איי.ג'יי.C, J.A.T ו-I.L. מכירים במימון מהנציבות האירופית באמצעות פרויקט Horizon 2020 ACEnano (גרנט לא. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z מכיר במימון הדוקטורט ממועצת המלגות של סין (CSC, מס ' 201507060011). R.R מכיר בתמיכה הכספית של תוכנית המענקים Vidi של הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO Vidi 723.0160330).

השימוש בביופלואיד אנושי אושר בהתאם להנחיות פרוטוקול IRB מאוניברסיטת ליידן והאוניברסיטה הרפואית של אינסברוק. כאשר נבדקים ביופלואידים אנושיים או בעלי חיים, נדרש אישור אתי ממכון המחקר, והושגו במקרה של התוצאות המוצגות בפרוטוקול זה. יתר על כן, יש לבצע דיווח הולם גם כדי להבטיח שקיפות וביצוע שימוש חוזר של נתונים בעבודה עתידית9,29,30.
1. הכנת אלקטרוליטים ברקע (BGE)
הערה: כל הממיסים צריכים להיות מוכנים במכסה אדים מתאים וציוד מגן אישי הולם חייב לשמש לכל השלבים (מעיל, כפפות ומשקפי מגן). בכל שלב, בקבוקוני פלסטיק מחייבים נמוכים נדרשים כדי למזער אובדן ניתוח וזיהום של מדגם עם מלחים שטיפה מכלי זכוכית.
<ol><li>הכן 10% חומצה אצטית BGE (v/v), pH 2.2 על בסיס יומי עבור מטבולומיקה.<ol>
<li>לתוך בקבוקון נפחי 10 מ"ל להוסיף 1 מ"ל של חומצה אצטית, ואחריו תוספת של מים deionized (DI) לקו המסומן ערבוב יסודי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 100 mM חומצה אצטית, pH 2.9 על בסיס יומי עבור proteomics.<ol>
<li>לתוך בקבוקון נפחי 10 מ"ל להוסיף 57 μL של חומצה אצטית, ואחריו תוספת של מי DI לקו המסומן ערבוב יסודי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת ננומטרי
<ol><li>פזרו במרץ את ה- NMs במים באמצעות הנחיות שפורסמו31,32,33. הערה: בפיתוח פרוטוקול זה, 7 NMs שימשו כדלקמן: 100 ו 1,000 ננומטר carboxylated פוליסטירן שימשו חלבון וקורונה מטבולית, בהתאמה. 100 ננומטר NMs פוליסטירן לא שינוי, 13 ננומטר anatase TiO2 NMs אשר היו לא מודרניים או מצופים עם פוליאקרילט או PVP פולימרים ו 22 ננומטר SiO2 NMs לא שינוי שימשו הן חלבון מטבוליט קורונה. בעוד שהשיטה פותחה והודגמה באמצעות NMs אלה, יש לציין כי גישה זו תהיה ישימה עבור מגוון רחב של קומפוזיציות NM, גדלים, צורות, ומורפולוגיות.</li>
	<li>לאפיין את גודל החלקיקים באמצעות אור דינמי פיזור34,35, חלקיק יחיד אינדוקטיבית ספקטרומטר מסהפלזמה 36, ניתוח מעקב חלקיקים37, או מיקרוסקופיה אלקטרונים שידור ומטען פני השטח כפוטנציאל זטה באמצעות זטה sizer34.</li>
</ol>3. היווצרות קורונה ביומולקולרית
<ol><li>לפצל 2 מ"ל של פלזמה אנושית (או biofluid של בחירה) לתוך 1 mL aliquots, אחד עבור מטבוליט וחלבון קורונה והשני עבור אפיון מטבולום פלזמה.</li>
	<li>דגירה 1 מ"ג /מ"ל של NMs בפלזמה האנושית עבור 1 שעות ב 37 °C (500 סל"ד) בתרמומיקסר. לאחר צנטריפוגה דגירה המדגם ב 4,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (55 °F) כדי pellet את NMs.</li>
	<li>לאסוף את supernatant הפלזמה לניתוח קורונה מטבוליט. שמרו על קומפלקס הקורונה NM-חלבון לאפיון קורונה חלבונים.</li>
</ol>4. בידוד חלבון קורונה
<ol><li>resuspend קומפלקס חלבון NM (הכדור) ב 1 מ"ל של 10x PBS Buffer ומערבולת במרץ במשך 2 דקות כדי להסיר חלבונים לא מאוגדים. צנטריפוגה פתרון PBS ב 4,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (4 °F) כדי pellet את NMs, ולהסיר בזהירות את supernatant מבלי להפריע לכדור.</li>
	<li>resuspend הכדור ב 1 מ"ל של אמוניום ביקרבונט חוצץ (ABC) (100 mM, pH 8.0) ומערבולת במרץ במשך 2 דקות כדי להסיר חלבונים לא מאוגדים ומלחים לא רצויים. צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (55 °F) כדי כדורי NMs; להסיר ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה.</li>
	<li>להפחית את קשרי דיסולפיד חלבון על ידי המסת גלולה חלבון NM ב 20 μL של חוצץ ABC (100 mM pH 8) המכיל 10 mM dithiotheritol. לדגור על פתרון ההפחתה במשך 30 דקות ב 56 °C (56 °F).</li>
	<li>כדי לעכל חלבונים, להוסיף 2 מיקרוגרם של טריפסין כיתה רצף ל 20 μL של ABC המכיל 0.1% פעילי שטח. לדגור על פתרון העיכול עבור 16 שעות ב 37 °C (7 °F).</li>
	<li>Alkylate המדגם על ידי תוספת של 20 μL של iodoacetamide ב 55 mM ב 100 mM ABC ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>הוסף 20 μL של 0.1 M HCl כדי לבקע את פעילי השטח ולהשאיר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>העשרה ויתד פפטידים באמצעות טיפ פיפטת התפלה C18 ארוז.<ol>
<li>רטוב את הקצה עם 80 μL 0.1% חומצה פורמית 50% acetonitrile 5 פעמים, נקי עם 80 μL 0.1% חומצה פורמית 5 פעמים, לצייר ולחמוק מדגם 10 פעמים, דגימת התפלה על ידי שטיפה 80 μL 0.1 % חומצה פורמית 5 פעמים ולחמוק המדגם 2 פעמים עם 80 μL 0.1% חומצה פורמית 70% acetonitrile לתוך צינור PCR מחייב נמוך ונקי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליופיליזציה הדגימות ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד ניתוח.</li>
</ol>5. בידוד מטבוליט קורונה
<ol><li>קח את פלזמת הבקרה ואת supernatant מדגרת הפלזמה NM מ שלב 3.3 ולשמור על קרח במהלך הכנת מדגם.</li>
	<li>קח 50 μL מכל בקבוקונים נפרדים לדלל 1 מתוך 10 עם מים DI. קח 50 μL של כל מדגם מדולל ולעבור בקבוקונים חדשים לשלב 5.3.</li>
	<li>הוסף 200 כלורופורם μL, 250 μL מתנול ו 350 μL DI מים תערובת מערבולת נמרצת במשך 2 דקות. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 20,800 x גרם ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>קח 500 μL של supernatant ולסנן דרך מסנן צנטריפוגלי 3 kDa עבור 2 שעות ב 10,000 x g ב 4 °C (70 °F). יש ליטול 430 מיקרו-אל של אולטרה-סינון ויבש בניקוי מהיר. כעת ניתן להקפיא דגימות לפני הניתוח.</li>
</ol>6. הכנת מערכת CESI-MS38
הערה: לפני ההתקנה של נימים, לבדוק כי הכניסה ואת קצה המוצא של הנימים הם ללא פגע וכי אין שברים גלויים בניני.
<ol><li>התקנת נימי מצופה נייטרלי לניתוח קורונה חלבון39.<ol>
<li>יש להניח נימי מצופה נייטרלי חדש (אורך 90 ס"מ בקוטר פנימי של 30 מיקרומטר) במכשיר CESI בהתאם להנחיות היצרן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת נימי CESI לניתוח פרוטאומי.<ol>
<li>לשטוף את נימי ההפרדה בכיוון הקדמי באמצעות 100 mM של HCl במשך 5 דקות ב 100 פסאיי ולבדוק היווצרות טיפה בשקע של נימי. לשטוף נימי הפרדה עם BGE ב 100 פסאיי במשך 10 דקות ולאחר מכן מים DI ב 100 פסאיי במשך 30 דקות (זה נדרש רק עבור נימים חדשים).</li>
		<li>לשטוף הן את נימי ההפרדה ואת נימי מוליך עם BGE ב 90 פסאיי במשך 5 דקות ולהבטיח טיפות טופס בקצה השקע של שני נימים.</li>
		<li>לשטוף את נימי ההפרדה עם מים DI ב 90 psi במשך 10 דקות, ואז 50 psi במשך 10 דקות עם 0.1 M HCl, ואחריו שוב 90 psi במשך 10 דקות עם מים DI ולבסוף BGE ב 90 psi במשך 10 דקות. זוג CESI ל- MS באמצעות מקור ננו-ספריי ומתאם כפי שתואר בעבר38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התקנת נימי סיליקה מותכים חשופים לאפיון קורונה מטבולית38.<ol>
<li>מניח נימי סיליקה מותכים חשופים חדשים (אורך 90 ס"מ בקוטר פנימי של 30 מיקרומטר) למכשיר CESI בהתאם להנחיות היצרן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת נימי CESI לניתוח מטבולומיה.<ol>
<li>לשטוף את נימי ההפרדה בכיוון הקדמי באמצעות 100% MeOH ב 50 psi במשך 15 דקות ולבדוק היווצרות טיפה בשקע של נימי. לשטוף הן את נימי ההפרדה ואת נימי מוליך עם BGE ב 90 פסאיי במשך 5 דקות ולהבטיח טיפות טופס בשקע של שני נימים.</li>
		<li>לשטוף את נימי ההפרדה עם מים DI ב 90 psi במשך 10 דקות, ואז 50 פסאיי במשך 10 דקות עם 0.1 M NaOH, ואחריו שוב 90 psi במשך 10 דקות עם מים DI ולבסוף BGE ב 90 psi במשך 10 דקות. זוג CESI ל- ESI-MS באמצעות מקור ננו-ספריי ומתאם כפי שתואר בעבר. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS לניתוח קורונה חלבונים
<ol><li>דגימות resuspend בשלב 4.8 ב 20 μL של 50 mM אמוניום אצטט pH 4.0.</li>
	<li>בצע 5 psi 10 s הזרקה הידרודינמית של מדגם. נפרד באמצעות מתח הפרדה של 30 kV עם שיפוע הלחץ הבא: 0-10 דקות ב 1 psi, 10-35 דקות ב 1.5 psi ו 35-45 דקות ב 5 psi באמצעות 100 mM, pH 2.9 חומצה אצטית כמו BGE.</li>
	<li>לאסוף ספקטרום מסה בין 250-2000 m/z עם 10 העליון נתונים תלוי פיצול רכישה.</li>
	<li>בין הדגימות, לשטוף נימי עם 0.1 M HCl במשך 3 דקות ב 100 פסאיי ו 10 דקות 100 פסאיי של BGE עבור נימי הפרדה במשך 3 דקות ב 100 פסאיי עבור נימי נוזל מוליך.</li>
</ol>8. CESI-MS לניתוח קורונה מטבולית
הערה: יש לנתח את כל הדגימות פעמיים, פעם אחת במצב חיובי לזיהוי נקודות ופעם במצב שלילי לאיתור אניונים. דגימות פלזמת הבקרה צריך להיות מנותח לפחות 5 פעמים.
<ol><li>Resuspend NM חשוף ודגימות פלזמה שלא נחשפו מ שלב 5.4 ב 430 μL של מים DI מערבולת נמרצת במשך 2 דקות. סנן דרך מסנן ממברנה 0.1 מיקרומטר.</li>
	<li>קח 95 μL של סינון ולהוסיף 5 μL של סטנדרטים פנימיים ב 200 μM עבור cations (L-מת'ionine גופרתי) ו 400 מיקרומטר עבור אניונים (2,2,4,4-D4-חומצת לימון) ומערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 4,000 x g ב 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות לפני ניתוח CESI-MS.</li>
	<li>הזריקו דגימה הידרודינמית עבור 30 s (cations) ו 40 s (אניונים) ב 2 פסאיי.</li>
	<li>מטבוליטים נפרדים בחומצה אצטית של 10% עם מתח הפרדה של 30 kV במצב קדימה (cations) ומצב הפוך (אניונים). מצב הפרדה הפוכה נעזר בלחץ קדימה של פסאיי 0.5 psi על נימי ההפרדה.</li>
	<li>הגדר ספקטרומטר מסה כדי לאסוף נתונים במצב חיובי (cations) או שלילי (אניונים) מעל טווח המסה 65-1000 m/z. בין הדגימות, לשטוף נימי עם 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH, DI מים ו BGE ב 50 psi במשך 2 דקות.</li>
</ol>

J.A.T הוא עובד של AB Sciex בריטניה בע"מ אשר משתתפים כשותף בתעשייה בפרויקט ACEnano, J.A.T וכל המחברים האחרים אין ניגוד אינטרסים בעבודה זו.

זוהי השיטה הראשונה המוצעת לאפיין את הקורונה הביומולקולרית המלאה המשלבת חלבונים ומטבוליטים, מאותה מדגם, באמצעות CESI-MS. היכולת לאפיין הן את החלבונים והן את המטבוליטים מאותה דגימה תגדיל באופן משמעותי את כמות הנתונים שנאספו מחשיפה ניסיונית אחת, ותאפשר תובנות חדשות על תהליך היווצרות הקורונה והשפעותיו על רעילות ויעילות NMs כננו-רפואה. יתר על כן, CESI-MS היא פלטפורמה אידיאלית לאפיון שני המעמדות של biomolecules עם רק שינוי של נימים נדרש. במבט קדימה, שיטות חדשות שפותחו עבור CE לא מימי יאפשרו ליפידומיקה להתבצע באמצעות CE-MS40 ולכן ניתן כעת לנתח חלבונים, מטבוליטים ושומנים באמצעות פלטפורמה אחת. הגישות הקונבנציונליות הנוכחיות ידרשו שתי פלטפורמות LC-MS ייעודיות, אחת לחלבון קורונה ואחת לקורונה המטבולית. לפיכך, גישה זו יכולה לאסוף כמות כפולה של נתונים באמצעות פלטפורמה אנליטית אחת.
יש כמה אזהרות לגישה זו במיוחד עם הקורונה המטבולית כמו פרוטוקול זה מציע מדידה עקיפה של הקורונה. ככזה, עלולה להתעורר בעיה כאשר רמות חילוף החומרים נמצאות בריכוזים גבוהים ביחס ל- NMs והירידה הבאה בריכוז המטבוליט במטריצה קטנה. עם זאת, בניגוד לקורונה החלבון, לא סביר כי גישה "גודל אחד מתאים לכולם" לבידוד קורונה מטבולית תפותח בשל כל NM שיש כימיה משטח ייחודית. בהמשך סביר יותר כי גישות ספציפיות של NM לבודד את הקורונה המטבולית יפותחו ויאומתו עם זאת; זה יהיה תקף רק על NM ספציפי זה. למרות זאת, CESI-MS עדיין יהיה פלטפורמה מתאימה מאוד לאפיון של מטבוליטים טעונים בקטבים ללא קשר לאופן שבו הם מבודדים. כמו כן ראוי לציין כי אם גלולה לא נוצרת במהלך שלבי הצנטריפוגה שנועדו גלולה NMs, כוח צנטריפוגלי גבוה יותר עשוי להידרש; סביר להניח שזה יקרה עם NMs פחות צפוף. זה גם קריטי כי כל שלבי הסינון הם דבקים בתוך הפרוטוקול בשל משעמם צר של נימים אלה יכולים בקלות להיות חסום אם כל חומר חלקיקי לא בוטל כראוי מן המדגם.
בעוד הקורונה החלבון כבר תחום אינטנסיבי של מחקר במשך מספר שנים היכולת לשלב את זה עם קורונה מטבולית הוא תחום עניין חדש עבור מדענים החוקרים את ממשק ביו-ננו6,14. עד כה, רוב המחקרים האלה התמקדו בשבר הלא קוטבי, השומנים שלקורונהמטבולית 9,28. שיטה זו מאפשרת אפיון של מטבוליטים קוטביים וטעונים מאוד בקורונה הכוללים מטבוליטים חשובים המעורבים בחילוף חומרים אנרגטי, גליקוליזה וסינתזת DNA. כתוצאה מכך, בשילוב עם זרימת העבודה של הפרוטאומיקס, ניתן אפיון הוליסטי יותר של הקורונה הביומולקולרית. זה מאפשר ניתוח מעמיק יותר של אינטראקציות ביו-ננו לנוע קדימה. שיטה זו מאפשרת תובנות מכאניסטיות משופרות על אנדוציטוזיס בתיווך קולטן באמצעות אינטראקציות חלבון ומטבוליט עם קולטני ממברנה. יתר על כן, ניתן לחקור אינטראקציות בין-אינטר ואינטרה קורונה בין חלבונים למולקולות קטנות; לדוגמה, לאחרונה הוכח כי החלבונים בקורונה ממלאים תפקיד מרכזי בגיוס מטבוליטים15. ראוי לציין כי התוצאות הייצוגיות באיור 3 ובאיור 4 הן כימות מוחלט של מטבוליטים, עם זאת, גישה לא טרוגה המשתמשת בניתוח נתונים רב-משתני כדי להשוות את כל תכונות CE-MS בפקדים בהשוואה לפלסמה חשופה תבהיר גם כריכת מטבוליט. לכן, יש היקף משמעותי לחקור כיצד, ואשר, מטבוליטים וחלבונים להשפיע על הגיוס שלהם לתוך קורונה NM. מחקרים נוספים אלה עשויים לסייע בתכנון קורונה כדי לייעל את המסירה של ננו-רפואה או לחשוף משוכות נוספות להתפתחותם כגון דיכוי פעילות התרופות בגלל חסימת קורונה ביומולקולרית או מיסוך פונקציות מיקוד.
CESI-MS עם קצבי זרימה בקנה מידה ננו של סביב 20 nL / min ושימוש מינימלי של ממיסים אורגניים מציע שיפור אישורים ירוקים וכלכליים על פני LC-MS סטנדרטי nanoLC-MS במונחים של שימוש ממס, האתגרים העיקריים עבור מטבולומיקה ומחקרי פרוטאומיקה, בהתאמה. CESI-MS מציע תוצאות ניתנות לשחזור גבוה הן עבור זמן ההעברה והן עבור אזור השיא, אשר משווים לטובה עם שיטות מבוססות LC-MS11,15. יתר על כן, בהשוואה nanoLC-MS, לשאת מעל אינו בעיה CESI-MS. לכן, ניקוי מערכת נרחב בין ניתוחי מדגם אינו נדרש, אשר משפר מאוד את תפוקת המדגם11.
לסיכום, זרימת העבודה המוצעת היא הראשונה לפרט גישה לאפיון מרכיבי החלבון והמטבוליט של הקורונה הביומולקולרית המלאה של NMs. זה פותח היבט חדש של אינטראקציות ביו-ננו, קורונה מטבולית, ובכך מאפשר איסוף של פי שניים נתונים מאותה מדגם, ומאפשר הבנה מלאה יותר של אינטראקציות בממשק הביו-ננו.

אינטראקציות ביו-ננו, בממשק בין משטחים ננו-חומריים (NM) לבין מטריצות ביולוגיות שמהן ביומולקולס ספיחה ל- NM, הוא תחום מחקר אינטנסיבי העומד בבסיס ננו-בטיחותוננו-רפואה 1. שכבה זו של ביומולקולים מסוחפים מעניקה זהות ביולוגית ל- NMs, ובכך תאים מזהים אותם כ"עצמיים ", ובהמשך משפיעים על ספיגת תאים, הפצה ונקודות קצה ביולוגיות2,3,4. הרוב המכריע של מחקרי ביו-ננו התמקדו בחלבונים בתוך הקורונה, והוכיחו כי חלבונים משתנים כמותית ואיכותית בין NMs של קומפוזיציות שונות5. וריאציה זו תלויה הן במאפיינים של NM כגון גודל, פונקציונליזציה, וחומר בנוסף למאפיינים של המטריצה הביולוגית כולל הרכב ותכולת מלח5. תחום עולה של עניין בממשק ביו-ננו הם המטבוליטים כי ספיח ל- NMs6. מספר מחקרים הראו כי, כמו עם החלבונים, תכונות NM הם גורם מפתח בקביעת הרכב המטבוליטים בקורונה וכי הם יכולים להשפיע על התוצאות הביולוגיות שלחשיפהNM 6,7,8.
במחקרים על הקורונה הביומולקולרית ישנם ארבעה שלבים נפרדים לאפיון שלה, היווצרות קורונה, בידוד הביומולקולות בתוך הקורונה, איתורם באמצעות ספקטרומטריית מסה איכותית או כמותית וזיהוי9. עד כה אומצו מגוון טכניקות לבידוד החלבון קורונה, כולל רתיחה במאגר הריצה SDS-PAGE, עקירות ממס ומלח או עיכול ישיר של חלבונים במקום על פני השטח של NMs. מבחינת המטבוליטים בקורונה, הבידוד מורכב יותר בשיטות שונות באמצעות ממיסים או אפילו פירוק של NMs המוצעים כפתרונות8,10,11. עם זאת, בניגוד לקורונה חלבון גישה "גודל אחד מתאים לכולם" לא סביר להחיל על בידוד של מטבוליטים מ- NMs, בשל המרחב הכימי הרחב הכבוש על ידי חילוף החומרים ואת המגוון של NMs אפשריים. גישה חלופית היא לאפיין את המטריצה הביולוגית לפני ואחרי חשיפה ל- NM עם ההבדל בריכוזים מטבוליטים המיוחסים לספיגת מטבוליטים ל- NMs.12
גישה חלופית זו תחול על כל הביופלואידים וה- NMs ולמרות שהיא דורשת ניתוח כפול, היא מציעה מידה מדויקת הרבה יותר של קורונה מטבולית ואין לה סיכון להתאוששות מטבולית נמוכה מפני השטח של NM בטעות כריכה נמוכה של המטבוליט הספציפי.
השלב השני בניתוח הקורונה הביומולקולרי הוא גילוי הביומולקולות. באופן מסורתי עבור החלבונים בקורונה, זה היה ההעברה של ננו-LC-MS, סוס העבודה של פרוטאומיקה; גישות אחרות כגון NMR13, 1D ו- 2D SDS-PAGE הוחלו גם כן. במונחים של קורונה מטבוליט LC-MS7,GC-MS8 וספקטרומטריית מסת עירוי ישיר נוצלו14. עם זאת, גישה חדשה החלה לאחרונה לצבור תאוצה, כלומר ספקטרומטריה אלקטרופורזה-מסה נימית (CE-MS)11,15 ונוכח במעבדות NM כדכניקה עצמאית לאפיון תכונות פיזיות וכימיות שונות של NMs16. CE-MS היא טכניקת הפרדה אורתוגונלית לננו-אל-אם-אס ו-GC-MS ומסוגלת לאפשר זיהוי של מטבוליטים קוטביים וטעוניםמאוד 17,18. יתר על כן, CE-MS מתאים היטב לניתוח חלבונים ושינויים שלאחר דרכם כגון זרחן וגליקוסילציה19,20,21,22. השלב הסופי, זיהוי וניתוח נתונים יכול להתבצע במספר דרכים תלוי אם גישה כמותית / איכותית או ממוקדת / לא מיועדת משמשת, עם זאת, זה, נופל מחוץ למסר של פרוטוקול זה.
CESI-MS, שילוב של CE וממשק nanoESI, הוא התקדמות אחרונה בטכנולוגיית CE המשתמשת בממשק ללא נדן. זה מאפשר חיבור ישיר של CE זרימה נמוכה במיוחד (<20 nL / min) ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה ללא דילול, וכתוצאה מכך רגישות זיהוי משופרת באופן משמעותי23,24,25. CESI-MS מאפשר ניתוח דגימות מוגבלות בנפח (< 10 μL) תוך שמירה על ניתוח רגיש ביותר26. CESI-MS גם משווה לטובה לגישות ננו-ל-MS מסורתיות של קצב זרימה נמוכה המשמשות בפרוטומיקה ובמטבולומיה במונחים של רבייה27,28, תפוקה, וממשיכים הלאה מה שהופך אותו לסיכוי מרגש לאפיון קורונה ביומולקולרי מלא.
כדי להדגיש את הפוטנציאל של CESI-MS עבור ניתוחים של אינטראקציות ביו-ננו עבודה זו מתארת את הכנת המדגם הנדרש כדי לבודד את קורונה biomolecular NM מדגימת פלזמה אנושית אחת באופן כזה כדי למקסם נתונים הן החלבון והן מטבוליט היבט של קורונה NM ביומולקולרית מלאה. בעוד אנו מדווחים על השימוש בפלזמה אנושית, פרוטוקול זה יהיה מתאים באותה מידה עבור biofluids אחרים כגון סרום דם, מדיום תרבית תאים מלאה, ליסאט התא, נוזל השדרתי או שתן. הניתוחים של שני רכיבים אלה (חלבונים ומטבוליטים) יתוארו לאחר מכן באמצעות נימי CESI מצופים ניטרליים לקורונה החלבון ונימי סיליקה מותכים חשופים הן למטבוליטים קטיוניים והן מטבוליטים אניוניים.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

הספיגה של ביומולקולים ממטריזות ביולוגיות סביב אל פני השטח של ננו-חומרים (NMs) כדי ליצור את הקורונה הייתה מעניינת בעשור האחרון. העניין בממשק הביו-ננו נובע מהעובדה שהקורונה הביומולקולרית מעניקה זהות ביולוגית ל-NMs ובכך גורמת לגוף לזהות אותם כ"עצמיים". לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי החלבונים בקורונה מסוגלים לקיים אינטראקציה עם קולטני ממברנה כדי להשפיע על ספיגת התאים וקבעו כי הקורונה אחראית לסחר תאי של NMs והרעילות שלהם בסופו של דבר. עד כה, רוב המחקרים התמקדו בחלבון הקורונה והתעלמו מההשפעות האפשריות של המטבוליטים הכלולים בקורונה או מההשפעות הסינרגיסטיות בין מרכיבים בקורונה הביומולקולרית המלאה. ככזה, עבודה זו מדגימה מתודולוגיות המאפיינות הן את רכיבי החלבון והן את מרכיבי המטבוליט של הקורונה הביומולקולרית באמצעות פרוטאומיקים מלמטה למעלה וגישות מטבולומיות במקביל. זה כולל תקציר על חלקיקים של קורונה חלבון עם פעילי שטח המשמש להגברת התאוששות חלבון, ואפיון פסיבי של קורונה מטבולית על ידי ניתוח מטריצות מטבוליט לפני ואחרי חשיפות NM. עבודה זו מציגה אלקטרופורזה נימית – ספקטרומטריית מסה (CESI-MS) כדכניקה חדשה לאפיון קורונה NM. הפרוטוקולים המתוארים כאן מדגימים כיצד CESI-MS יכול לשמש לאפיון אמין של החלבון והקורונה המטבולית שנרכשו על ידי NMs. המעבר CESI-MS מקטין מאוד את נפח המדגם הנדרש (בהשוואה לכרומטוגרפיה נוזלית מסורתית – ספקטרומטריית מסה (LC-MS) גישות) עם זריקות מרובות אפשריות מ 5 μL קטן של מדגם, מה שהופך אותו אידיאלי עבור דגימות מוגבל נפח. יתר על כן, ההשלכות הסביבתיות של ניתוח מופחתות ביחס LC-MS בשל שיעורי זרימה נמוכים (<20 nL / min) ב CESI-MS, ואת השימוש אלקטרוליטים מימית אשר מבטל את הצורך בממסים אורגניים.

השיטה המתוארת היא הראשונה לאפיין הן את החלבונים והן את המטבוליטים בקורונה הביומולקולרית של NM באמצעות אותה דגימת פלזמה אנושית. שיטה זו מסוגלת לזהות >200 חלבונים ומטבוליטים >150, ובכך לאפשר את הסקירה המקיפה ביותר של הקורונה הביומולקולרית המלאה, המאפשרת הבנה משופרת של חיבור תאי NMs, ספיגה והשפעות.
השימוש ב- CESI-MS הן עבור פרוטאומיה(איור 1)והן עבור מטבולומיה(איור 2)הפרדה וזיהוי מראה חלונות הפרדה טובים בשני הנימים עבור כל גישה.
שיטה זו מסוגלת להבחין בין החלבונים בקורונה על פני מגוון רחב של הרכבי NMs, ובכך להדגים את תחולת השיטות על NMs על פני מגוון רחב של מאפיינים פיזיים וכימיים (טבלה 1).
ניתן להבחין בין טביעות האצבע הייחודיות של הקורונה המטבולית גם באמצעות הענף המטבולי של מתודולוגיה זו (איור 3). למרות שגישה זו מנצלת גישה פסיבית כדי לאפיין את הקורונה המטבולית של NM, היא עדיין מסוגלת לחשוף תובנות מעניינות על תפקידם של מטבוליטים בקורונה הביומולקולרית כמו ספיח דיפרנציאלי של איזומרים (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> איור 1: אלקטרופרוגרמה מופתית של הפרדת קורונה של חלבון SiO2 באמצעות CESI-MS בעקבות תקציר על חלקיקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> איור 2: דוגמה לאלקטרופרוגמות יונים שחולצו התקבלו מתרכובות אנדוגניות בפלזמה על ידי CE-MS. התרכובות ממוספרות הן כדלקמן: 1. אורניתין; 2. ליסין; 3. ארגינין; 4. היסטידין; 5. קריאטין; 6. גליצין; 7. אלנין; 8. ואלין; 9. איזולאוצין; 10. לאוצין; 11. סרין; 12. ת'ריונין; 13. אספרגין; 14. מת'ינין; 15. גלוטמין; 16. חומצה גלוטמית; 17. פניל-D5-אלנין; 18. פנילאלנין; 19. טירוסין; 20. פרולין; 21. מת'יונין סולפון (תקן פנימי). פורסם תחת גישה פתוחה Creative Commons CC BY רישיון ושכפל מ Zhang ואח17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: ניתוח של חלבון קורונה על פני מערך של 6 NMs. מפת חום של מחלקות חלבון שזוהו על סיליקה (SiO2),טיטניה (TiO2),טיטניה כתרים PVP (TiO2-PVP), דיפקס capped טיטניה (TiO2-Dispex), פוליסטירן ו polystyrene carboxylated NMs. אחוזים מתייחסים לשפע החלבונים ביחס לתכולת החלבון הכוללת המבוססת על שפע 3 הפפטידים העליון עבור כל חלבון. בהתחשב בהבדלים שנצפו בשפע היחסי של חלבונים בקורונה NM השונה, ברור כי פרוטוקול מוצע זה רגיש מספיק כדי להבדיל בין קורונה חלבון של NMs שונים. איור שוחזר מניתוח CESI-MS של קורונה חלבון, שפורסם תחת גישה פתוחה Creative Commons CC BY רישיון11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> איור 3: ניתוח ממוקד של המטבוליטים הקטיוניים בקורונה. ספיחות של cations ל- SiO2 ו- TiO2 NMs. אדום מתייחס לריכוז הראשוני של מטבוליטים ואילו כחול מתייחס לריכוז של מטבוליטים לאחר דגירה של 1 שעות עם NMs ב 37 °C (50 °F). הירידה בריכוז המטבוליט בתמיסה היא תוצאה של ספיחה מטבולית לפני השטח של NM. לא נצפתה ספיגה משמעותית של מטבוליטים עבור החלקות הפוליסטירן NMs. חלקות תיבה מייצגות את הערכים המינימליים והמקסימליים, טווחים חציוניים ובין-שווים. איור שוחזר מניתוח ממוקד CESI-MS של קורונה מטבולית שפורסם תחת גישה פתוחה Creative Commons CC BY רישיון15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> איור 4: ניתוח ממוקד של המטבוליטים האנוניים בקורונה עם דגש על ספירת איזומר. ספיחות של אניונים למגוון של NMs טיטניה מראה הבדלים ברורים בין isomers שונים כגון פוספטים סוכר. אדום מתייחס לריכוז הראשוני של מטבוליטים ואילו כחול מתייחס לריכוז של מטבוליטים לאחר דגירה של שעה 1 עם NM ב 37 °C (50 °F). הירידה בריכוז המטבוליט בתמיסה היא תוצאה של ספיחה מטבולית למשטח NM. לא נצפתה ספיגה משמעותית של מטבוליטים עבור SiO2 ואת החלקות NMs פוליסטירן. איור שוחזר מניתוח ממוקד CESI-MS של קורונה מטבוליט שפורסם תחת גישה פתוחה Creative Common CC BY רישיון15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ניתוח</td>
			<td>אזור שיא ממוצע של RSD</td>
			<td>זמן העברת RSD ממוצע</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 פפטידים תוך יומיים (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 ציטוטים תוך-יומיים (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cation בין-יומי (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: יכולת רבייה של CESI-MS טכני משכפל עבור פפטידים ומטבוליטים קטיקטיים. RSD: סטיית תקן יחסית, כמדד לשחזור. השכפול של CESI-MS במונחים של אזורי שיא וזימני הגירה הוא טוב מאוד, עם כל הניתוחים שיש RSD ממוצע <15% זמני הגירה <2.2%. תוצאות אלה ממחישות את רמת הביטחון הגבוהה שניתן לייחס לנתונים שנאספו בטכניקה זו ומאשרות כי וריאציות שזוהו נובעות מהבדלים אמיתיים בהרכב המדגם (העשרה על NMs) ולא וריאציה אנליטית. טבלה 2 נוצרת מתוצאות שהוצגו בעבר11,15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון קורונה ביומולקולרית מלאה, חלבונים ומטבוליטים, שנרכשו על ידי ננו-חומרים מביופלואידים באמצעות אלקטרופורזה נימית – גישת ספקטרומטריית מסה.

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K Views.  University of Birmingham. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון קורונה ביומולקולרית מלאה, חלבונים ומטבוליטים, שנרכשו על ידי ננו-חומרים מביופלואידים באמצעות אלקטרופורזה נימית – גישת ספקטרומטריית מסה.

Video: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Biochemistry

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Cancer Research

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biology

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

גילוי אינטראקציות חלבון ואפיון תפקוד חלבון באמצעות HaloTag טכנולוגיה

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST