז הכימי המקורי בנוסף לריכוז החדש שנוסף מבטיח כי כל כימיקל שאבד במהלך כיבוד התקשורת מוחלף בהתאם29. יישומים עתידיים יכללו הערכת ההתאמה של המודל למשטרי חשיפה חוזרים ונשנים לאורך תקופות תרבות ארוכות טווח, שכן אסטרטגיות מינון חוזרות ונשנות חשובות ביותר להערכת היכולת של מערכת איברים מסוימת לשפר או להתגבר על ההשפעות השליליות, אם בכלל, הנגרמות על ידי ביואקומולציה של חומר קסנוביוטי.
לסיכום, מודל זה 3D במבחנה הכבד יש את היכולת להיות מנוצל להערכת מגוון של תרחישי חשיפה מציאותיים, ובכך לספק גישה במבחנה בעתיד כדי לתמוך טוב יותר הן ENM והערכת סכנה כימית באופן שגרתי ונגיש בקלות.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

בשל ההתפתחות המהירה והיישום של מגוון רחב של ננו-חומרים מהונדסים (ENM) על פני שפע של יישומים מבוססי אדם (למשל, מזון, קוסמטיקה, ביגוד, ציוד ספורט, אלקטרוניקה, תחבורה ורפואה), זה בלתי נמנע כי בני אדם ייחשפו ENM על בסיס קבוע. עם זאת, ישנם חששות מוגברים כי הרומן, גודל ספציפי פיזיותרפיה מאפיינים כימיים המ סבורים חומרים אלה יתרון ביישומים רבים עלול לגרום להשפעות שליליות על בריאות האדם ועל הסביבה בו זמנית. כיום פעילויות בינלאומיות רבות נמצאות במקום כדי לשקף באופן פעיל חשיפות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית ENM אלה ולהעריך את הרעילות הפוטנציאלית של חומרים אלה על פני תרחישי חשיפה חריפים, ארוכי טווח, חוזרים ונשנים במינון נמוך.
טוקסיקולוגיה בכבד היא המפתח כאשר בוחנים חשיפה ENM, כפי שהוא ידוע כי הכבד הוא אתר מרכזי של הצטברות ENM לאחר חשיפה1,2. יתר על כן, הכבד הוא מערכת האיברים העיקרית לחילוף חומרים וניקוי רעלים של חומרים הנכנסים למחזור המערכתי3. בהתבסס על ההבנה המקובלת כי מודלים 2D hepatocyte אינם מחקים במדויק את המורכבות של אינטראקציות רב תאיות מורכבות או מייצגים כראוי פעילות מטבולית שנצפתה vivo, התמקדות גדולה יותר לפתח חזק רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה 3D מודלים הכבד עבור טכנולוגיות תחליף in vivo הוקמה4,5. שימוש בטכנולוגיות תרבות תלת-ממדיות מתקדמות משפר את תוחלת החיים של דגמי הכבד במבחנה ומאפשר לחקור משטרי חשיפה ארוכי טווח וחוזרים ונשנים. בנוסף, פורמט תרבות מתקדם זה מקדם היווצרות של תכונות פיזיולוגיות משופרת, organotypic כגון canaliculi מרה, תהליכי טרנספורטר פעיל ויכולות חילוף חומרים תרופתיות משופרות CYP450, ובכך לשפר את החיזוי של הדגמים6. מודלים נוכחיים של 3D במבחנה בכבד המורכבים מתרבויות מונו (hepatocytes בלבד) או תרבויות משותפות (hepatocytes עם תאים שאינם פרנצ'יליים) קיימים במספר פורמטים, החל microtissues או spheroids בלוחות הידבקות אולטרה, ספירואידים טיפה תלויים, תאים מוטבע מטריצות ו / או פיגומים פלטפורמות תרבות תאים מיקרופלואידיים, כולם נחשבים יעילים מתקדם במבחנה מודלים להערכת רעילות בכבד6,7. עם זאת, רוב מערכות מודל אלה הן תחזוקה גבוהה, דורשים ציוד מיוחד והם יקרים. יתר על כן, מודלים אלה הם לעתים קרובות סטטיים (כלומר, מודלים תאים שאינם מחולקים) המונע את השימוש בהם להערכת נקודות קצה סיכון, כגון בדיקות genotoxicity ניצול שיטות לכמת נזק DNA קבוע. Genotoxicity הוא תנאי מוקדם ליבה בטוקסיקולוגיה רגולטורית, וזה מרכיב חיוני של הערכת הסיכון של כל רעיל8. אין מבחנים בודדים שניתן ליישם כדי לכמת את כל צורות הנזק לדנ"א שעלולות להתעורר בעקבות חשיפה לסוכן אקסוגני. עם זאת, מרכיב הליבה של הסוללה בדיקות genotoxicity במבחנה הוא הבדיקה micronucleus, שהיא טכניקה אמינה ורבת פנים המודדת נזק כרומוזומלי ברוטו9. זוהי טכניקה סטנדרטית זהב המתוארת על ידי ה-OECD מבחן קו מנחה 487, להערכת נזק DNA במבחנה genotoxicity והוא חלק הדרישה סוללת הבדיקה להערכת סיכון רגולטורי10,11.
קו התא קרצינומה hepatocellular האנושי, HepG2, נמצא בשימוש נרחב עבור הקרנת הערכת סכנה ראשונית כמו התאים זמינים, זול יחסית למקור, פשוט לתרבות נוח להקרנת תפוקה גבוהה12,13. כאשר מתורבתים לתוך מבנים כדוריים 3D, הם הוכחו recapitulate את הכבד microenvironment היטב ולהציע מודל כבד עם יכולות שגשוג מספיק כדי לתמוך micronucleus assay3. פיתוח נוסף של מודלים כדוריים HepG2 הוקמה כדי לשפר את תוחלת החיים ואת הפונקציונליות דמוית הכבד של המודל על מנת לתמוך הערכת סכנת genotoxicity על פני משטרי חשיפה ארוכי טווח, חוזרים ונשנים (≤14 ימים). לכן, בהתאם לעקרונות של 3Rs להחליף, להפחית ולמקד ניסויים בבעלי חיים, הפרוטוקול הנוכחי הוקם כדי לספק מודל מתקדם 3D במבחנה הכבד מסוגל להעריך באופן אמין נקודות קצה טוקסיקולוגיות מרובות (למשל, פונקציונליות הכבד, (פרו)סמנים דלקתיים, cytotoxicity ו genotoxicity) בעקבות חשיפות כימיות ו- ENM חריפה, ארוכת טווח וחוזרת על עצמה בשגרה
כאן, אנו מציגים שיטה להקים קו תאים 3D hepatocyte רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מבוסס במערכת מודל במבחנה להערכת סכנת genotoxicity בעקבות חשיפות ENM חריפה או ארוכת טווח, חוזרות ונשנות. ניתן לחלק את הפרוטוקול ל-6 שלבים מרכזיים: תאי HepG2 קריאופרדים; הכנת ספרואיד HepG2; העברת ספרואיד HepG2 מירידה תלויה להשעיה agarose; קציר כדורי HepG2; micronucleus מבחנים וניקוד; וניתוח נתונים.

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albumin Assay</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell Freezing Aid</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards for Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, UK</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Glass Slides</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td><td>VWR Chemicals, UK</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer and Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil for Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Class II Tissue Culture Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Filtered, Sterile 200&amp;micro;l and 1000&amp;micro;l Pipette tips</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - Probe</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>T-25 (690175) and T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Urea Assay Kit</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>DuPont, UK</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath (37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m Filter Unit</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasteur Pipette</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL or 100mL Glass Bottles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Skirted Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Square, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

בשל ההתפתחות המהירה והיישום של מגוון רחב של ננו-חומרים מהונדסים (ENM), חשיפה ל- ENM היא בלתי נמנעת ופיתוח מערכות בדיקה במבחנה חזקות וחיזוי הוא חיוני. טוקסיקולוגיה בכבד היא המפתח כאשר בוחנים חשיפה ENM, כמו הכבד משמש תפקיד חיוני הומאוסטזיס מטבולית דטוקסיפיקציה, כמו גם להיות אתר מרכזי של הצטברות ENM לאחר חשיפה. בהתבסס על זה ועל ההבנה המקובלת כי מודלים hepatocyte 2D אינם מחקים במדויק את המורכבות של אינטראקציות רב תאיות מורכבות ופעילות מטבולית שנצפו vivo, יש דגש גדול יותר על התפתחות של מודלים כבד 3D רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית המותאמים למטרות הערכת סיכון ENM במבחנה. בהתאם לעקרונות של 3Rs להחליף, להפחית ולמקד ניסויים בבעלי חיים, מודל כבד מבוסס קו התא 3D HepG2 פותחה, שהיא ידידותית למשתמש, מערכת חסכונית שיכולה לתמוך הן משטרי חשיפה ENM מורחבים וחוזרים על עצמם (≤14 ימים). מודלים ספירואידיים אלה (קוטר ≥500 מיקרומטר) שומרים על יכולתם המשגשגת (כלומר, חלוקת מודלים של תאים) המאפשרת להם להיות משולבים עם בדיקת מיקרונוקלאוס 'תקן זהב' כדי להעריך ביעילות את הגנוטוקסיות במבחנה. היכולת שלהם לדווח על מגוון של נקודות קצה טוקסיקולוגיות (למשל, תפקודי כבד, (פרו)תגובה דלקתית, cytotoxicity ו genotoxicity) התאפיינה באמצעות מספר ENMs על פני שני אקוטי (24 שעות) ו לטווח ארוך (120 h) משטרי חשיפה. מודל זה 3D במבחנה הכבד יש את היכולת להיות מנוצל להערכת חשיפות ENM מציאותי יותר, ובכך לספק גישה במבחנה בעתיד כדי לתמוך טוב יותר הערכת סכנה ENM באופן שגרתי ונגיש בקלות.

ההתאמה של מודל ספירואיד כבד תלת-ממדי מבוסס קו תאים זה לתרבות ארוכת טווח והערכת סכנה גנוטוקסית הוערכה על ידי ביצוע אפיון בסיסי כדי לקבוע את הכדאיות ואת הפונקציונליות דמוית הכבד של המודל לאורך משך 14 ימים בתרבות, כמו גם את הישימות שלה עבור מבחני מיקרונוקלוס.
אפיון בסיסי של דגם כדורי כבד HepG2 תלת-ממדי לפני כל הערכה טוקסיקולוגית במבחנה, חשוב לבדוק כי כדורי HepG2 3D נוצרו כראוי לפני ביצוע העברת agarose או טיפול כימי / ENM. כדורי HepG2 המיוצרים בשיטת הירידה התלויה לוקחים בדרך כלל 2 - 3 ימים לאחר זריעה (4000 תאים / ספרואיד) כדי ליצור ספירואידים קומפקטיים בצורת כדורית בקוטר ממוצע של 495.52 מיקרומטר W x 482.69 מיקרומטר H כפי שמוצג באיור 5A-5C. כדורי HepG2 שנוצרו כראוי והם מקובלים לשמש להערכה טוקסיקולוגית במבחנה חייב להיות מבנה קומפקטי, כדורי בצורת עם משטח חלק ללא הקרנות חזותיות. איור 5 מספק דוגמאות לאיכות טובה (איור 5D-F)וספרואידים באיכות ירודה (איור 5G-I). האחרון שבהם צריך להיות מושלך. בדרך כלל, 90-95% של spheroids נוצר לכל צלחת תיווצר כראוי להיות קיימא לניסויים נוספים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> איור 5: תמונות מיקרוסקופיות קלות המציגות את המורפולוגיה הטבעית של הספרואידים HepG2 שנוצרו באמצעות שיטת הטיפה התלויה. (A-C) להראות יום 2 ו (D-I) יום 4 HepG2 כבד spheroids פוסט זריעה. (D-F)הם דוגמאות של ספירואידים HepG2 באיכות טובה בעוד (G-I) מראה ספרואידים בצורה גרועה. כל התמונות צולמו במטרה X20 באמצעות מיקרוסקופ. סרגל קנה המידה מייצג 20 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
כדי לאשר עוד יותר את הכדאיות הכדורית HepG2, אלבומין ירוק ברומוקרסול צבעוני בסיסי (BCG) Assay או Urea Assay יכול להתבצע כדי להעריך את הפונקציונליות דמוית הכבד שלהם. פונקציונליות דמוית כבד הוערכה בהתאם לכדאיות באמצעות מבחני ההדרה הכחולים של Trypan במשך 14 יום כדי לקבוע את תוחלת החיים של מודל הכדוריד בכבד ולקבוע אם הוא יכול לתמוך בהערכת סיכונים מבוססת ENM/כימית לטווח ארוך או חוזרת ונשנית (איור 6). ריכוז האלבומין נותר עקבי לאורך תקופת התרבות. ייצור אוריאה מציג עלייה בריכוז של אוריאה המיוצר ספרואיד במשך שבוע בתרבות לפני שהגיע לרמה ביום 7. חשוב לציין כי רמות אלבומין ואאוריאה המיוצרים בספרואידים 3D HepG2 גבוהות משמעותית מזו שנצפו באותו קו תאים בתרבית בפורמט דו-ממדי. ואכן, תרבויות דו-מימדיות של תאי HepG2, שיא אלבומין ורמות אוריאה היו 0.001 מ"ג/מ"ל ו-0.010 ננוגרם/μL בהתאמה. יתר על כן, בעבודה קודמת שפורסמה על ידי שאה ואח 'באמצעות מערכת כדורית HepG2 כמעט זהה, המחברים מדגישים שיפור ניכר בפעילות מטבולית (CYP1A1 ו CYP1A2) במערכות מודל 3D HepG2 במבחנה בהשוואה לתאי HepG2 בתרבית דו-ממדית5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> איור 6: נתוני אפיון בסיסי ל-14 יום עבור ספירואידי כבד HepG2. לאחר ההעברה מירידהתלויה,( A ) מדגיש את הכדאיות של דגם הכדורואיד HepG2 על פני תקופה של 14 יום בעוד (B) ו -( C) להדגיש את פונקציונליות אלבומין דמוי כבד אוריאה בהתאמה. נתונים ממוצעים ± SEM שהוצגו, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עם ההתפתחות הבלתי נמנעת של ליבה נמקית, מגבלה ידועה של תרביות ספירואיד כבד 3D, הכדאיות של מודל זה מבוסס HepG2 היה צריך להיות הוקמה כדי להדגים שהוא היה מסוגל לקיים לטווח ארוך (5-10 יום) משטרי חשיפה תוך שמירה על יכולת התפשטות הנדרשת כדי לתמוך micronucleus assay5. ואכן, מודל זה כדורי כבד 3D הוכח לשמור על >70% הכדאיות על פני 10 ימים בתרבות. בהתבסס על זה בשילוב עם פונקציונליות דמוית כבד מתמשכת שנצפתה במהלך תקופת התרבות ≥14 יום, מודל זה של כבד 3D spheroids יכול ובכך לתמוך לטווח ארוך, משטרי חשיפה חוזרת ונשנית ENM עד 10 ימים (כלומר, לפני הכדאיות של spheroids לרדת מתחת 70%). לעיון, מומלץ כי רמות אלבומין עבור כדורי HepG2 זרעים ב 4000 תאים / ספרואיד צריך להיות ≥20.0 ng/μL בעוד ייצור אוריאה צריך להיות ≥0.25 ng/μL לפני ביצוע הערכה טוקסיקולוגית במבחנה עם מודל זה.
הערכת גנוטוקסיות של ננו-חומרים מהונדסים להערכת genotoxicity, assay micronucleus שימש כדי לקבוע את נוכחותו של micronuclei בעקבות חשיפות אקוטיות (24 שעות) ו לטווח ארוך (120 שעות) ENM. Aflatoxin B1 הוא מסרטן כבד ידוע16,17 והוא שליטה חיובית מומלצת עבור בדיקת micronucleus. ניסויי אופטימיזציה הראו כי 0.1 מיקרומטר של אלפאטוקסין B1 גורם חיובי משמעותית (עלייה ≥2.0 קיפול) תגובה genotoxic ב 3D HepG2 כבד spheroids ולכן משמש בכל micronucleus assay שנערך עם מודל זה. כדי להבטיח את תוקפם של תוצאות בדיקת המיקרו-נוקלוס באמצעות דגם הכדורית HepG2, תדר המיקרו-נוקלוס ברקע לתאי HepG2 המשמשים במודל זה של 3D במבחנה צריך להיות בטווח של 0.6% – 1.2%. כתוצאה מכך, Alfatoxin B1 צריך לגרום לתגובה genotoxic של לפחות פי שניים גבוה יותר מזה שנראה עם שליטה שלילית; לכן, 0.1 מיקרומטר של אלפאטוקסין B1 צריך לגרום לתדר micronuclei בין 1.5% – 3.0%. באמצעות פרמטרי בקרה אלה, ניתן להעריך באופן מהימן את genotoxicity המשויך ל- ENM במבחנה. בהתבסס על הנחיות הבדיקה של ה-OECD 487, חשוב לציין כי בעת בדיקת ENM או כימיקל, הריכוזים שנבחרו לא צריכים לגרום ליותר מ -55% ± 5% ציטוקסיות (המצוין על ידי ירידה בערכי CPBI או RVCC ביחס לשליטה השלילית)11. איור 7 ממחיש את הנתונים שנוצרו כאשר Aflatoxin B1 ושני ENMs (טיטניום דו-חמצני (TiO2)ורסיס (Ag)) הוערכו בעקבות חשיפות חריפות וארוכות טווח בספרואידים של HepG2, והפוטנציאל הגנוטוקסי הבא נותח באמצעות מבחני המיקרו-נוקלוס. שני ENMs העריכו נבדקו במינון לא ציטוקסי, נמוך של 5.00 מיקרוגרם / מ"ל על חשיפה חריפה (24 שעות) ומשטר חשיפה לטווח ארוך (120 שעות). מגמה דומה עבור genotoxicity על פני שני TiO2 ו Ag ENMs ניתן לראות, לפיה תגובת genotoxicity מוגבהת שהביאה לאחר חשיפה 24 שעות לא היה ניכר לאחר חשיפה לטווח ארוך 5 ימים. זאת למרות גנוטוקסיות מתמשכת הנגרמת על ידי השליטה החיובית Aflatoxin B1 בשתי נקודות הזמן.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> איור 7: הערכת Genotoxicity בעקבות חשיפה TiO2 ו Ag ENM על כדורי כבד HepG2. הערכת Genotoxicity (תדר מיקרונוקלוס) באמצעות הפוסט micronucleus assay (A) חריפה (24 שעות) ו -( B) לטווח ארוך (120 שעות) חשיפה ל 5.00 מיקרוגרם / מ"ל של TiO2 ו Ag ENM. שליטה שלילית היא מדיה בלבד, בעוד השליטה החיובית היא 0.1 מיקרומטר של Aflatoxin B1. נתונים ממוצעים (n = 2) שהוצגו ± SD. Significance מצוין ביחס לבקרה השלילית: * = p≤ 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

הליך זה הוקם כדי לשמש לפיתוח תרבויות חזה 3D מתקדמות במבחנה, אשר יכול לספק הערכה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית של הסיכונים genotoxic הקשורים חשיפות ננו חומריים על פני משטרי מינון חריפה או ארוכת טווח, חוזרים ונשנים.

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K Views.  Swansea University Medical School. הליך זה הוקם כדי לשמש לפיתוח תרבויות חזה 3D מתקדמות במבחנה, אשר יכול לספק הערכה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית של הסיכונים genotoxic הקשורים חשיפות ננו חומריים על פני משטרי מינון חריפה או ארוכת טווח, חוזרים ונשנים.

Video: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Cancer Research

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

מודל הפיברוזיס Dimethylnitrosamine מושרה בחולדה

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Medicine

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

צינור: יציקת שרף כפול ואחריו טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת לניתוח כבד תלת-ממדי

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can progress to fibrosis and eventually to cirrhosis, a significant risk factor for hepatocellular carcinoma. The extracellular matrix (ECM) provides structural support and maintains liver homeostasis via matricellular signals. Liver fibrosis results from an imbalance in the dynamic ECM remodeling process and is characterized by excessive accumulation of structural elements and associated changes in glycosaminoglycans. The typical fibrosis pattern of NASH is called &#34;chicken wire,&#34; which usually consists of zone 3 perisinusoidal/pericellular fibrosis, based on features observed by Masson&#39;s trichrome stain and Picrosirius Red stains. However, these traditional thin two-dimensional (2D) tissue slide-based imaging techniques cannot demonstrate the detailed three-dimensional (3D) ECM structural changes, limiting the understanding of the dynamic ECM remodeling in liver fibrosis.
The current work optimized a fast and efficient protocol to image the native ECM structure in the liver via decellularization to address the above challenges. Mice were fed either with chow or fast-food diet for 14 weeks. Decellularization was performed after in situ portal vein perfusion, and the two-photon microscopy techniques were applied to image and analyze changes in the native ECM. The 3D images of the normal and NASH livers were reconstituted and analyzed. Performing in situ perfusion decellularization and analyzing the scaffold by two-photon microscopy provided a practical and reliable platform to visualize the dynamic ECM remodeling in the liver.

The present protocol optimizes the liver in situ perfusion/decellularization and two-photon microscopy methods to establish a reliable platform to visualize the dynamics of extracellular matrix (ECM) remodeling during non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST