Name: detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לחברי המעבדה לגנומיקה של סרטן וביו-מחשב של מחלות מורכבות על תשומות התצפית החדות שלהם והשתתפותם בדיונים מרובים בשלבים שונים של פרויקט זה. התמיכה במימון כוללת את האגודה למלחמה בסרטן (מענק ICA ל-M.F-M 2017-2019) ואת מענק קמין מרשות החדשנות (עבור מ.פ.מ).

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

איסוף הדם של המטופל בצינור, משלוח ואחסון הם צעדים ראשוניים חיוניים בביופסיה נוזלית. טיפול לא נכון יכול לפגוע באיכות הפלזמה, ולכן, יכול להפריע לתוצאות הביופסיה הנוזלית47. אם דגימת דם נאספת בצינור דם EDTA, הפלזמה חייבת להיות מופרדת בתוך שעתיים של איסוף הדם, כדי למנוע תמוגה של WBCs ושח...

ההתקדמות הטכנולוגית הובילה לריצוף של מאות גנומים וסרטן ותעתיקים1. זה תרם להבנת נופים של שינויים מולקולריים על פני סוגי סרטן שונים2. מחקרים נוספים על נופים אלה סייעו לאפיין את השינויים הסומטיים הרציפים והיתוךגנים-גנים 3 המעורבים בהתקדמות סרטן או גידול, על ידי שיבוש סדרתי של מסלולי אפופטוזיס4. לכן, מוטציות סומטיות והיתוך גנים-גנים יכולים לספק מידע על גידולים על ידי לשמש סמנים ביולוגיים בחולים בודדים עבור סוג גידול מסוים5, זיהוי גידולים ראשוניים קיימים פרוגנוזה6, סיווג גידולים משניים המבוססים על שינויים מולקולריים7, וזיהוי מטרות גידול תרופתי8. מידע כזה עשוי להקל בבחירת טיפול מותאם אישית לחולי סרטן ובקביעת תגובות טיפול חיוביות ושליליות9. עם זאת, קבלת חומר הגידול לזיהוי פרופיל גנומי של רקמת הגידול הוא הליך פולשני10. יתר על כן, ביופסיה גידול מורכב רק חלק קטן של גידול הטרוגניים; ולכן, לא להיות מייצג את הפרופיל המולקולרי של הגידול כולו11. ניטור סדרתי ו genotyping הגידול דורשים אוסף חוזר ונשנה של רקמות הגידול, אשר, בדרך כלל, אינו ריאלי בשל פולשנות של הליך ביופסיה הגידול ואת בעיות הבטיחות הנובעות הליכים כאלה12.
טכניקת הביופסיה הנוזלית, לעומת זאת, צברה תשומת לב עצומה באונקולוגיה מדויקת בעשור האחרון13,14. זה בעיקר בשל אי פולשניות של טכניקה זו, ואת האפשרות של זה חוזר על עצמו בנקודות זמן מרובות, ובכך מאפשר טכניקה קלה לשימוש ניטור בטוח עבור קורסי המחלה15,16. ביופסיה נוזלית מבוססת על תופעה שתאי הגידול מתרבים במהירות, ובמקביל רבים מהם עוברים אפופטוזיס ונמק. זה מוביל לשחרור פסולת תא אפופטוטי לדם של המטופלים, יחד עם שברי ה- DNA שנחתכים בגדלים מדויקים במהלך אפופטוזיס17. האפופטוזיס של תאים לא סרטניים מוביל גם לשחרור הפסולת התאית שלו לדם, עם זאת, שיעור האפופטוזיס בתאים אלה נמוך יחסית לתאי הגידול18. הרציונל של טכניקת הביופסיה הנוזלית הוא ללכוד מולקולות הקשורות לגידולים כגון DNA, RNA, חלבונים ותאי גידול14,19 אשר מסתובבים ברציפות בדם. טכניקות שונות20 ניתן להשתמש לניתוח של מולקולות אלה כולל הדור הבא רצף (NGS), תגובת שרשרת פולימראז טיפה דיגיטלית (ddPCR), PCR בזמן אמת, ואנזים מקושר immunosorbent assay (ELISA). טכניקת ביופסיה נוזלית מאפשרת זיהוי סמנים ביולוגיים שהם מאפיינים של תאים סרטניים. מולקולות סמן ביולוגי אלה אינן משתחררות רק מחלקים מסוימים של גידול, אלא מכל חלקי הגידול21. לפיכך, סמנים שזוהו בביופסיה נוזלית מייצגים את הפרופיל המולקולרי של גידול הטרוגנטי שלם, בנוסף לגידולים אחרים בגוף, ובכך, יש יתרונות על טכניקה מבוססת ביופסיה רקמה22.
cfDNA יש זמן מחצית חיים קצר בדם במחזור הנע בין כמה דקות 1-2 שעות23. עם זאת, זמן מחצית החיים הקצר של cfDNA מקל על ניתוחים בזמן אמת על ידי הערכת תגובת הטיפול והערכות גידול דינמי. רמות cfDNA שמקורן בגידול מצביעות על פרוגנוסטיזציה של שלב הגידול / גודל העיד על ידי מספר מחקרים, אשר הראו קשר בין רמות cfDNA ותוצאות ההישרדות24. יתר על כן, מחקרים הוכיחו כי cfDNA יש יכולת חיזוי טובה יותר מאשר סמני הגידול הקיימים25. הפרוגנוסטיזציה של cfDNA בולטת עוד יותר לאחר טיפול בסרטן, רמות גבוהות יותר של cfDNA בעקבות הטיפול בקורלציה טובה עם שיעור הישרדות מופחת, ועמידות לטיפול. בעוד, רמות נמוכות יותר של cfDNA בעקבות טיפול בדרך כלל מתאים עם תגובה טיפולית חיובית. בנוסף, cfDNA מאפשר גילוי מוקדם של תגובת טיפול מאשר שיטות הגילוי המסורתיות.
CFDNA מגביר את האפשרות של גילוי מוקדם של מוטציות הקשורות לסרטן: במהלך מחלה בשלב מוקדם15, תחילת הסימפטומים26 ולפני אבחון סרטן עד 2 שנים27. כמו cfDNA משתחרר מאזורי גידול מרובים או מוקדים, הניתוח שלה מספק תצוגה מקיפה של הגנום הגידול הוא מייצג28. לכן, cfDNA מאפשר לזהות מוטציות סומטיות שאולי הוחמצו בדגימות הרקמה29. כמו הטרוגניות תוך גידול מוטציות תת שבטיות ניתן לזהות על ידי רצף עמוק של אזורים גנומיים פורש אלפי בסיסים, ומכאן הניתוח של cfDNA מאפשר לחשוף תת סוגים מולקולריים ספציפיים עם חתימות גנומיות ברורות13. כדי להשיג רמה דומה של מידע באמצעות דגימת רקמה ביופסיות מוצקות רבות היה צורך.
יתר על כן, רמות cfDNA בחולים עם מחלה מקומית כגון המעי הגס, השחלות, וסרטן הריאות לאחר טיפול כירורגי ו / או כימותרפיה, הוכיח להיות סמן פרוגנוסטי רב עוצמה עבור הישנות סרטן ותוצאות הטיפול20. יתר על כן, בחולים עם סרטן המעי הגס, השד והריאות, ניתוחים של cfDNA מהדם יכול לזהות בהצלחה את השינויים ספציפיים לגידול, מה שהוביל לחיזוי מדויק של הישנות מספר חודשים מראש13. יתר על כן, סמני עמידות לטיפול, כגון מוטציות KRAS בחולים עם CRC קבלת טיפול נגד EGFR30; VAFs עבור גנים כגון PIK3CA, MED1 או EGFR בחולים עם סרטן השד לאחר הטיפול עם טיפולים שונים31; מוטציית התנגדות EGFR T790M בחולי סרטן ריאות שטופלו TKIs ממוקד EGFR32 ניתן לזהות גם על ידי ניתוח cfDNA.
לסיכום, ניתוח cfDNA יכול לשמש לזיהוי סמנים ביולוגיים מדויקים בתחום האונקולוגיה13,33. בפרוטוקול זה, דגימות דם של 3 חולי גליומה ו 3 פקדים בריאים עובדו כדי לקבל DNA גנומי מ WBCs ו cfDNA מהפלזמה. בסרטן גליומה, מוטציות IDH, TERT, ATRX, EGFR, ו TP53 משמש אבחון, כמו גם סמנים פרוגנוסטיים שעשויים לעזור באבחון מוקדם של גידולים גליומה, סיווג סוגים שונים של גידולים גליומה, המנחה את הטיפול המדויק עבור המטופל הפרט והבנת התגובההטיפולית 34,35. מצב מוטציה של גנים אלה ניתן לזהות באמצעות cfDNA שמקורו בדם. בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט של cfDNA שמקורו בפלזמה ששימש לחקר שינויים מוטציה בסרטן גליומה12. כזה cfDNA מבוססי פרוטוקול ביופסיה נוזלית הסביר במאמר זה יכול לשמש לחקר שינויים מוטציה בסוגים רבים אחרים של סרטן. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי ביופסיה נוזלית מבוססת cfDNA יכולה לזהות 50 סוגים שונים של סרטן36.
איסוף דגימת דם, אחסון, ומשלוח הם צעדים מכריעים בפרוטוקול זה, כמו טמפרטורה בלתי מבוקרת במהלך שלבים אלה גורם תמוגה של WBCs, המוביל לשחרור של DNA גנומי מן WBC לתוך הפלזמה ולגרום לזיהום של מדגם cfDNA, אשר משפיע על שאר ההליך37. המוליזה עקב טמפרטורה בלתי מבוקרת עלולה לפגוע בתהליכי הכנת מדגם במורד הזרם של cfDNA, כגון שלבים PCR38. הסרום מכיל שיעור גבוה של נבט cfDNA ולא פלזמה, למרות שהוא מציג רעש רקע גדול עבור cfDNA הקשורים לגידול39. לכן, עבור בידוד cfDNA הקשורים לגידול, פלזמה היא מדגם מתאים39. דם נמשך צינור איסוף דם המכיל קרישה צריך להיות צנטריפוגה מיד או בתוך שעתיים, כדי להפריד את הפלזמה כדי למנוע זיהום cfDNA. בפרוטוקול זה, צינורות ייעודיים לשימור cfDNA דם שימור משמשים (ראה טבלה של חומרים), המהווים חלופה נוגדי קרישה המכילים צינורות איסוף דם. אלה צינורות איסוף דם ייעודי לשמר cfDNA ו cfRNA, ומונע תמוגה של WBCs עד 30 ימים בטמפרטורת הסביבה, ועד 8 ימים ב 37 °C (69 °F). זה מקל על שמירה על הטמפרטורה המתאימה במהלך משלוח דגימת דם ועד הפלזמה ו- WBC מופרדים40.
ישנם שלושה סוגים של מתודולוגיות מיצוי cfDNA זמין כיום: בידוד פאזה, טור ספין מבוסס סיליקון קרום, ובידוד מבוסס חרוז מגנטי41. שיטת עמודת ספין מבוססת ממברנת סיליקון הניבה כמות גבוהה של cfDNA עם שלמות גבוהה בהשוואה לשיטות חילוץ cfDNA אחרות42.
ההערכה הכמותית של ה- DNA היא דרישה בסיסית בביופסיה נוזלית, יש צורך לפתח הליך פשוט, סביר ומתוקנן ליישומם הקל ולשימוש רחב. שלוש שיטות נפוצות לכימות cfDNA הן ספקטרופוטומטריות, פלואורימטריות ו- qPCR. השיטה הפלואורימטרית מוכחת טוב יותר על פני שיטות אחרות לגבי הדיוק, העלות וקלות ההולכה43.
השלמות והטוהר של cfDNA ניתן להעריך על ידי אלקטרופורזה agarose או אלקטרופורזה נימי. אלקטרופורזה אגרוז לא מראה רגישות בריכוז נמוך של cfDNA וגם אין רזולוציה גבוהה כדי להראות גודל שבר מדויק של cfDNA. מצד שני, אלקטרופורזה נימי יש יתרון על אלקטרופורזה agarose על ידי התגברות על האתגרים הקשורים, ולכן, בשימוש נרחב על ידי החוקרים לניתוח גודל שבר cfDNA. בפרוטוקול זה, התפלגות גודל הקטע של cfDNA מבודד הוערך באמצעות מכשיר אלקטרופורזה נימי אוטומטי (ראה טבלה של חומרים).

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>G2939BA</td><td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td></tr><tr><td>Adjustable Clip for Priming Station</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5042-1398</td><td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5067-4626</td><td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td></tr><tr><td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td><td>Norgen Biotek Corp.</td><td>63950</td><td>Norgen&#039;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td></tr><tr><td>Chip Priming Station</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-4401</td><td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&amp;mdash; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td></tr><tr><td>Electrode Cleaner Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-9951</td><td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td></tr><tr><td>Filters for Gel Matrix</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>185-5990</td><td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td></tr><tr><td>IKA Basic Chip Vortex</td><td>IKA-Werke GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>MS-3-S36</td><td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue kit</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells&lt;br/&gt; (e.g., bacteria), and many other sources.</td></tr><tr><td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td></tr><tr><td>QIAvac Connecting System</td><td>Qiagen</td><td>19419</td><td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Qubit assay tubes are 500 &amp;micro;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&amp;micro;L to 100 ng/&amp;micro;L.</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Qiagen</td><td>84010</td><td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crushed ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (96&amp;ndash;100%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating block or similar at 56 &amp;deg;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (100%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (adjustable)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

זיהוי מוטציות בגידולים של חולי סרטן הוא צעד חשוב מאוד בניהול מחלות. מוטציות אלה משמשות סמנים ביולוגיים לאבחון הגידול, כמו גם לבחירת הטיפול ותגובתו בחולי סרטן. השיטה הנוכחית של תקן הזהב לגילוי מוטציות בגידול כרוכה בבדיקה גנטית של דנ"א גידולי באמצעות ביופסיות גידול. עם זאת, שיטה פולשנית זו קשה להתבצע שוב ושוב כבדיקת מעקב של רפרטואר מוטציה הגידול. ביופסיה נוזלית היא טכניקה חדשה ומתפתחת לגילוי מוטציות בגידולים כגישה ביופסיה קלה לשימוש ולא פולשנית.
תאים סרטניים מתרבים במהירות. במקביל, תאים סרטניים רבים עוברים אפופטוזיס. פסולת מתאים אלה משתחררים לתוך מערכת הדם של המטופל, יחד עם חתיכות DNA מקוטע דק, הנקרא DNA ללא תאים (cfDNA) שברים, אשר נושאים מוטציות DNA הגידול. לכן, לזיהוי סמנים ביולוגיים מבוססי cfDNA באמצעות טכניקת ביופסיה נוזלית, דגימות דם נאספות מחולי הסרטן, ואחריו הפרדת פלזמה ומעיל באפי. לאחר מכן, פלזמה מעובדת לבידוד של cfDNA, ואת מעיל באפי בהתאמה מעובד לבידוד של ה-DNA הגנומי של המטופל. שתי דגימות חומצת גרעין נבדקות לאחר מכן עבור כמות ואיכותן; ונותחו עבור מוטציות באמצעות טכניקות רצף הדור הבא (NGS).
בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביופסיה נוזלית, כולל איסוף דם, פלזמה והפרדת מעיל באפי, הפקת דנ"א cfDNA ונבט, כימות של CFDNA או DNA נבט, וניתוח העשרת שבר cfDNA.

הפרדת פלזמה 8.5-9 דם מ"ל שנאסף cfDNA או cfRNA צינורות משמרים מניב סביב ~ 4 פלזמה מ"ל בנפח. נפח הפלזמה המופרדת מדם שנאסף בצינורות EDTA עשוי להשתנות בהתאם לטמפרטורה. חשיפה של צינורות EDTA המכילים דם בטמפרטורה גבוהה מ 37 מעלות צלזיוס מוביל לירידה בתפוקת נפחהפלזמה 44.
<str...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקת ביופסיה נוזלית לא פולשנית, כולל איסוף דם, פלזמה והפרדת מעיל באפי, cfDNA ומיצוי DNA נבט, כימות של CFDNA או DNA נבט, וניתוח העשרת שבר cfDNA.

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

detection-of-cell-free-dna-in-blood-plasma-samples-of-cancer-patients

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.9K Views.  Bar-Ilan University. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקת ביופסיה נוזלית לא פולשנית, כולל איסוף דם, פלזמה והפרדת מעיל באפי, cfDNA ומיצוי DNA נבט, כימות של CFDNA או DNA נבט, וניתוח העשרת שבר cfDNA.

Video: Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

באמצעות 22C 3 נוגדן Anti-PD-L1 להתרכז ביופסיה ודוגמאות ציטולוגיה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

פרוטוקול קדם-אנליטי של ביופסיה נוזלית סטנדרטית ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, and nucleic acids originating from normal tissues, but some of these substances also originate from the diseased area. The investigation and analysis of these substances in the body fluids play a pivotal role in the diagnosis of various diseases. Therefore, it is important to accurately separate the required substances, and several techniques are developed to be used for this purpose.
We have developed a lab-on-a-disc type of device and platform named CD-PRIME. This device is automated and has good results for sample contamination and sample stability. Moreover, it has advantages of a good acquisition yield, a short operation time, and high reproducibility. In addition, depending on the type of disc to be mounted, plasma containing cell-free DNA, circulating tumor cells, peripheral blood mononuclear cells, or buffy coats can be separated. Thus, the acquisition of a variety of materials present in the body fluids can be done for a variety of downstream applications, including the study of omics.

This paper describes the application of automated equipment to easily and efficiently separate and collect substances, such as cell-free DNA and circulating tumor cells, from whole blood.

הפרדה ואיסוף אוטומטיים של חומרים הקשורים לסרטן מדגימות קליניות

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Isolation of Circulating Cell-free DNA (cfDNA): A Silica-based Membrane Procedure to Extract cfDNA from Blood Plasma of Cancer Patients

Source: Palande, V. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61449" target="_blank">Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a silica-based membrane procedure to isolate circulating cell-free DNA or cfDNA from human plasma sample. The cfDNA is a promising biomarker for cancer diagnosis and assessment.&#160;

בידוד DNA ללא תאים במחזור הדם (cfDNA): הליך קרום מבוסס סיליקה לחילוץ cfDNA מפלזמת הדם של חולי סרטן

Source: Palande, V. et al. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a silica-based ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancers of the Nervous System

In vitro studies

Automated Capillary Electrophoresis Based Fragment Size Distribution Analysis of cfDNA: A DNA Microchip-based Method to Study Size Distribution of DNA Fragments Isolated from Biofluids

Source: Palande, V. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61449" target="_blank">Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients.</a> J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we analyze the size distribution of cell-free DNA or cfDNA fragments using automated capillary electrophoresis. This technique helps gain insights into the profile of DNA fragments released by cancer cells during apoptosis.

ניתוח התפלגות גודל מקטע אוטומטי מבוסס אלקטרופורזה נימית של CFDNA: שיטה מבוססת שבב DNA לחקר התפלגות גודל של מקטעי DNA שבודדו מנוזלים ביולוגיים

Source: Palande, V. et al. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we analyze the size ...

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST