פיתחנו מתודולוגיית מיפוי FRET המאפשרת זיהוי ואפיון של אתרי קשירת ליגנד, אוריינטציה של תת-יחידות, שינויים קונפורמיים הקשורים לקשירת ליגנד ותנועות דינמיות של חלבונים. יתרון של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה בתמיסה והמולקולות יכולות לנוע בחופשיות. המרחקים הנמדדים בטכניקה זו מתאימים למערכות ביולוגיות.
FRET ישים באופן נרחב למערכות רבות. מיפוי משפר את הניטור של שינויים מבניים ודינמיים בכל מערכת ביומולקולרית, והוא יעיל במיוחד אם קיים מידע מבני תלת מימדי. לאחר טיהור החלבון, החלק הקשה ביותר הוא תיוג ביעילות גבוהה, והסרת הצבע החופשי.
עבור הניסויים, זה עוזר לקבל כמה שפחות צבע חופשי. כדי להתחיל, בחר אתרי תיוג בטווח של 25 עד 75 אנגסטרום מאתר הקשירה הענישתי, ובאזורים סטטיים יחסית של החלבון. המרחק יקבע את זוג צבעי ה-FRET הספציפי שישמש.
אתר את אתרי הסימון באזורי חלבונים הנבדלים יחסית זה מזה. אז האתרים מתארים את הקודקודים של משולש, כאשר אתר הקשירה הענישתי ממוקם במרכז. כדי למדוד את ערכי ה-R0, בהתאם לגודל ולנפח הרצויים, הכינו שתי דגימות חלבון באותו ריכוז של סך החלבון.
אחד עם החלבון המסומן בצבע התורם בלבד, ואחד עם החלבון המסומן בצבע המקבל בלבד. הפעל את הפלואורומטר ופתח את תוכנית הרכישה והניתוח הספקטרלית בתוכנת FluorEssence, אם אתה משתמש בספקטרופלואורומטר. לחץ על M האדום כדי לחבר את המחשב למכשיר ובחר ספקטרום פליטה.
הזן פרמטרי סריקה באמצעות פריט תפריט הניסויים של האיסוף, כגון אורך גל של עירור, הטווח לסריקת פליטה, טמפרטורה ומדגם משנים את מיקומך. לחץ על RTC ועל הגדרות מכשיר אופטימליות כמתואר בכתב היד, על ידי ניטור פליטת הפלואורסצנציה בשיא באמצעות אורך גל עירור שנקבע במקסימום הקליטה של הצבע. הניחו את דגימת החלבון המסומנת על ידי התורם במחזיק הדגימה, ולחצו על Run כדי ליצור סריקת פליטה של החלבון המסומן בצבע התורם בלבד, על ידי הזזת הדגימה למקסימום ספיגת הצבעים, וסריקה מעל שיא הפליטה.
קבעו קו בסיס לסריקה על ידי הארכת הסריקה ב-25 עד 50 ננומטר מעבר לסוף הפסגה. מדוד את התפוקה הקוונטית של החלבון התורם היחיד על ידי ביצוע ספיגות ומדידות פלואורסצנטיות על דגימות בריכוזים שונים, כמתואר בכתב היד של הטקסט. הכינו חלבון תורם בלבד, חלבון מקבל בלבד ודגימות חלבון המקבל-תורם, באותו ריכוז.
קבל את התורם רק סריקה כדי ליצור ספקטרום פליטה פלואורסצנטית. להלהיב את התמיסה במקסימום ספיגת הצבעים של התורם, ולסרוק את שיאי הפליטה של התורם והמקבל. החלף את הדגימה בחלבון המקבל בלבד, או שנה את הדגימה שנה את מיקומך לקובט המכיל את החלבון המקבל בלבד.
קבל סריקת פליטה של החלבון המסומן בצבע המקבל בלבד. לעורר את הדגימה באורך הגל של עירור התורם. החלף את הדגימה לדגימת החלבון המקבלת-תורם או שנה את הדגימה שנה את מיקומך ל-cuvette המכיל את החלבון המסומן על ידי התורם-מקבל.
קבל סריקת פליטה של דגימת החלבון המקבלת-תורם באמצעות אותן הגדרות. עבור כל הספקטרום, תקן את הפלואורסצנציה ברקע על-ידי הפחתת ספירות הרקע שנמדדו בסוף הסריקה. השתמש בתוכנית צפייה גרפית תלת-ממדית כגון PyMOL כדי למפות את המרחקים למבנה, על-ידי הזנה ישירה של הפקודות מסקריפט ה- Script לחלון הפקודה עם מידע המרחק המתאים.
צור מעטפת עבור כל מרחק שנמדד והשגיאה המשויכת. מפה את המיקום דרך ההצטלבות של הקונכיות השונות. אתר קשירת פפטיד האותות מופה באמצעות שלושה מיקומים שונים ב-SecA וב-SecYEG, וארבעה מיקומים שונים על פפטיד האות.
ניסויי FRET בין אזורים שונים של הקדם-חלבון ושלושה מיקומים שונים בחלבוני SecA ו-SecYEG ממפים את האתר והכיוון של טרום-קשירת החלבון. אתר הקשירה הענישתי של פפטיד האות זוהה בעבר כאצבע בעלת שני הסלילים, וזנב ה-SecA C-terminal הציע כיוון מקביל לאצבע בעלת שני הסלילים. ספקטרום FRET במצב יציב בין SecA37, לבין PhoA2, ו- PhoA22, הושגו.
ירידה בעוצמת התורם הצביעה על כך שאנרגיה גדולה יותר הועברה מ-PhoA22. יחסית לאתר PhoA2, שנמצא רחוק יותר מ- SecA37. ספקטרום דעיכה פלואורסצנטית שנפתר בזמן הראה כי לקומפלקס התורם-מקבל יש דעיכה הומוגנית קצרה יותר התואמת להעברת אנרגיה הקשורה למרחק אחד.
פגזי מרחק FRET שנבנו בין שאריות SecA PhoA2, לבין האתרים המשולשים, הראו כי כל פגז מצטלב עם האצבע בעלת שני הסלילים, אתר הקשירה המשוער, המוצג בירוק. השטח המצטלב קטן יותר מכל מעטפת FRET וכולל תרומה גדולה מהפיגום הסלילי. פגזי מרחק FRET שנקבעו בין שאריות PhoA2 לבין האתרים המסומנים, מתארים שטח קטן יותר הממוקם קרוב יותר לקצה האצבע בעלת שני הסלילים ולפה של תעלת SecYEG.
אזור מצטלב זה ממוקם בקצה הנגדי של אצבע שני הסלילים מ- PhoA2. דברים חשובים שיש לקחת בחשבון כוללים בחירה נכונה של אתרי הסימון כדי לשלש את תחום העניין, למדוד את התשואות הקוונטיות עבור כל אתר ולהסיר את כל הצבעים החופשיים. שיטה זו מתיישרת עם מידע מבני המתקבל בשיטות כמו NMR או קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.
כאשר מכניסים את תוצאות ה- FRET להקשר מבני זה יכול לשפר את המידע הקיים.
