מבחני הלכידה וההארכה של לולאת D הם הראשונים שמאפשרים כמות בלתי משוחדת וישירה של היווצרות לולאת D ושלבי הארכה במהלך רקומבינציה הומולוגית בתאי שמרים הגדלים במיטו. טכניקה עצמאית זו מאפשרת לחקור חלבונים במטבוליזם של לולאת D שאחרת לא היה ניתן להתנתק מתפקידים מאוחרים יותר, רק להסתכל על מוצרי BIR. בעתיד, אנו צופים מעבר של מבחנים אלה לתאים אנושיים כדי להבין טוב יותר את תפקידם של חלבוני מפתח, כולל BRCA2 והמקרים של פריחה וקילו וורנר ברקומבינציה הומולוגית.
התחל על ידי צנטריפוגה של הדגימות במשך חמש דקות. החזירו את הכדור ל-2.5 מיליליטר של תמיסת פסורלן 1x והעבירו אותו לצלחת פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר. ללא שליטה בקישור צולב, השהה מחדש את הכדור ב- 2.5 מיליליטר של פתרון TE1.
לאחר מכן, הגדר את מקור האור UV את החלק העליון בשייקר מסלולי, שנקבע על 50 סל"ד. כדי להצליב את הדגימות באמצעות קישור צולב UV עם נורות גל באורך 365 ננומטר. מקמו את צלחות הפטרי במרחק של סנטימטר עד שניים מתחת למקור אור ה-UV למשך 10 דקות עם ניעור עדין על צלחת פלסטיק או פרספקס מקוררת מראש.
לאחר מכן להעביר את הדגימה לתוך צינור חדש 15 מיליליטר. שטוף את צלחת הפטרי עם 2.5 מיליליטר של תמיסת TE1 והוסף אותה לצינור. צנטריפוגה את הדגימות במשך חמש דקות.
יש להשליך את הסופר-נטנט ולאחסן את הכדור בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. מניחים את הדוגמאות על קרח להפשרה. במקביל, מחממים אמבטיה יבשה ל -30 מעלות צלזיוס.
השהה את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ spheroplasting והעבר אותן לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים 3.5 מיקרוליטרים של תמיסת זימוליאז ומערבבים בעדינות על ידי הקשה. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
ואז מניחים את הצינורות על קרח. צנטריפוגה במשך שלוש דקות ומניחים את הדגימות על קרח. שטפו את הדגימות שלוש פעמים בחיץ ספרופלסט מיליליטר אחד וצנטריפוגות את הדגימות במשך שלוש דקות.
יש להשעות את הדגימות במיליליטר אחד של מאגר אנזימי הגבלת הצטננות. צנטריפוגה במשך שלוש דקות ומניחים את הדגימות על קרח. יש לחזור על הכביסה פעם אחת.
יש להשעות את הדגימות במיליליטר אחד של מאגר אנזים הגבלה קר 1x. חלקו את המדגם באופן שווה לשניים. צנטריפוגה דגימות במשך שלוש דקות ב 16, 000 G בארבע מעלות צלזיוס.
יש לתלות שפופרת אחת מכל דגימה ב-180 מיקרוליטרים של מאגר אנזימי הגבלה פי 1.4 עם אוליגוס היברידיים וצינור נוסף ב-180 מיקרוליטרים של מאגר אנזימי הגבלה פי 1.4 ללא הכלאה של אוליגוס. הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי. הפשירו את הדגימות על הקרח.
מחממים אמבטיה יבשה אחת ל-65 ואחרת ל-37 מעלות צלזיוס. Aliquot 36 מיקרוליטרים של הדגימה לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו חדש וארבעה מיקרוליטרים של 1% SDS ומעורבבים על ידי הקשה עדינה על הצד של הצינור. יש לדגור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בהקשה עדינה כל חמש דקות.
הניחו דגימות על קרח מיד לאחר הדגירה. מוסיפים 4.5 מיקרוליטרים של 10% טריטון X-100 ומערבבים על ידי פיפט. הוסף 20 עד 50 יחידות של אנזים הגבלה EcoR1 או HindIII בנאמנות גבוהה לכל דגימה.
ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם תסיסה עדינה כל 20 עד 30 דקות. במהלך תקופה זו, אמבטיה יבשה מחוממת מראש ל 55 מעלות צלזיוס ואמבט מים ל 16 מעלות צלזיוס. הוסיפו 8.6 מיקרוליטרים של 10% SDS לכל דגימה וערבבו על ידי פיפטינג והקשה.
דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הוסיפו 80 מיקרוליטרים של 10% טריטון X-100 לכל דגימה וערבבו בפיפט. הוסיפו 660 מיקרוליטרים של חיץ קשירה 1x ללא ATP, ATP מילימולרי אחד ב-pH 8.0 ושמונה יחידות של ליגאז DNA T4 לכל דגימה, וערבבו בעדינות על ידי היפוך.
דגירה 16 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות עם היפוך כל 30 דקות. מניחים את הדגימות על קרח מיד לאחר הדגירה. לאחר טיהור הדנ"א כמתואר בפרוטוקול, השתמש בשני מיקרוליטרים של דנ"א מטוהר כדי ליצור תגובת qPCR של 20 מיקרוליטר בהתאם להוראות היצרן.
עבור כל דגימה, הגדר חמש תגובות בקרה ותגובת כימות אחת והפעל אותן בשכפול. ניתוח בדיקת DLC שעתיים לאחר הפסקה דו-גדילית או אינדוקציה של DSB הראה כי קישור צולב של פסורלן הוא קריטי והיעילות תלויה בזמן שבין איסוף הדגימה ל-qPCR. ערכי ערכי ARG4 Cp היו דומים בין הדגימות המקושרות אך נמוכים יותר עבור הדגימה ללא קישור צולב מכיוון שדנ"א ללא קישורים צולבים מגביר בצורה יעילה יותר.
עבור כל הדגימות, בקרת qPCR של קשירה בין-מולקולרית הייתה בטווח. אינדוקציה חזקה של DSB הוכחה על ידי אות qPCR נמוך לבקרה שמגבירה את אתר זיהוי האנדונוקלאז של HO. תוצאות דומות נצפו עבור בקרת EcoR1 qPCR.
אות DLC עם אוליגו היברידי חושב על ידי נרמול לבקרת הקשירה הבין-מולקולרית. ניתוח בדיקת DLE שבוצע בשש שעות לאחר אינדוקציה של DSB הראה כי ערכי ARG4 CP היו דומים בין דגימת אוליגוס עם ובלי הכלאה. בקרת qPCR של קשירה בין-מולקולרית גילתה אות קביל עבור דגימת אוליגוס עם ובלי הכלאה, אך אות נמוך יותר עבור הדגימה הכושלת.
בכל שלוש הדגימות הייתה אינדוקציה חזקה של DSB. מכיוון שביקוע HindIII תלוי בשיקום אתר אנזים ההגבלה על ידי אוליגו הכלאה. היה הבדל משמעותי בהגברה על פני אתר המחשוף HindIII על החוט שנכרת בין הרוחב וללא דגימות אוליגו.
הבדל קטן יותר בהגברה על פני האתר על הגדיל המורחב נצפה מכיוון שכאן המחשוף של HindIII תלוי גם בהרחבה. הדגימות והחיץ צריכים להישמר קרים בכל עת. דגימות חייבות להיות מוקפאות לאחר חידוש במאגר אנזים הגבלת קור פי 1.4 עם או בלי הכלאה של אוליגו.
ניתן לחקור את ההשפעות במורד הזרם של היווצרות לולאת D והרחבה על היווצרות מוצרים באמצעות כתמים דרומיים או מבחני נקודות קצה גנטיות. השפעות על חיפוש הומולוגי עשויות להיחקר באמצעות CP גבוה. כרומטין-מיצוי חיסוני יכול לספק מידע על גיוס של חלבון מעניין.
