המודל organoid שלנו הוא בעל ערך רב לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח בהומיאוסטטית, כמו גם תנאי שיפוץ בלוטת יותרת המוח, כגון התבגרות יילודים של הבלוטה, ירידה תפקודית הקשורים להזדקנות, וצמיחת הגידול בבלוטה. עד כה, טכניקת organoid בלוטת יותרת המוח שלנו היא הכלי הזמין היחיד כדי אמין וחזק לגדול ולהרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים של העכבר. מדגימים את ההליך יהיו אמה לאפורט ושרלוט Nys, סטודנטים לדוקטורט בקבוצת המחקר שלי.
כדי להתחיל, לשטוף את ראש העכבר עם מים deionized כדי להסיר את הדם. לרסס 70% אתנול על הראש כדי ליצור סביבה סטרילית. לאחר מכן, להסיר את העור בין האוזניים באמצעות כלים כירורגיים סטריליים.
כדי לפתוח את הגולגולת, לשבור את גשר האף עם מספריים סטריליים. פתחו עוד יותר את הגולגולת החל מגשר האף לכיוון האוזניים משני הצדדים. הסר את הגולגולת ואת המוח עם פינצטה סטרילית מבלי לגעת בבלוטת יותרת המוח.
מוציאים את הסרעפת עם פינצטה בוטה. לאחר מכן, תחת סטריאומיקרוסקופ, להפריד את האונה הקדמית מן האונות האחוריות והבינוניות. לבודד בזהירות את האונה הקדמית עם פינצטה קהה ולאסוף אותו בקבוק 10 מיליליטר Erlenmeyer המכיל שלושה מיליליטר של בינוני A.Add שני מיליליטר של תמיסת טריפסין 2.5% שחומם מראש.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף שני מיליליטר של פתרון DNAse שחומם מראש וסובב את בקבוק ארלנמייר 10 פעמים. תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית ולהסיר את supernatant.
מוסיפים שני מיליליטרים של תמיסת מעכב טריפסין שחוממה מראש ודגורים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את supernatant כאשר בלוטת יותרת המוח שוקע לתחתית. מוסיפים שני מיליליטר של B בינוני שחומם מראש ודגר במשך חמש דקות.
מוסיפים שני מיליליטר של C בינוני שחומם מראש לזה ודגור במשך 15 דקות. תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, לשטוף אותו שלוש פעמים עם מחממה מראש בינוני C.Add שני מיליליטר של מדיום שחומם מראש C.Aspirate ולגרש את בלוטת יותרת המוח עם סטרילי, מלוטש להבה פיפטה פסטר מספר פעמים עד שברים אינם נראים יותר.
העבר את המתלה לצינור 15 מיליליטר המכיל 4.5 מיליליטר של פתרון DNAse שחומם מראש. לשטוף את הבקבוק שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של C בינוני שחומם מראש ולהעביר את ההשעיה לצינור. מערבבים את ההשעיה התאית שנאספה ומסננים אותה דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לצינור של 30 מיליליטר.
לשטוף את הצינור ואת מסננת התא שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של C בינוני ולהעביר את ההשעיה לצינור. מלא פיפטה פסטר זכוכית עם שני מיליליטר של BSA. מקם את קצה הפיפטה בתחתית הצינור ומכין בעדינות פיפטה כדי ליצור שכבת צפיפות גלויה.
צנטריפוגה ב 190 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend גלולה התא במיליליטר אחד של DMEM מתקדם קר כקרח / F-12. לאחר מכן, כימת את התאים באמצעות מונה תאים.
צנטריפוגה השעיית התא ב 190 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה התא מתקדם DMEM / F-12 כדי להגיע לצפיפות התא של 1.1 פעמים 10 כדי 6 תאים למיליליטר. הוסף ECM לנפח הרצוי של השעיית התא ביחס של 30:70 וערבב היטב.
הפקידו טיפה של 30 מיקרוליטר מתערובת זו בכל באר של צלחת 48 באר שחוממה מראש. הופכים את הצלחת ומניחים ל-ECM להתמצק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף בזהירות 250 microliters של מדיום אורגנויד בלוטת יותרת המוח שחומם מראש בתוספת עם מעכבי סלע 10-micromolar.
כל יומיים עד שלושה ימים, לשנות את המדיום ללא מעכב רוק במשך 10 עד 14 ימים עד organoids גדלים במלואם. כדי להעביר את האורגנוידים, תחילה שאפו את המדיום בעדינות והוסיפו 400 מיקרוליטרים של DMEM/ F-12 מתקדם קר כקרח כדי לפורר את ה- ECM. לאחר מכן, לאסוף את organoids בצינור microcentrifuge.
שטפו את הבאר עם 400 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 מתקדם וקר כקרח. צנטריפוגה הצינור ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ולהוסיף 400 microliters של אנזים טריפל אקספרס שחומם מראש.
מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הוסף 400 מיקרוליטרים של DMEM/ F-12 מתקדם קר כקרח. צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant.
לשפץ את הכדור עם 100 מיקרוליטרים של DMEM / F-12 מתקדם קר כקרח. צמצמו קצה P-200 והשתמשו בקצה כדי לנתק את האורגנוידים על ידי צנרת נמרצת עד שמתקבלים שברי אורגנואידים. הוסף 800 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 מתקדם.
צנטריפוגה ב 190 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. כדי לעבור את organoids, resuspend את הכדור בנפח נאות של DMEM / F-12 מתקדם ולהוסיף ECM ביחס של 30:70. מערבבים היטב.
המשך לזרוע ולתרבות את האורגנוידים כמתואר בכתב היד של הטקסט. תאים בודדים מנותקים מן האונה הקדמית נזרעו ECM וגדלו במדיום organoid בלוטת יותרת המוח. 14 ימים לאחר הזריעה, האורגנוידים פותחו במלואם והגיעו לקוטר של עד 500 מיקרומטר.
בשלב זה, האורגנוידים הציגו מורפולוגיה ציסטית עם שכבת אפיתל המקיפה לומן. לא מומלץ להשתמש בבארות שבהן מבנים צפופים מופיעים לאחר הצמיחה. עבור מעבר חולף, שברי אורגנויד שימשו לזריעה.
שבעה ימים לאחר שעבר, צמיחה מחדש organoid חיובי נצפתה עם מבנים ציסטיים. יש להשליך אורגנוידים צפופים, שכן האורגנוידים השליליים עשויים להשתלט על התרבות. ניתוח כתמים אימונופלואורסצנטי עבור סמני האפיתל E-cadherin ו cytokeratins 8 ו 18 אישר את אופי האפיתל של organoids.
ביטוי של סמני תאי גזע בלוטת יותרת המוח Sox2 ו Trop2 הדגים את הגבעול, וסמן ספציפי בלוטת יותרת המוח LHX3 הראה פנוטיפ יותרת המוח של organoids. ביטוי הסמן Ki67 הראה כי התאים המרכיבים אורגנויד נמצאים במצב של התפשטות. ניתוח PCR RTQ הראה ביטוי גבוה יותר של סמני גזע באורגנוידים מאשר באונה הקדמית גם לאחר מעברים מרובים, אימות העשרה של תאי גזע.
חשוב לצלחת את המספר המתאים של תאים בודדים בכיפת ECM בזריעה הראשונית, וכאשר עוברים את האורגנוידים, יש לזכור לזרוע מחדש שברים ולא תאים בודדים.
