פרוטוקול זה מאפשר הערכה מקומית הן של ארכיטקטורת הקולגן והן של מאפייני הכשל המכני של רקמת הרובד הסיבי. מכיוון שגם הערכות מבניות וגם מכניות בוצעו על אותה דגימת רקמה, טכניקה זו מאפשרת לפענח את הקשר התפקודי בין ההערכות המבניות והמכניות של הרקמה. הידע המתקבל בפרוטוקול זה על מבנה רקמת הרובד הסיבי ומאפייני הכשל הוא המפתח למניעה וחיזוי של אירועים קטלניים קליניים הנגרמים על ידי קרע ברובד טרשתי.
כדי להתחיל, לחתוך את הרובד לפתוח לאורך ציר האורך של העורק באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה. גזרו דגימות בדיקה מלבניות מדגימות הפלאק, וודאו שהדגימות גדולות ככל האפשר תוך הימנעות מאזורי רקמה המכילים קרעים או הסתיידויות. לאחר מכן, קחו דגימת בדיקת פלאק וקיבעו את שני קצותיו לסיליקון על ידי הצמדת מחטים ברקמה.
הכנס את המחטים באזור הדגימה שתהיה במלחציים של מכשיר בדיקת המתיחה במהלך הבדיקה המכנית. הרכיבו משקפי בטיחות. השתמשו בחותך צדדי כדי לקצר את המחטים כך שיבלטו החוצה פחות מכמה מילימטרים מעל פני הדגימה כדי למנוע מהן לפגוע במטרה של המיקרוסקופ.
ממלאים את צלחת הפטרי ב-PBS עד שהדגימה שקועה במים. לאחר מכן, הפעל את מערכת המיקרוסקופ, סובב את מפתח המולטיפוטון ופתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ. שים את צלחת הפטרי המכילה את דגימת הבדיקה מתחת למטרה והנמיך את מטרת המיקרוסקופ.
הפעל את מצב סריקה חיה. הזיזו את המטרה לפינה של הדגימה בעזרת הידיות בחלונית החכמה ולחצו על סמל מיקום הסימון בחלונית 'סריקת אריחים'. אם היא מבוצעת כהלכה, רשת עם כל האריחים שנבחרו להדמיה תופיע בצבע כתום.
לאחר מכן, לחץ על התחל בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי ליצור סריקת אריחים של משטח הדגימה כולו כדי לקבל סקירה כללית של הגיאומטריה לדוגמה. לאחר סריקת האריחים, התבונן בקואורדינטות X ו- Y בפינה השמאלית העליונה של האריח השמאלי העליון בחלונית סריקת אריחים המוצגות אוטומטית. שים לב לקואורדינטות אלה בגיליון אלקטרוני.
בחלונית 'סריקת אריחים', התבונן במספר האריחים בכיווני X ו- Y בתיבה שנקראת ScanField. שים לב לגודל סריקת האריח בגיליון האלקטרוני. חשב את הקואורדינטות של האריחים האחרים על-ידי הוספה או חיסור של גודל האריח.
מסריקת האריח, בחר את האריחים לצילום עם יצירה הרמונית שנייה, או הדמיית SHG. לבחירה, הימנעו מאריחים במלחציים והשאירו אריח אחד בין כל אריח שנבחר הן בכיוון האורכי והן בכיוון המעגלי. לאחר מכן, זהה את מיקום האריחים שיש לצלם באמצעות הקואורדינטות המחושבות בגיליון אלקטרוני זה.
מלא את הקואורדינטות בתיבות המיועדות ולחץ על Enter כך שהמטרה תזוז לאריח הימני. הפעל את מצב סריקה חיה. הגדל את עוצמת הלייזר של מולטיפוטון, או MP, באמצעות המחוון בחלונית העליונה והגדרות נתיב הקרן כדי לקבל את עוצמת הלייזר הגבוהה ביותר האפשרית ללא הלבנה משמעותית.
לאחר מכן, התאם את רווח הגלאי לקבלת תמונות בהירות ללא פיקסלים רוויים באמצעות הידית בלוח החכם או על ידי לחיצה על שם הגלאי והגדרות נתיב הקרן וערוצים נוספים. ערכים אופייניים עבור רווח הגלאי הם בין 500 ל 800 וולט. השתמש בידית מיקום Z בלוח החכם כדי לכוונן את מישור המיקוד.
לאחר מכן, עבור לחלק העליון של הדגימה והגדר את המיקומים של החלק העליון של ערימת Z על ידי לחיצה על ראש החץ בחלונית Z-stack תחת הכרטיסייה רכישה מהחלונית השלישית. לאחר מכן, התמקדו בדגימה עד שאות ה-SHG לא יזוהה עוד. שוב, לחץ על ראש החץ בחלונית Z-stack כדי לקבוע מיקום זה.
כשתסיים, כבה את מצב הסריקה החיה. תחת הכרטיסייה רכישה בחלונית השנייה, שמור על מהירות הסריקה על 400 הרץ, הגדר את ממוצע הקו לשניים ואת הרזולוציה ל- 512 על 512 פיקסלים לתמונה באמצעות הרשימות הנפתחות. הפעל את לחצן סריקת X דו-כיווני.
לחץ על גודל z-step בחלונית Z-stack ומלא גודל z-step של שלושה מיקרון בתיבה. לחץ על התחל בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי ליצור ערימת Z. בסיום, שמור את הקואורדינטות של האריח בשם הקובץ או תן לכל אריח את מספרו.
לאחר ההדמיה, הדגימה נחשפת לבדיקה מכנית. כדי ליצור תבנית spackle, החזיקו את מברשת האוויר המלאה בצבע רקמה במרחק של כ-30 סנטימטרים מדגימת הבדיקה ורססו אותה על משטח הלומנל. לאחר מכן, לבדיקת מתיחה חד-צירית, הניחו את הדגימה במלחציים של בודק המתיחה כאשר הכיוון ההיקפי של הדגימה מיושר עם כיוון מתיחה והצד הלומנלי של הדגימה פונה כלפי מעלה.
ודא שאורך המד ההתחלתי מוגדר כך שיחס הרוחב-אורך של הרצועה יהיה קטן מאחד. הדקו את ברגי האחיזה על ידי הפעלת מומנט של 20 סנטיטון מטר באמצעות מברג מומנט. הוסיפו PBS לאמבט החימום עד שהדגימה שקועה במים.
קרע את תא העומס והתחל להקליט את מדידות הכוח והתזוזה הגלובליות מתא העומס ומהמפעיל של בודק המתיחה. יישרו את הדגימה על ידי מריחת מתיחה מראש של 0.05 ניוטון כדי להיפטר מהרפיון בדגימה. בצע 10 מחזורים של טרום התניה, עד 10% מתח, בהתבסס על מדידת אורך המד על ידי המפעיל לאחר היישום של מתיחה מראש.
התחל את בדיקת המתיחה החד צירית עד לכישלון מוחלט של הדגימה תוך הקלטת וידאו של עיוות הדגימה באמצעות המצלמה המהירה. לאחר כישלון, הפסק להקליט את מדידות הכוח והתזוזה העולמיות. פתח את ערימות Z המתקבלות במהלך מיקרוסקופ רב-פוטונים, או MPM, עם SHG בתמונה J וצור הקרנות בעוצמה מרבית, או MIPs, של כל ערימת Z.
נתחו כל MIP בעזרת הכלי הפתוח לניתוח כיוון סיבים מבוסס MATLAB בקוד פתוח כדי למדוד את זווית הכיוון של סיבי הקולגן הבודדים שנמצאים באריחים. השתמשו בכלי מבוסס MATLAB אחר, FibLab, כדי להתאים התפלגות גאוסית להיסטוגרמה של התפלגות הזווית. מתוך תרשים ההתפלגות של גאוס, חלצו את הפרמטרים המבניים כגון זווית הסיב השלטת, שהיא אופן ההתפלגות, סטיית התקן של התפלגות זווית הסיב, והשבר האנאיזוטרופי.
בצע בדיקה חזותית בתמונות המצלמה כדי לזהות את הפריים שבו מתרחש התחלת הקרע. זהה חזותית את מיקום הקרע. בצע את ניתוח מתאם התמונה הדיגיטלית, DIC, עם תוכנת ncorr מבוססת MATLAB באמצעות תמונות המצלמה שצולמו במהלך בדיקת המתיחה.
בחר במסגרת האחרונה לפני המתיחה הסופית עד לכישלון כתמונת ההתייחסות. לתמונות הנוכחיות, בחרו ll images מתחילת המתיחה הסופית ועד למסגרת האחרונה לפני המסגרת שבה התרחש התחלת הקרע. בחר את משטח הדגימה כאזור עניין, או החזר השקעה.
לא לכלול את האזורים הסמוכים למלחציים. בצע DIC על-ידי הגדרת רדיוס תת-הערכה של הפרמטר ל- 30 פיקסלים, ריווח תת-קבוצה לשלושה פיקסלים, חיתוך איטרציה ל- 50, נורמה של חיתוך וקטור ההפרש ל- 10 בחזקת חמש, רדיוס מאמץ לחמש ושלב ההתפשטות האוטומטית לחמש. מניתוח DIC עם ncorr, קבל את התפלגות הזנים Green-LaGrange או Eulerian של החזר ההשקעה.
השתמש בפיזור זנים אלה כדי לחשב את זן Green-LaGrange הממוצע של כל משטח דגימת הפלאק בפריים האחרון לפני הקרע. חישוב זן Green-LaGrange במיקום הקרע. בעזרת ציוני הדרך הטבעיים בדוגמת הבדיקה, צור שכבת-על של תמונת הייחוס וסריקת האריח כדי לזהות את מיקום הקרע בסריקת האריח.
זהה את האריח MPM-SHG שבו התרחש הקרע. אם הקרע אינו באריח שנסרק באמצעות MPM-SHG, זהה את האריח הקרוב ביותר למיקום הקרע. השג את הפרמטרים המבניים שנמצאו באריח שבו התרחש הקרע.
דגימת פלאק טרייה ושלמה עם מעט או ללא קרעים והסתיידויות מקרו מוצגת כאן. ניתן לשלוף דגימות פלאק מאזורים שאינם כוללים קרעים והסתיידויות אלה. דימות SHG ועיבוד לאחר תמונה מספקים MIPs מכל אריח התמונה.
עיבוד נוסף לאחר עיבוד על ידי זיהוי סיבים מניב היסטוגרמות כיוון סיבים שמהן ניתן להפיק פרמטרים מבניים של קולגן. בנוסף, מתקבלות מפות צבע המציגות את פרמטרי הקולגן המבניים המקומיים על פני כל דגימת הפלאק לצורך ניתוח חזותי. מדגימות בדיקה אלה נצפתה שונות תוך-דגמית גדולה בפרמטרים המבניים של קולגן.
התחלת הקרע והתפשטותו בדגימת רקמת פלאק במהלך בדיקת המתיחה מודגמות כאן. ניתוח מתאם תמונה דיגיטלי מספק מפות מקומיות של עיוות רקמות, כגון מפות הזנים Green-LaGrange. ממפות זנים אלה נצפתה שונות תוך-מדגמית גדולה בזנים המקומיים.
לאחר זיהוי מיקום הקרע בהקלטות המצלמה, ניתן למפות אותו בחזרה לתמונת מצלמת הייחוס ולסריקת אריחי המיקרוסקופ. פעולה זו מספקת את אריח MPM-SHG שבו התרחש הקרע ואת הפרמטרים המבניים שנמצאו באריח זה. השגת דגימות רקמה סיבית ללא הסתיידויות ובגודל גדול מספיק הניתנות לבדיקה מכנית עשויה להיות משימה מאתגרת עבור רבדים מסוידים כבדים.
ברגע שתכונה מכנית או מבנית מזוהה כמנבא לכשל רקמת רובד סיבי, מערכת הדמיה in vivo המודדת תכונה זו תאפשר לחזות את הסיכון לקרע פלאק בחולים.
