מחקר זה נתמך על ידי מענק של JSPS KAKENHI (מענק מס '23390072 ו 19K07335) ו AMED (מענק מס 'A-149).

שיטת הזרקה איטית זעיר פולשנית חדשנית להפחתת פגיעה ברקמות

<ol>
	<li>Chavkin, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+surface+receptors+Ror1/2+control+cardiac+myofibroblast+differentiation.">The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation.</a> Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+membrane+repair+protein+MG53+modulates+transcription+factor+NF-&#954;B+signaling+to+control+kidney+fibrosis.">The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-&#954;B signaling to control kidney fibrosis.</a> Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).</li><li>Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monocytes+in+optic+nerve+injury.">The role of monocytes in optic nerve injury.</a> Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).</li><li>Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+BMP+and+activin+membrane-bound+inhibitor+(BAMBI)+in+chronic+liver+diseases+and+hepatocellular+carcinoma.">Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473 (2023).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Hattori, F., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+replacing+myocytes+with+induced+pluripotent+stem+in+clinical+protocols.">Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols.</a> Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).</li><li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).</li><li>Fernandes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+engraft+but+do+not+alter+cardiac+remodeling+after+chronic+infarction+in+rats.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts.">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li><li>Wendel, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+effects+of+a+tissue-engineered+cardiac+patch+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+a+rat+infarct+model.">Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).</li><li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+Platforms+for+Heart+Regenerative+Therapy+Using+Pluripotent+Stem+Cells.">Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).</li><li>Tao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+lesion+characterization+in+scarred+substrate+assessed+using+cardiac+magnetic+resonance.">Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance.</a> JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).</li><li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+driving+force+for+change:+interstitial+flow+as+a+morphoregulator.">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).</li><li>Hattori, F., Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+purify+cardiomyocytes+for+research+and+therapeutic+purposes.">How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes.</a> Cardiac Regeneration using Stem Cells. , (2013).</li><li>Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+process-induced+cell+damage+in+the+biodispensing+process.">Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).</li></ol>

למחבר אין מה לחשוף.

אחת הנקודות הקריטיות בביצועים מוצלחים של שיטת ההזרקה האיטית היא הכנת מערכת הזרקה יעילה באמצעות משאבת מזרק חזקה וצינור העברת לחץ חזק. מערכת לחץ גבוה נדרשת כדי לדחוף ג'ל החוצה מקצה מחט דקה. הנקודה הקריטית השנייה היא ייצוב הלב. פעימות הלב כנגד מחט הזרקה המתקדמת לתוך שריר הלב עלולות לפגוע ברקמה. במחקר זה בוצעה זריקה מונחית אקו כדי למנוע מהחיות לעבור פגיעה שנייה בחזה הפתוח וכדי לתת את הזרקת התאים בלב מיוצב כשהריאות מנופחות. יתר על כן, בחלק מהיישומים עבור בעלי חיים גדולים יותר או בני אדם, יש לשקול כמה מכשירי הזרקה המחוברים ללב כחלק מהתכנון האסטרטגי של היישום. עבור הזרקות חזה פתוח לליבם של בעלי חיים קטנים, מומלץ להשתמש במחט ארוכה וגמישה בהתחשב בקצב הלב הגבוה שלהם.
בעבודה זו, שיטת ההזרקה האיטית הגדילה באופן משמעותי את נפח הקרדיומיוציטים ששרדו בהשוואה לשיטת ההזרקה הרגילה. ההזרקה הרגילה גורמת נזק לתאים באמצעות לחץ גזירה15. לעומת זאת, שיטת ההזרקה האיטית אינה גורמת ללחץ כזה באופן תיאורטי מכיוון שהיא משתמשת בתמיסה לא ניוטונית בנוסף להזרקה האיטית.
במונחים של פיברוזיס מקומי, החלל הבין-תאי סביב הקרדיומיוציטים ששרדו בדרך כלל המוזרקים הראה שקיעת קולגן מסוג I חזקה ונפוצה. לעומת זאת, אותות הקולגן מסוג I סביב הקרדיומיוציטים המושתלים שהושתלו בשיטת ההזרקה האיטית היו חלשים ומוגבלים בהרבה. הדבר מצביע על כך ששיטת ההזרקה האיטית גרמה לנזק קטן משמעותית. הזרקה איטית של קרדיומיוציטים בילוד לתוך שריר הלב הבוגר שיפרה באופן משמעותי את תפקוד ההתכווצות של הלב האוטם. הניתוחים ההיסטולוגיים הציעו כי השתלת הקרדיומיוציטים בשיטת ההזרקה האיטית הביאה לקשרים ישירים וצימוד פונקציונלי עם הקרדיומיוציטים המאכסן. תופעה זו מסבירה את מנגנון ההתאוששות התפקודית של שריר הלב המארח. למיטב ידיעתנו, זהו הדיווח הראשון של קרדיומיוציטים מושתלים בילוד עם חיבורים חלקים בקנה מידה גדול לקרדיומיוציטים הבוגרים המארחים. הקשרים התפקודיים עם שריר הלב המארח באמצעות צימוד חשמלי ומכני עשויים להבשיל את הקרדיומיוציטים המושתלים ולאפשר להם לפעול כמיוציטים פונקציונליים התורמים לתפקוד הלב המארח. אינטראקציות כוח פיזי ארוכות טווח בין המארח לבין קרדיומיוציטים של השתל הן חיוניות להבשלה מלאה. לכן, 2 חודשים עשויים להידרש לאחר ההזרקה להחלמה תפקודית של הלב אוטם. ההתאוששות תלוית הזמן של תפקוד הלב של המטופל עשויה להיות תופעה צפויה ביישומים טיפוליים, וזה יכול להיות סימן ההיכר של ביסוס מוצלח של צימוד תפקודי דה נובו ואינטגרציה בין המארח לבין קרדיומיוציטים מושתלים.
ניתן לבצע את שיטת ההזרקה האיטית במהלך ניתוח חזה פתוח. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על עכברים. עבור יישומים עתידיים בטיפול אנושי, אנחנו עדיין צריכים לפתור כמה בעיות. מהירות ההזרקה צריכה להיות אופטימלית על ידי התחשבות בקיבולת החיץ של זרימת הנוזל הבין-תאי, בכל איבר מטרה אנושי. יש ליישם חומרים נטולי קסנו, כגון ג'לטין אנושי או חומרים סינתטיים מתכלים. יש לפתח מנגנון הזרקה איטית קליני בדרגת GMP, כגון כלים חד-פעמיים קומפקטיים ספציפיים לאיברים או מכשיר לשימוש חוזר באיברים רחבים.

ניהול תאים והחלפתם הם אסטרטגיות טיפוליות חדשות ומבטיחות לאיברים שניזוקו קשות. בין אסטרטגיות טיפוליות חדשניות אלה, רפואת הלב הרגנרטיבית משכה תשומת לב רבה. עם זאת, הדלקת הנגרמת על ידי פציעות מתווכת היווצרות צלקת במספר איברים 1,2,3,4. הלב האנושי מורכב מכ -1010 קרדיומיוציטים; לכן, תיאורטית5,6, זה חייב להיות מטופלים עם יותר מ 109 cardiomyocytes. מתן מספר רב של קרדיומיוציטים בשיטות הזרקה מסורתיות עלול להוביל לפגיעות משמעותיותברקמה 7. שיטה זו מספקת שיטת הזרקת תאים חדשנית עם פלישה מינימלית לרקמות.
מתן תאים לתוך פרנכימה איברים דורש זריקות. עם זאת, קיים פער בכך שההזרקה עצמה עלולה להוביל לפגיעה ברקמות. פגיעה ברקמות גורמת לדלקת מקומית ולהצטלקות חשוכת מרפא באיברים וברקמות, כמו גם לפגיעה ביכולת ההתחדשות 8,9,10. ללב היונקים יש נטייה גבוהה מאוד לפתח צלקות במקום להתחדש, משום שהוא זקוק לתיקון פציעה מיידי על מנת לשאת את לחץ הדם הגבוה הנגרם על ידי תפקוד השאיבה המתמשך שלו11. טיפול אבלציה מנצל נטייה גבוהה זו ליצירת צלקות וחוסם את המעגל הצפוי לעבור היווצרות צלקת באמצעות הפרעת קצב12. במחקר קודם נצפה כי רקמת הצלקת בודדה את הקרדיומיוציטים המוזרקים בשריר הלב המארח. לפיכך, זהו נושא היעד הבא שיש להתגבר עליו כדי להשיג יעילות טיפולית משופרת ברפואה רגנרטיבית לבבית.
זרימת נוזל אינטרסטיציאלי ברקמה ממלאת תפקיד חיוני בהעברת חמצן וחומרים מזינים לתאים וסילוק הפסולת המופרשת מהתאים. המהירות הפיזיולוגית של זרימת נוזל אינטרסטיציאלי בכל רקמה/איבר שונה (הטווח הוא 0.01-10 מיקרומטר לשנייה)13. למיטב ידיעת המחבר, אין נתונים לגבי היכולת של רקמות/איברים בודדים לתמוך בכמויות נוספות של נוזלים ללא בצקת פתולוגית; עם זאת, ניסוי זה מנסה להשתמש במהירות הזרקה איטית כדי אולי להפחית את הפגיעה ברקמות, ואת התוצאות ניתן להשתמש כדי לקבוע את המעשיות של מושג זה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge needle &#38; tuberculin, 1 mL</td>
			<td>Terumo&#160;</td>
			<td>NN1838R, SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29-gauge 50 mm-long needle</td>
			<td>Ito Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>14903 Type-A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A copper tube</td>
			<td>General Suppliers</td>
			<td></td>
			<td>outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ads Buffer</td>
			<td>Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-MEM</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>051-07615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>14695-1-AP</td>
			<td>using dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6219</td>
			<td>using dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>using dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking solution (Blocking One)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>03953-95&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal laser microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany</td>
			<td>LSM510 META</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria III</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest, FL, USA</td>
			<td>S1820-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine movement device (Micromanipulator)</td>
			<td>Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>M-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>&#160;Nikon Instruments, Tokyo, Japan</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9382</td>
			<td>dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats</td>
			<td>Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>0&#8211;2 d after birth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-adhesive 96-well plates (spheloid plate)</td>
			<td>Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan</td>
			<td>MS-0096S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound&#160;</td>
			<td>Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA</td>
			<td>Tissue-Tek OCT compound</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump (for cooling system)</td>
			<td>As One Co., Osaka, Japan</td>
			<td>SMP-23AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2</td>
			<td>Chemglass life sciences LLC, NJ, USA</td>
			<td>CG-2003-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe&#160;</td>
			<td>Ito Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>MS-N25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump with remote controller</td>
			<td>As One Co., Osaka, Japan</td>
			<td>MR-1, CT-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylrhodamine methyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>T668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>215240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>167-11515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>veterinarian ointment</td>
			<td>&#160;Fujita Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>Hibikusu ointment&#160; #WAK-95832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0</td>
			<td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weakly curved needle with ophthalmic thread</td>
			<td>Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>C7-70</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel cell injection method with minimum invasion

הזרקה ישירה של תאים לרקמות היא תהליך הכרחי במתן תאים ו / או טיפול חלופי. הזרקת התא דורשת כמות מספקת של תמיסת השעיה כדי לאפשר לתאים להיכנס לרקמה. נפח תמיסת התרחיף משפיע על הרקמה, וזה יכול לגרום לפגיעה פולשנית גדולה כתוצאה מהזרקת התא. מאמר זה מדווח על שיטת הזרקת תאים חדשנית, הנקראת הזרקה איטית, שמטרתה למנוע פגיעה זו. עם זאת, דחיפת התאים מקצה המחט דורשת מהירות הזרקה גבוהה מספיק על פי חוק כוח הגזירה של ניוטון. כדי לפתור את הסתירה הנ"ל, נוזל לא ניוטוני, כגון תמיסת ג'לטין, שימש כתמיסת תרחיף התא בעבודה זו. לתמיסת ג'לטין יש רגישות לטמפרטורה, שכן צורתם משתנה מג'ל לסול בסביבות 20 מעלות צלזיוס. לכן, כדי לשמור על תמיסת השעיית התא בצורת ג'ל, המזרק נשמר מקורר בפרוטוקול זה; עם זאת, ברגע שהתמיסה הוזרק לגוף, טמפרטורת הגוף המירה אותו לסול. זרימת נוזל הרקמה הבין-תאית יכולה לספוג תמיסה עודפת. בעבודה זו, טכניקת ההזרקה האיטית אפשרה לכדורי קרדיומיוציטים להיכנס לשריר הלב המארח ולהשתיל ללא פיברוזיס מסביב. מחקר זה השתמש בשיטת הזרקה איטית כדי להזריק קרדיומיוציטים של חולדות ילודים מטוהרים ובצורת כדור לאזור מרוחק של אוטם שריר הלב בלב החולדה הבוגרת. לאחר חודשיים לאחר ההזרקה, הלבבות של הקבוצות המושתלות הראו שיפור משמעותי בתפקוד ההתכווצות. יתר על כן, ניתוחים היסטולוגיים של הלבבות המוזרקים לאט גילו קשרים חלקים בין המארח לבין קרדיומיוציטים מושתלים באמצעות דיסקים משולבים המכילים חיבורי צומת רווח. שיטה זו יכולה לתרום לטיפולים התאיים של הדור הבא, במיוחד ברפואה רגנרטיבית לבבית.

Cell administration and replacement are promising novel therapeutic strategies for heavily damaged organs. Among these novel therapeutic strategies, cardiac regenerative medicine has attracted considerable attention. However, the inflammation caused by injuries mediates scar formation in several organs1,2,3,4. The human heart consists of approximately 1010 cardiomyocytes; therefore, theoretically5,6, it must be treated with more than 109 cardiomyocytes. Administering a large number of cardiomyocytes via traditional injection methods may lead to significant tissue injuries7. This method provides a novel cell injection method with minimal tissue invasion.
Cell administration into the organ parenchyma requires injection(s). However, a discrepancy exists in that the injection itself may lead to tissue injury. Tissue injury causes local inflammation and incurable scarring in organs and tissues, as well as impaired regenerative ability8,9,10. The mammalian heart has an extremely high propensity to develop scars instead of regenerating because it requires immediate injury repair in order to endure the high blood pressure caused by its continuous pumping function11. Ablation therapy utilizes this high propensity toward scar formation and blocks the circuit likely to undergo scar formation using arrhythmia12. In a previous study, it was observed that the scar tissue isolated the injected cardiomyocytes in the host myocardium. Thus, this represents the next target issue that needs to be overcome to obtain improved therapeutic efficacy in cardiac regenerative medicine.
Tissue interstitial fluid flow plays a vital role in conveying oxygen and nutrients to cells and removing the excreted waste from cells. The physiological speed of interstitial fluid flow in each tissue/organ is different (the range is 0.01-10 &#181;m/s)13. To the best of the author&#39;s knowledge, there are no data regarding the capacity of individual tissues/organs to support extra amounts of fluid without pathological edema; however, this experiment attempts to use a slow injection speed to possibly reduce tissue injury, and the results can be used to determine the practicality of this concept.

מחבר זרקור: שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה  

שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה

In this work, the purpose is to improve the efficacy of regenerative medicines, especially heart regenerative medicine using induced pluripotent stem cells. Heart regenerative medicine is our most contributed research field. My significant findings include a metabolic selection of cardiomyocytes, i.e.a simple and mass purification mass way for cardiomyocytes with cultural condition of withdrawn glucose and added lactate. Another finding includes the efficient engraftment method for cardiomyocytes by publication of cardiomyocyte poles. This transplantation method with cardiomyocyte poles confirmed the enhanced engraftments of cardiomyocyte poles.However, the lack of direct interaction between the host and graft cardiomyocytes was found. This technique offers fewer invasions to the tissues receiving the cell injections. As a result of this, direct interaction between the host and graft cardiomyocytes was facilitated.This technology can diminish injuries, inflammatory responses, and eventually fibrosis, i.e. scar formation. Hopefully, this technology will be applied to the next generation of regenerative medicines, including heart regenerative medicine using pluripotent stem cells.We have already found several ways to bring significant merit to heart regenerative medicine. These studies will be continued in the future.

השפעות ההזרקה האיטית על הישרדות התאים ושקיעת הקולגן כדורי קרדיומיוציטים של חולדות יילודים המסומנים ב-PKH26 הוזרקו לשריר הלב של חולדה עירומה רגילה בשיטת הזרקה רגילה או איטית. התוצאות הראו ששיטת ההזרקה האיטית הגדילה באופן משמעותי את נפח התא המושתל (איור 3A) והפחיתה באופן משמעותי את שקיעת הקולגן מסוג I באתר (איור 3B).
השפעות הזרקה איטית על יעילות הטיפול במודל אוטם חולדות שיטת ההזרקה האיטית מונחית אקו לב שימשה להזרקת כדורי קרדיומיוציטים של חולדות יילודים או PBS (−) ללבבות האוטמים של חולדות מודל. הקבוצה שקיבלה הזרקת תאים בלבד הראתה שיפור משמעותי בתפקוד התכווצות הלב לאחר חודשיים (איור 4A). ניתוחים אימונוהיסטוכימיים חשפו קשר חלק בין התאים המושתלים לבין מיוציטים מארחים באמצעות דיסקים משולבים המכילים צמתי רווח (איור 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig01.jpg"> איור 1: סכמה של כל מערכת ההזרקה . (A) מנגנון הזרקה ראשי. (B) מערכת קירור מזרק הזרקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig02.jpg"> איור 2: הזרקה איטית מלעורית מונחית אקוקרדיוגרפיה . (A) הגדרת החיה, בדיקת הד ומנגנון ההזרקה. (B) מבט אקוקרדיוגרפי של המזרק המזריק והלב. שים לב שהתמונה השמאלית והימנית זהות, אך נוסף קו צהוב כדי לציין את מיקום המחט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig03.jpg"> איור 3: השפעת שיטת ההזרקה האיטית על נפח התא המושתל ועל שקיעת הקולגן . (A) נפחי התאים המושתלים (N=3) חושבו מקטעים טוריים. קווי השגיאה מציינים סטיות תקן. *P < 0.01 במבחן t לא מזווג. (B) צביעה אימונוהיסטוכימית לקולגן מסוג I. סרגל קנה המידה מציין 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig04.jpg"> איור 4: שיפורים בתפקוד הלב ואינטגרציה היסטולוגית עם כדורי קרדיומיוציטים שהושתלו בשיטת ההזרקה האיטית . (A) תצוגות אקו לב מייצגות במצב M. הגרף מראה את המעבר של קצרות שברים בקבוצה המושתלת כדורי קרדיומיוציטים (קו אדום מוצק; N = 4) וקבוצת הרכב (פתרון מתלה תאים לשיטת ההזרקה האיטית) (קו כחול מקווקו; N = 3). קיצורים: MI = אוטם שריר הלב; Cx43 = קונקסין 43; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; PKH26 = תווית קרום תא פלואורסצנטי אדום. קווי השגיאה מציינים את סטיות התקן. *P < 0.01 במבחן t זוגי. (B) ניתוחים אימונוהיסטוכימיים של הקשר בין כדורי קרדיומיוציטים מושתלים לבין קרדיומיוציטים מארחים. התצפיות המיקרוסקופיות הרגילות בלייזר באמצעות עדשה אובייקטיבית 2x מוצגות בטור השמאלי. גרסאות מוגדלות (באמצעות עדשה אובייקטיבית של 20x) של שני אזורים המוצגים בתיבה, המסומנים ב- * ו- #, מוצגות להלן. פסי קנה מידה: תמונה עליונה = 300 מיקרומטר; * ו- # = 30 מיקרומטר. תמונות מיקרוסקופיות לייזר קונפוקליות המשתמשות בעדשה אובייקטיבית של 20x מוצגות יחד עבור comaparison. מוצגות שלוש עמדות. בתמונות הממוזגות, ראשי החצים מצביעים על קיומם של צמתי מרווחים (Cx43) המחברים ישירות בין השתל לבין קרדיומיוציטים מארחים. סרגל קנה המידה מציין 30 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרטון משלים 1: שיטת הזרקה איטית מונחית הד. אקו לב במצב B בתצוגה הקדמית מראה את קצה מחט ההזרקה מתקדם לתוך שריר הלב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/Supplementary%20video.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion at JoVE.com

שיטה זו מבטלת כל פלישה גדולה במהלך הזרקות תאים הנגרמת על ידי תמיסת תרחיף התא.

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...

בעבודה זו, המטרה היא לשפר את היעילות של תרופות רגנרטיביות, במיוחד רפואה רגנרטיבית הלב באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. רפואה רגנרטיבית של הלב היא תחום המחקר התורם ביותר שלנו. הממצאים המשמעותיים שלי כוללים סלקציה מטבולית של קרדיומיוציטים, כלומר.דרך פשוטה ומסה לטיהור המוני עבור קרדיומיוציטים עם מצב תרבותי של גלוקוז נסוג ותוספת לקטט. ממצא נוסף כולל את שיטת ההשתלה היעילה של קרדיומיוציטים על ידי פרסום מוטות קרדיומיוציטים. שיטת השתלה זו עם מוטות קרדיומיוציטים אישרה את ההשתלה המשופרת של מוטות קרדיומיוציטים.עם זאת, חוסר אינטראקציה ישירה בין המארח לבין cardiomyocytes השתל נמצא. טכניקה זו מציעה פחות פלישות לרקמות המקבלות את זריקות התא. כתוצאה מכך, אינטראקציה ישירה בין המארח לבין cardiomyocytes השתל היה הקל.טכנולוגיה זו יכולה להפחית פציעות, תגובות דלקתיות, ובסופו של דבר פיברוזיס, כלומר היווצרות צלקות. יש לקוות שטכנולוגיה זו תיושם בדור הבא של תרופות רגנרטיביות, כולל רפואה רגנרטיבית ללב באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטים.כבר מצאנו מספר דרכים להביא ערך משמעותי לרפואה רגנרטיבית של הלב. מחקרים אלה יימשכו בעתיד.

a-novel-cell-injection-method-with-minimum-invasion

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

847 Views.  Kansai Medical University. בעבודה זו, המטרה היא לשפר את היעילות של תרופות רגנרטיביות, במיוחד רפואה רגנרטיבית הלב באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. רפואה רגנרטיבית של הלב היא תחום המחקר התורם ביותר שלנו. הממצאים המשמעותיים שלי כוללים סלקציה מטבולית של קרדיומיוציטים, כלומר.דרך פשוטה ומסה לטיה...

Video: מחבר זרקור: שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה  

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Preparation of the Neonatal Rat Cardiomyocyte Balls for the Slow Injection Method

Begin by measuring the neonatal Rat Ventricular Cardiomyocytes concentration using a hemocytometer. Dilute the cell suspension solution to 3, 000 cells per milliliter, with alpha MEM containing 10%heat inactivated FBS. Distribute 100 microliters of the diluted ventricular cardiomyocyte in each well of the cell's non-adhesive 96 well plates.Centrifuge the cells for five minutes at 100 G.And culture them for two to three days in the cell culture incubator, with 5%carbon dioxide at 37 degrees Celsius. After incubation, aspirate the culture medium from the Rat Cardiomyocyte balls seeded in the non-adhesive 96 well plate. Then, transfer the cardiomyocyte balls from each well to a 15 milliliter tube.Centrifuge the cardiomyocyte balls and aspirate the supernatant. Then, wash them using an ADS buffer. To facilitate the tracking of the cardiomyocyte cells in the Rat after engraftment, stain the cells with PKH26.Before centrifuging the cells, track the development of bidim cardiomyocyte balls by observing them under the microscope regularly after seeding. Begin preparing the main injection apparatus for a neonatal cardiomyocyte ball injection using a 29 gauge, 50 millimeter long needle equipped with a syringe. Connect an 18 gauge one milliliter power transfer syringe needle to a thin polypropylene tube with low lumen expandability.Aspirate the water using a syringe, and remove all the bubbles from the syringe and the connected tubes. Repeat it for another 18 gauge needle. Then, connect the other side of the power transfer tube to the 18 gauge needle of the same one milliliter syringe.Confirm the successful power transition by pushing one syringe plunger down, and another syringe plunger up. Once done, set the syringe in a syringe pump. Next, set up the cooling system by attaching the tightly coiled copper tube to the cell containing part of the cell injection syringe.Leaving 10 millimeter of excess pipe at both ends. Connect the copper tube to the flexible plastic tubing before connecting the other ends of the plastic tubing to an external pump. Fill the line with cooling water, and immerse the excess copper tube into crushed ice to cool the water.This cooling system maintains the cell suspension solution in the cylinder at approximately 2 degrees Celsius.

הכנת כדורי קרדיומיוציטים של חולדה יילודים לשיטת ההזרקה האיטית

Preparation of Cardiomyocytes and Setting-Up the Apparatus for the Slow Injection Method

Prepare the 10%gelatin stock solution by weighing and dissolving the gelatin in the ADS buffer, and autoclaving the solution. Rewarm the 10%gelatin stock at 37 degrees Celsius, until it becomes liquid. Then dilute the gelatin stock, using a prewarmed ADS buffer, to obtain the final injectable 5%gelatin solution.Suspend 96 cardiomyocyte balls in 100 microliters of prewarmed injection solution. Load the cardiomyocyte ball suspension into the cell injection syringe without aspirating the excess air. Next, hold the syringe vertically, with the needle facing upward, and tap the syringe to collect the bubbles at the upper ridge of the syringe.Also, observe the cardiomyocyte balls gradually settling onto the rubber seal of the plunger. Maintain the vertical position of the syringe, and slowly push the plunger to discard the bubbles and excess cell suspension solution, until 20 microliters of the cell suspension remain in the syringe, and the cardiomyocyte ball remains resting on the rubber seal of the plunger. Once done, immerse the capped syringe in an ice bath for five minutes, and fix the injection syringe apparatus on the animal stage before activating the main syringe pump during percutaneous cell transplantation in an anesthetized rat.