ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי

פרוטוקול זה מתווה את הטכניקות המשמשות לייצור וירוס מחלת ניוקאסל, כך שניתן יהיה לתת אותו בבטחה לעכברים ולבעלי חיים אחרים כגון אוגרים וכבשים. השימוש בסינון זרימה משיק מאפשר עיבוד יעיל יותר של נפחי התחלה גדולים בהשוואה להליכים קיימים המשתמשים בתהליכי צנטריפוגה בלבד. זהו הליך ארוך הכולל מספר שלבים מורכבים, כלומר ניהול זמן עשוי להוות בעיה.

הייתי ממליץ לזהות את כל שלבי ההשהיה הפוטנציאליים כך שניתן יהיה לפצל את הטכניקה כראוי, ולמזער את הלחץ. מי שידגים את ההליך הזה יהיה אלכס, עוזר מחקר מהמעבדה שלי. עבור טיהור של וירוס מחלת ניוקאסל או NDV, ראשית, ראש מערכת הניסוי שנקבעה בעבר על ידי הפעלת 50 מיליליטרים של PBS דרכה.

עצור את המשאבה כאשר כחמישה מיליליטרים של PBS נשארים בצינור. לאחר מכן, חברו מסנן עומק עם דירוג שימור מיקרומולרי אחד עד שלושה לצינורות. כדי לאוורר את המסנן, הסר את המכסה השני בצד האפי של מסנן העומק ולאחר מכן התחל להריץ 50 מיליליטרים נוספים של PBS דרך המערכת.

ברגע שה-PBS מתחיל לזרום דרך פתח האוורור שבראש המסנן, סגרו את היציאה והמשיכו לזרום PBS דרך הקווים. לאחר מכן להחליף את כלי הפסולת עם כלי איסוף סטרילי חדש ולהתחיל להריץ נוזל Allantoic דרך מסנן העומק. לאחר מכן, הגדר את סינון הזרימה המשיקה או את מערכת ה- TFF באישור פתוח והפעל כמתואר בכתב היד.

כאשר נותרו במאגר כחמישה מיליליטרים של נוזל, השהו את המשאבה והוסיפו למאגר נוזל אלנטואי מסונן לעומק. לאחר מכן לחדש את זרימת המשאבה. כדי למנוע גזירה של הנגיף, חשוב לוודא כי הלחץ של המערכת לא יעלה על 10 פאונד כוח לכל אינץ 'מרובע.

כדי להגביר את האשליה, יש להשתמש בשילוב של מהירות המשאבה הפריסטלטית ומהדק C. 150 עד 100 מיליליטרים של נוזל אלנטואי נשארים במאגר, משהים את המשאבה ומחליפים את החיץ על ידי הוספת 150 עד 200 מיליליטרים של מאגר ML. שוב, השהה את המשאבה כאשר חמישה עד 10 מיליליטרים של נוזל נשארים במאגר, ולאחר מכן באמצעות שני מהדקי C לסגור את קו המותניים.

שחררו את הקו המחודש המזין את המאגר והכניסו אותו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן לחדש את הזרימה ולהשהיה כאשר נותרו כמה טיפות של נוזל במיכל המאגר. לאחר מכן, הסר את מהדקי ה- C מקווי הפסולת וחבר מחדש את קו ההזנה המחודש למיכל המאגר.

בינתיים, כדי להתכונן לשיפוע צפיפות יודיקסנול אולטרה-צנטריפוגציה, הוסיפו תחילה 0.5 מיליליטר של 40% יודיקסנול לצינור אולטרה צנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגה 13.2 מיליליטר פתוח על הקיר הדק. לאחר מכן להכין את העמודה עם תוספות עוקבות של 2.5 מיליליטרים של 20% יודיקסנול, ו -2.5 מיליליטרים של 10% יודיקסנול. לפני ultracentrifugation, יש להוסיף בזהירות שישה עד 6.5 מיליליטרים של תמיסת הנגיף הנרמזת ממערכת TFF לעמודת היודיקסנול מבלי להפריע לשיפוע.

לאחר ultracentrifugation, להסיר את הצינורות עם זוג מלקחיים סטריליים. רצועת היעד צריכה להיות פס גדול בין שיפועים של 10% ל-20%. לאחר מכן, להשעות את הצינור מעל החלק העליון של הכוס באמצעות מעמד retort.

לאחר מכן, חברו מחט בקוטר 1.5 אינץ' של 18 מד למזרק של חמישה מיליליטר ואז נקבו את הצד של צינור האולטרה-צנטריפוג' עם המחט והסירו את רצועת המטרה על ידי הארכה איטית של הבוכנה. לאחר הסרת יודיקסנול מתמיסת הנגיף כפי שמתואר בכתב היד, השתמש במזרק כדי להזריק בזהירות את הנגיף לתוך קלטת דיאליזה. כדי לרכז את תמיסת הנגיף, הסירו את קלטת הדיאליזה ממאגר הדיאליזה והניחו אותה בשקית ניילון קטנה ואטומה.

לאחר מכן הוסיפו לתיק 15 עד 25 מיליליטרים של 40% פוליאתילן גליקול, כך שקסטת הדיאליזה שקועה לחלוטין. לאחר דיאליזה לשטוף לזמן קצר את קלטת הדיאליזה עם PBS. לאחר מכן, מלאו מזרק המצויד במחט בקוטר 1.5 אינץ' של 18 מד באוויר, הכניסו את המזרק לתוך קלטת הדיאליזה ודחפו את הבוכנה.

סובב את המנגנון להסרת הווירוס מבלי להסיר אף אחד מהאוויר שהוצג. כדי לעקור את שאריות הנגיף הדבקות בקרום, יש לעסות בזהירות את הממברנה באצבעות עם כפפות מבלי לפגוע בה. כדי להקל על תהליך הפריקה, הסר חלק מעודף האוויר בקלטת הדיאליזה.

לצורך מבחני בקרת איכות, ראשית, דיללו את תמיסת הנגיף 100 פעמים על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים ממנו ל-990 מיקרוליטרים של PBS בצינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן המשך דילול סדרתי על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של הדילול הקודם ל-900 מיקרוליטרים של PBS. לבדיקות זיהום, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של כל אשליה לכל באר של צלחת 96 באר.

לפני בחינת ההשפעה הציטופתית של חלבון פלואורסצנטי ירוק, או ביצוע בדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה, דגירו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 48 שעות לפחות. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, NDV מטוהר מאוד הושג כפי שהוכח על ידי נתרן דו סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה של חלבונים ויראליים. ההדבקה של הנגיף שטוהר בשיטה זו אומתה גם על ידי מינון זיהום תרבית רקמה של 50% או בדיקת TCID50 שנעשתה ב -96 צלחות באר.

ה-TCID50 נקבע על פי מספר הבארות החיוביות לכל דילול באמצעות מחשבון ספירמן-קרבר. בדיקת הזיהום חשפה את ההבדל בין ההשפעות הציטופתיות של NDV לנטוגני ומזוגני על תאי DF אחד בתנאים שונים לאחר 10 ו -24 שעות של דגירה. הבדיקה החיסונית של פירנצה הייתה יעילה גם בחקר הזיהום של תאי Vero על ידי NDV לנטוגני.

בעת הטמעת מערכת הניסוי, ודא כי הקווים מוכנים ביעילות כמו כל שאריות נתרן הידרוקסיד ישביתו את הנגיף. כמו כן חשוב לשמור על שלמות הממברנה שכן התפשרות על כך תפגע באופן משמעותי בטיהור הנגיף ובתפוקתו.