מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין לחוקרים צעירים (52207254 ו-82301657) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2022M711833).

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה את כל הניסויים בבעלי חיים והמחקרים נערכו בהתאם לתקנות הרלוונטיות לרווחת בעלי חיים.
1. הכנת בעלי חיים
<ol><li>חיות<ol><li>מידע על דיור: חולדות Sprague-Dawley זכרים (10-14 ימים לאחר הלידה, P10-P14) בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים. הערה: תנאי החדר נשמרו ב 20 ° C ± 2 ° C, לחות: 50%-60%, עם מחזור אור / כהה של 12 שעות. לבעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים.</li>
		<li>תייגו את הנוירונים המוטוריים בנסיגה לאחור: הזריקו פלואורו-זהב (FG) לשריר הטיביאליס הקדמי ושריר הגסטרוקנמיוס הדו-צדדי (2% במי מלח סטריליים, 50 מיקרוליטר לשריר) כדי לתייג את הנוירונים המוטוריים יומיים לפני ההקרבה.</li>
	</ol></li>
	<li>פתרונות<ol><li>הכינו תמיסת חיתוך: ערבבו 120 mM כולין כלוריד, 2.6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1.25 mM NaH 2 PO4, 0.5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl 2, 1.3 mM חומצה אסקורבית, 15 mM גלוקוז. ערבבו מראש את התמיסה עם 95% O 2 ו-5% CO2 (התאימו ל-pH 7.4 עם KOH) למשך 30 דקות לפני הנתיחה והפריסה. מצננים את התמיסה עם קרח כתוש.</li>
		<li>הכנת נוזל מוחי מלאכותי (ACSF): לערבב 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4; 1.3 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ו-10 mM גלוקוז. יש לבעבע מראש את התמיסה עם 95% O 2 ו-5% CO2 למשך 30 דקות לפני הדגירה.</li>
		<li>הכנת תמיסה תוך-תאית: לערבב 126 mM K-Gluconate, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0.4mM Na2 GTP, 10 mM K-Phosphocreatine, ו 0.5% Neurobiotin (pH 7.25 ו 305 mOsm / Kg). מצננים את התמיסה עם קרח כתוש.</li>
		<li>הכינו ג'ל אגרוז בהתכה נמוכה: המסו 4 גרם אגרוז ב-100 מ"ל של תמיסת חיתוך, והשתמשו ברוטור ערבוב מגנטי כדי להמיס אותו במלואו. ב 30 דקות לפני ההטבעה, לחמם את נקודת ההתכה נמוכה agarose בתנור מיקרוגל עם עוצמה גבוהה במשך 1 דקות, ולאחר מכן להעביר אותו לתוך אמבט מים 39 ° C כדי לשמור על המצב הנוזלי.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מכשירים<ol><li>הניחו קרח כתוש על מגש הזילוח (איור משלים 1A) 10 דקות לפני הזילוח. הניחו את המגש האנטומי (איור משלים 1B) ואת מגש החיתוך (איור משלים 1C) עם רצועת מים בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה מראש.</li>
		<li>מניחים את תא הדגירה עם רשת ניילון בתנור ב 45 מעלות צלזיוס לילה מראש.</li>
		<li>השתמשו באגרוז בנקודת התכה נמוכה כדי ליצור מראש שיפוע של 35° ופלטפורמה בעובי 2 מ"מ (איור משלים 1D). לאחר התמצקות הג'ל, הניחו אותם במרכז צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ כדי לתמוך בחוט השדרה בהליכים הבאים.</li>
	</ol></li>
	<li>זילוח תוך לבבי<ol><li>מרדימים את החולדות עם 2.5% טריברומואתנול (160 μL/10 גרם) באמצעות הזרקה תוך צפקית. ודאו שהחולדות מורדמות לחלוטין על ידי אימות חוסר התגובה לגירויים חיצוניים, כגון צביטה עדינה של הבוהן.</li>
		<li>כאשר ההרדמה המתאימה מאושרת, מניחים את החולדות בשכיבה ומשתקים אותן בצלחת פטרי מלאה בג'ל סיליקה.</li>
		<li>חותכים חתך עור אורכי של 5 מ"מ באופן קאודלי לתהליך הקסיפואיד, ולאחר מכן מרחיבים באופן מלא את החלל התת עורי. חתכו חתך עור אורכי בקוטר 2 ס"מ לאורך קו האמצע הגחוני כדי לחשוף באופן מלא את דופן החזה החיצונית, החל מהחתך הנ"ל וכלה בחלק העליון של החזה.</li>
		<li>השתמשו בפינצטה עם שיניים כדי להרים את הקסיפואיד (איור משלים 2A), ואז השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את הסרעפת. חתכו את עצם החזה לאורך שני הצדדים של תהליך הקסיפואיד כדי לפתוח את בית החזה ולחשוף את הלב (איור משלים 2B). הערה: יש להקפיד לשמר את כלי החזה הפנימיים משני הצדדים; אחרת, זה עלול לגרום לדימום מסיבי.</li>
		<li>השתמש בפינצטה חסרת שיניים כדי להרים את החדר השמאלי. הכניסו מחט 22G לקודקוד החדר השמאלי לאורך ציר האורך של החדר השמאלי (איור משלים 2C). בינתיים, שימו לב לפעימת הדם הקצבית בצינור הזילוח, או שהמחט עלולה לנקב בחדר הימני, מה שעלול להוביל לאפקט זילוח גרוע. הערה: אין להשתמש בפינצטה עם שיניים; אחרת זה עלול לגרום לדליפת דם נוספת מאתר החזקת הפינצטה.</li>
		<li>השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את האטריום הימני (איור משלים 2C), ואז הזריקו ידנית 100 מ"ל של נוזל מחורר קר כקרח בקצב של כ-2 מ"ל/שנייה תוך דקה אחת. הערה: כאשר הכבד והכפות של חולדות מחווירים, ולא זורם דם מהאטריום הימני, ניתן להשיג זילוח טוב.</li>
	</ol></li>
	<li>דיסקציה של חוט השדרה (איור 1)<ol><li>הניחו את החולדה במצב נוטה, וחתכו את עמוד השדרה בעמוד השדרה האיליאק העליון הקדמי (בערך L4 ברמת החוליות) ובנקודת הסטת העקמומיות של עמוד החזה (בערך רמת חוליה T6), בהתאמה (איור 1A). לאחר מכן, הניחו מיד את עמוד השדרה המבודד בתמיסה המחומצנת הקרה כקרח כדי לשטוף את שאריות הדם ורקמת השומן; הליך זה מועיל לשמירה על ניקיון השדה האופרטיבי בהליכים הבאים. הערה: השרירים הפארא-ספינליים צריכים להיות שמורים, מה שתורם לקיבוע הבא של עמוד השדרה באמצעות סיכת חרקים.</li>
		<li>העבירו מיד את עמוד השדרה המבודד למגש האנטומי (איור 1B) כאשר הצד הגבי כלפי מעלה והקצה הרוסטרלי קרוב למפעיל. מלאו את המגש האנטומי ב-50 מ"ל של תמיסת חיתוך קרה כקרח מחומצנת ברציפות (איור 1B).</li>
		<li>השתמשו בארבע סיכות חרקים כדי לקבע את עמוד השדרה על-ידי חדירה לשרירים הפארא-ספינליים (איור 1B).</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חתכו את הפדיקור של החוליות משני הצדדים מהקצה הרוסטרלי בעזרת המיקרו-מספריים, שניתן לכנותו "למינקטומיה" (איור 1C). שימו לב לא לפגוע בחוט השדרה. בינתיים, השתמש בפינצטה בעלת השיניים הזעירות כדי להרים את גוף החוליה החתוך.</li>
		<li>לאחר כריתת הלמינקטומיה, אין להפריד את חוט השדרה מתעלת עמוד השדרה באופן מיידי. במקום זאת, השתמשו במיקרו-מספריים כדי לחתוך את הדורה מאטר לאורך קו האמצע הגבי, אשר תורם לספיגת חומרי מזון בין תאים ו-ACSF מחומצן (איור 1D). הערה: לעולם אל תקרע את הדורה מאטר. רק חיתוך הדורה מאטר על ידי מיקרו-מספריים מותר; אחרת, שורש העצב והפרנכימה בעמוד השדרה ייפגעו קשות!</li>
		<li>הרימו את החלק הרוסטרלי של חוט השדרה, ואז חתכו בזהירות את שורש העצב עם כ-1 מ"מ שמורים (איור 1E). לאחר הפרדת חוט השדרה מתעלת החוליות, השתמשו בשתי סיכות חרקים כדי לקבע את חוט השדרה כשהצד הגחוני כלפי מעלה (איור 1F).</li>
		<li>השתמשו במיקרו-מספריים כדי לחתוך את הדורה מאטר לאורך קו האמצע הגחוני (איור 1F). חותכים את שורשי העצבים המיותרים עם כ 1 מ"מ שמור. הערה: העצב הרבה יותר עקשן מחוט השדרה. אם שורש העצב השמור ארוך מדי (>1 מ"מ), הוויברטום אינו יכול לחתוך את שורש העצב, מה שעלול להוביל לקרע רציני בפרנכימה בעמוד השדרה.</li>
		<li>השתמשו במיקרו-מספריים כדי להפריד את ההגדלה המותנית לאורך של 6-7 מ"מ (איור 1G).</li>
	</ol></li>
	<li>הטבעה באגרוז הנמס נמוך<ol><li>הניחו את ההגדלה המותנית בשיפוע של 35 מעלות (איור 1H) כאשר הצד הגבי כלפי מעלה והקצה הקאודלי כלפי מטה. השתמשו בנייר סינון סופג כדי להסיר מים בשפע על פני הרקמה (איור 1H).</li>
		<li>מזגו באיטיות את ג'ל האגרוז המותך לתוך צלחת פטרי שמכילה את ההגדלה המותנית (איור 1I). הערה: אין לשפוך מהר מדי, אחרת יצטברו בועות בג'ל.</li>
		<li>מניחים את צלחת הפטרי הנ"ל בתערובת מי קרח כדי לקרר את הג'ל בהקדם האפשרי, מה שתורם לשמירה על פעילות התאים.</li>
		<li>חתכו את הג'ל לקובייה בגודל 15 מ"מ x 10 מ"מ x 10 מ"מ והרכיבו אותו על דיסק הדגימה עם דבק-על (איור 1J).</li>
	</ol></li>
	<li>חיתוך<ol><li>הניחו את דיסק הדגימה במגש החיתוך הקפוא מראש, ולאחר מכן שפכו את תמיסת החיתוך הקרה כקרח (איור 1K). מבעבעים ברציפות עם 95% CO 2 ו-5% O2 לתוך מגש החיתוך.</li>
		<li>הגדר את פרמטרי הוויברטום: עובי: 350 מיקרומטר; מהירות: 0.14-0.16 מ"מ לשנייה, משרעת: 1.0 מ"מ ותדר רטט: 85 הרץ.</li>
		<li>קצרו 2-3 פרוסות מתאימות לכל בעל חיים. רשמו 1-2 תאי עצב מוטוריים בריאים מסוג FG+ בכל פרוסה, עם טווח של 5-6 תאים לכל חיה.</li>
	</ol></li>
	<li>דגירה<ol><li>השתמשו בפינצטה של שקף הכיסוי כדי לחתוך פרוסה (איור 1L) והכניסו אותה לתא הדגירה המלא ב-ACSF מחומצן ברציפות. הניחו את תא הדגירה באמבט מים בטמפרטורה של 32°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן המשיכו לדגור עליו בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות נוספות לפני ההקלטה. הערה: ההליכים לעיל, מהרדמה ועד קבלת הפרוסה הראשונה, צריכים להסתיים תוך 20-30 דקות כדי לשמור על הכדאיות של התאים ככל האפשר. הנוירונים המוטוריים בכל פרוסה יכולים לשמור על יכולת הקיום שלהם במשך כ-6-7 שעות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הקלטת מהדק טלאי עם SCS (איור 2)
<ol><li>ההכנות<ol><li>יש לנקב את תא ההקלטה עם ACSF מבעבע ברציפות בקצב של כ-1-2 מ"ל/דקה. כוונן את קצב הזרימה בנפרד באמצעות לוח הבקרה במשאבה הפריסטלטית.</li>
		<li>הכניסו פרוסה לתא ההקלטה. השתמש בחוט פלטינה בצורת U עם חוטי ניילון כדי לייצב היטב את הפרוסה במקומה.</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ ניגודיות הפרדה אדום (IR-DIC) כדי לצפות בפרוסה. תחת עדשת 4x אובייקטיבית, לאשר כי אורך השורש הגבי הוא כ 1 מ"מ. מצא את האזור שבו השורש הגבי נכנס לפרנכימה, ולאחר מכן העבר את שדה הראייה המרכזי לאזור זה.</li>
		<li>חברו את מחולל הדופק באמצעות אלקטרודות מותאמות אישית (איור 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>תצורת SCS<ol><li>מקמו את האנודה של SCS ליד קו האמצע הגבי דרך מערכת המיקרומניפולציה (איור 2B).</li>
		<li>מקמו את הקתודה של SCS ליד אזור הכניסה של השורש הגבי (DREZ) דרך מערכת המיקרומניפולציה (איור 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>מיקוד והדמיה של תאים<ol><li>השתמש IR-DIC עם עדשה אובייקטיבית 10x למצוא בערך את האזור הדורסולטרלי של העמודה המוטורית, שבו רוב הנוירונים המוטוריים ממוקמים. לאחר מכן, העבר את שדה הראייה המרכזי לאזור זה.</li>
		<li>עברו לעדשה אובייקטיבית פי 60 כדי למצוא תא עצב בריא עם משטח חלק ובהיר וגרעינים בלתי נראים (איור 2C,F).</li>
		<li>הנמיכו מעט את עוצמת האינפרא-אדום והפעילו את מקור האור הפלואורסצנטי. העבירו את מסנן האור למסנן העירור האולטרה-סגול בפס רחב (איור 2D,G), כדי לבחור נוירון מוטורי חיובי ל-FG (FG+) מתאים (איור 2E,H).</li>
		<li>השתמש באלקטרודות יניקה כדי להחיל גירוי סף מנוע 1x על השורש הגבי. אם פוטנציאל פעולה מעורר מזוהה בתאי העצב המוטוריים (איור משלים 3), הוא מאשר שהפעילות של השורש הגבי תקינה. אם לא, יש לזרוק פרוסה זו.</li>
	</ol></li>
	<li>הקלטת מהדק טלאי<ol><li>ממלאים את המיקרופיפטה בתמיסה התוך תאית ומכניסים אותה למחזיק האלקטרודות. השתמש במערכת micromanipulation כדי להוריד את פיפטה לתוך האמבטיה ACSF. התנגדות פיפטה נע בין 5-8 MΩ.</li>
		<li>החל כמות קטנה של לחץ חיובי על פיפטה כדי לפוצץ את האבק ואת פסולת התא.<ol><li>הנמיכו את האלקטרודה כדי להתקרב לתא. כאשר פיפטה נוגעת בפני השטח של נוירון FG+, כניסה קטנה של הממברנה הופכת גלויה ברמת הקצה. שחררו את הלחץ החיובי.</li>
			<li>לאחר מכן, להחיל כמות קטנה של לחץ שלילי על פיפטה באמצעות מזרק. זה יוצר כמות קטנה של יניקה שמושכת את קרום התא למגע עם פיפטת הזכוכית. שים לב תמיד להתנגדות הכוללת בממשק התוכנה עד שערך ההתנגדות עולה לג'יגה (>1 GΩ). לאחר מכן, gigaseal נוצר.</li>
		</ol></li>
		<li>הדקו את פוטנציאל הממברנה ב- -70 mV, ולאחר מכן לחצו על כפתור פיצוי הקיבול המהיר בממשק התוכנה של המגבר. הפעילו בעדינות לחץ שלילי חולף כדי לקרוע את קרום התא, ולאחר מכן לחצו על כפתור פיצוי הקיבול האיטי בממשק התוכנה של המגבר. בשלב זה, מתקבלת תצורה טובה של תא שלם.</li>
		<li>עבור למצב מהדק זרם על ידי לחיצה על לחצן IC בממשק התוכנה ורשום את פוטנציאל קרום המנוחה (RMP).</li>
		<li>החל את SCS עבור 1-2 s עם משרעת של 1-10 mA, בעוד רוחב הדופק ואת התדר קבועים ב 210 μs ו 40 הרץ, בהתאמה. קבע את סף המנוע על ידי הגדלה איטית של משרעת הגירוי עד לנקודת הגישה הראשונה.</li>
		<li>הבחינו בין נוירונים מוטוריים בירי מושהה ומיידי באמצעות הזרקת זרם דה-פולריזציה של 5 שניות סביב בסיס הריאו במצב מהדק זרם10,11,12. נוירונים מוטוריים יורים מיידית: בסיס נמוך יכול לגרום לירי מיידי וחוזר ונשנה עם תדירות ירי יציבה; נוירונים מוטוריים של ירי מושהה: בסיס גבוה יכול לגרום להתחלה מאוחרת של ירי חוזר עם קצב ירי מואץ (איור 3).</li>
		<li>כאשר SCS כבוי, המשך לתעד את פוטנציאל הממברנה ללכידת הירי הספונטני של נקודות גישה.</li>
		<li>בצע הקלטות מהדק מתח הקלטות מהדק מתח עבור זרם פוסט-סינפטי מעורר (EPSC) כאשר SCS מופעל וכבוי. פרמטר הגירוי הוא סף מנוע 1x, 210 μs, 2 הרץ.</li>
	</ol></li>
</ol>

הבנת תגובות נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה

<ol>
	<li>Rowald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+spinal+cord+neuromodulation+rapidly+restores+trunk+and+leg+motor+functions+after+complete+paralysis.">Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis.</a> Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).</li><li>Kathe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurons+that+restore+walking+after+paralysis.">The neurons that restore walking after paralysis.</a> Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).</li><li>Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distribution+of+calcium+signals+in+squid+presynaptic+terminals.">The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals.</a> The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).</li><li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse+by+presynaptic+delayed+rectifier+potassium+current.">Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current.</a> The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).</li><li>Llin&#225;s, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraterminal+injection+of+synapsin+I+or+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+alters+neurotransmitter+release+at+the+squid+giant+synapse.">Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).</li><li>Formento, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+spinal+cord+stimulation+must+preserve+proprioception+to+enable+locomotion+in+humans+with+spinal+cord+injury.">Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).</li><li>Hari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+facilitates+spike+propagation+through+branch+points+of+sensory+axons+in+the+spinal+cord.">GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+oblique+spinal+cord+slices+for+ventral+root+stimulation.">The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).</li><li>Sharples, S. A., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+persistent+and+hyperpolarization-activated+inward+currents+shapes+the+differential+activation+of+motoneuron+subtypes+during+postnatal+development.">Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development.</a> Elife. 10, e71385 (2021).</li><li>Bhumbra, G. S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+between+motoneurones+propagates+across+segments+and+is+purely+glutamatergic.">Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic.</a> PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, 04046 (2014).</li><li>Tahir, R. A., Pabaney, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+hypothermia+and+ischemic+stroke:+A+literature+review.">Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review.</a> Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+intractable+pain+in+patients+with+implanted+spinal+cord+stimulation+devices+during+the+COVID-19+pandemic+using+a+remote+and+wireless+programming+system.">Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).</li><li>Yao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wireless+epidural+electrical+stimulation+in+combination+with+serotonin+agonists+improves+intraspinal+metabolism+in+spinal+cord+injury+rats.">Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats.</a> Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).</li><li>Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+terminal+polarization+induced+by+weak+uniform+dc+electric+fields:+a+modeling+study.">Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study.</a> 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).</li><li>Espino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na(V)1.1+is+essential+for+proprioceptive+signaling+and+motor+behaviors.">Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors.</a> Elife. 11, e79917 (2022).</li><li>Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+rheostat:+Kv2.1+currents+maintain+or+suppress+repetitive+firing+in+motoneurons.">A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons.</a> The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+R-type+human+Ca(v)2.3+channel+reveal+conformational+crosstalk+of+the+intracellular+segments.">Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments.</a> Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).</li><li>Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+multimodal+neural+transmission+suggests+that+adult+spinal+networks+maintain+an+intrinsic+state+of+readiness+to+execute+sensorimotor+behaviors.">Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors.</a> Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).</li><li>Manuel, M., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intracellular+recording+of+a+lumbar+motoneuron+and+the+force+produced+by+its+motor+unit+in+the+adult+mouse+in+vivo.">Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).</li><li>Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonhomogeneous+volume+conduction+effects+affecting+needle+electromyography:+an+analytical+and+simulation+study.">Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study.</a> Physiological Measurement. 42 (11), (2021).</li><li>Barra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidural+electrical+stimulation+of+the+cervical+dorsal+roots+restores+voluntary+upper+limb+control+in+paralyzed+monkeys.">Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys.</a> Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).</li><li>Powell, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidural+stimulation+of+the+cervical+spinal+cord+for+post-stroke+upper-limb+paresis.">Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis.</a> Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).</li><li>Wenger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+neuromodulation+therapies+engaging+muscle+synergies+improve+motor+control+after+spinal+cord+injury.">Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).</li><li>&#214;zyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+longitudinal+lumbar+spinal+cord+preparations+to+study+sensory+and+recurrent+motor+microcircuits+of+juvenile+mice.">In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).</li><li>Moraud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+the+neuromodulation+of+spinal+circuits+for+correcting+gait+and+balance+deficits+after+spinal+cord+injury.">Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury.</a> Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).</li><li>Capogrosso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+model+for+epidural+electrical+stimulation+of+spinal+sensorimotor+circuits.">A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits.</a> Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).</li></ol>

מידע התנועה המווסת על ידי SCS מתכנס לבסוף לנוירונים המוטוריים. לכן, לקיחת הנוירונים המוטוריים כיעד המחקר עשויה לפשט את תכנון המחקר ולחשוף את מנגנון הנוירומודולציה של SCS באופן ישיר יותר. כדי לתעד בו זמנית מאפייני גירוי מגוונים ותגובות תאיות, מהדק טלאי הוא שיטה טובה לחקור את המאפיינים האלקטר?...

גירוי חוט השדרה (SCS) יכול לשחזר ביעילות את תפקוד המנוע לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI). אנדריאס רווואלד ועמיתיו דיווחו כי SCS מאפשר תפקוד של מנוע הגפיים התחתונות ותא המטען בתוך יום אחד1. חקר המנגנון הביולוגי של SCS להתאוששות מוטורית הוא תחום מחקר קריטי וטרנדי לפיתוח אסטרטגיית SCS מדויקת יותר. לדוגמה, הצוות של גרגואר קורטין הראה כי נוירונים מעוררים Vsx2 ונוירונים Hoxa10 בחוט השדרה הם תאי העצב העיקריים לתגובה ל-SCS, ונוירומודולציה ספציפית לתא אפשרית כדי לשחזר את יכולת ההליכה של חולדה לאחר SCI2. עם זאת, מחקרים מעטים מתמקדים במנגנון החשמלי של SCS בקנה מידה של תא יחיד. אף על פי שידוע היטב כי גירוי הזרם הישר העל-גבי יכול לעורר את פוטנציאלי הפעולה (APs) בניסוי הדיונון הקלאסי 3,4,5, עדיין לא ברור כיצד הגירוי החשמלי הפועם לסירוגין, כגון SCS, משפיע על יצירת האות המוטורי.
בהתחשב במורכבות של מעגלים עצביים תוך שדרתיים, בחירה מתאימה לאוכלוסיית תאים חשובה לחקר המנגנון החשמלי של SCS. למרות ש-SCS משחזר את התפקוד המוטורי על-ידי הפעלת המסלול הפרופריוספטיבי6, הנוירונים המוטוריים הם היחידה הסופית לביצוע הפקודה המוטורית, הנגזרת משילוב קלט מידע פרופריוספציה7. לכן, לימוד ישיר של המאפיינים החשמליים של נוירונים מוטוריים עם SCS יכול לעזור לנו להבין את ההיגיון הבסיסי של אפנון מוטורי בעמוד השדרה.
כידוע, מהדק טלאי היא השיטה הסטנדרטית להקלטה אלקטרופיזיולוגית תאית ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה במיוחד8. לכן, מחקר זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים ל-SCS. בהשוואה למהדק טלאימוח 9, מהדק המדבקה של חוט השדרה קשה יותר מהסיבות הבאות: (1) חוט השדרה מוגן על ידי תעלת החוליות בנפח זעיר, מה שדורש מיקרומניפולציה עדינה מאוד ותחזוקה קפדנית של קור כקרח כדי להשיג יכולת קיום טובה יותר של התא. (2) מכיוון שחוט השדרה דק מכדי להיות מאובטח על מגש החיתוך, יש לטבול אותו באגרוז בנקודת התכה נמוכה ולקצץ אותו לאחר התמצקותו.
לפיכך, שיטה זו מספקת פרטים טכניים בניתוח חוט השדרה ושמירה על כדאיות התא בו זמנית כדי ללמוד בצורה חלקה את המנגנון החשמלי של SCS על נוירונים מוטוריים ולמנוע ניסויים וטעויות מיותרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide tweezers</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>36A-SA</td>
			<td>Clip a slice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12006-10</td>
			<td>Cut the diaphragm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Label the motor neuron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MTI</td>
			<td>IR-1000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument&#160;</td>
			<td>MP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors&#160;</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>wa1020</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for anatomy</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for ecletrophysiology</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-toothed tweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11008-09</td>
			<td>Lift the cut vertebral body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens for ecletrophysiology</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>working distance 2 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer&#160;</td>
			<td>Advanced&#160;</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Axon&#160;</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp digitizer</td>
			<td>Axon&#160;</td>
			<td>Digidata 1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>FE28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor</td>
			<td>Multichannel system</td>
			<td>SHD-27H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal cord stimulatior</td>
			<td>PINS</td>
			<td>T901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed tweezer</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F13030-10</td>
			<td>Lift the xiphoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide band ultraviolet excitation filter</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>U-MF2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ex vivo preparation of spinal cord slice for the whole-cell patch-clamp recording in motor neurons during spinal cord stimulation

גירוי חוט השדרה (SCS) יכול לשחזר ביעילות את תפקוד המנוע לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI). מאחר שהנוירונים המוטוריים הם היחידה האחרונה לביצוע התנהגויות סנסומוטוריות, לימוד ישיר של התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים באמצעות SCS יכול לעזור לנו להבין את ההיגיון הבסיסי של אפנון מוטורי בעמוד השדרה. כדי לתעד בו זמנית מאפייני גירוי מגוונים ותגובות תאיות, מהדק טלאי הוא שיטה טובה לחקור את המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים בקנה מידה של תא יחיד. עם זאת, ישנם עדיין כמה קשיים מורכבים בהשגת מטרה זו, כולל שמירה על כדאיות התא, הפרדה מהירה של חוט השדרה מהמבנה הגרמי, ושימוש ב- SCS כדי לגרום בהצלחה לפוטנציאלי פעולה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט באמצעות מהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים ל- SCS עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכול לעזור לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ושמירה על כדאיות התא בו זמנית לחקור בצורה חלקה את המנגנון החשמלי של SCS על נוירון מוטורי ולהימנע מניסוי וטעות מיותרים.

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Andreas Rowald et al. reported that SCS enables lower limb locomotor and trunk function within a single day1. Exploring the biological mechanism of SCS for locomotor recovery is a critical and trending research field for developing a more precise SCS strategy. For example, Gr&#233;goire Courtine&#39;s team demonstrated that excitatory Vsx2 interneuron and Hoxa10 neurons in the spinal cord are the key neurons to response to SCS, and cell-specific neuromodulation is feasible to restore the rat walking ability after SCI2. However, few studies focus on the electrical mechanism of SCS at a single-cell scale. Although it is well-known that the suprathreshold direct current stimulus can elicit the action potentials (APs) in the classic squid experiment3,4,5, how the pulsed alternating electrical stimulation, such as SCS, affects the motor signal generation is still unclear.
Given the complexity of intraspinal neural circuits, appropriate selection for cell population is important for investigating the electrical mechanism of SCS. Although SCS restores motor function by activating the proprioceptive pathway6, the motor neurons are the final unit to execute the motor command, derived from integrating proprioception information afferent input7. Therefore, directly studying the electrical characteristics of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation.
As we know, patch-clamp is the golden-standard method for cellularly electrophysiological recording with extremely high spatiotemporal resolution8. Therefore, this study describes a method using a patch clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS. Compared with the brain patch-clamp9, the spinal cord patch-clamp is more difficult due to the following reasons: (1) The spinal cord is protected by the vertebral canal with tiny volume, which requires very fine micromanipulation and rigorous ice-cold maintenance to obtain better cell viability. (2) Because the spinal cord is too slender to be secured on the cutting tray, it should be immersed in low-melting point agarose and trimmed after solidification.
Hence, this method provides technical details in dissecting the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time so as to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neurons and avoid unnecessary trials and mistakes.

מחבר זרקור: קידום גירוי חוט השדרה - חקר התגובות התאיות של נוירונים מוטוריים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי 

הכנת Ex vivo של פרוסת חוט השדרה להקלטת מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים במהלך גירוי חוט השדרה

Spinal cord stimulation can help patients resolve most motion functions after injury. Most neurons are to execute sensory mode behaviors. Studying the electric response of most neurons can aid in understanding the underlying logic of spinal load neuromodulation.A patch clamp is the golden standard method for cellular electrophysiological recordings with the extremely high spatial temporal resolution. Therefore, this study describes a method using a patch clamp to simultaneously record the aortas stimulus characteristics and cellular responses of motor neurons at a single-cell scale. Compared with the brain patch clamp, the spinal cord patch clamp is more difficult, because the spinal cord is well protected by the vertebral canal with tiny volume.Therefore, this protocol provides technical details in quickly micro dissecting the spinal cord and reverse maintenance to obtain better cell viability. Patch clamp allows a unique understanding of the synaptic transmissions and the understanding of action potentials, coding pattern activities by the spinal cord stimulation.

הודות לתחזוקה הקפדנית בטמפרטורה נמוכה במהלך הפעולה העדינה (איור משלים 1, איור משלים 2 ואיור 1), יכולת הקיום של התא הייתה טובה מספיק כדי לבצע רישומים אלקטרופיזיולוגיים עוקבים. כדי לדמות את התרחיש הקליני ככל האפשר, השתמשנו במיקרומניפולציה כדי למקם את הקתודה והאנודה ש...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the Cellular Responses of Motor Neurons Through Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה (SCS) ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכולה לסייע לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ובשמירה על קיום התא בו זמנית.

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

גירוי חוט השדרה יכול לעזור לחולים לפתור את רוב תפקודי התנועה לאחר פציעה. רוב תאי העצב אמורים לבצע התנהגויות של מצב חושי. חקר התגובה החשמלית של רוב תאי העצב יכול לסייע בהבנת ההיגיון הבסיסי של נוירומודולציה של עומס בעמוד השדרה.מהדק טלאי הוא שיטת תקן הזהב לרישומים אלקטרופיזיולוגיים תאיים עם רזולוציה טמפורלית מרחבית גבוהה במיוחד. לכן, מחקר זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לרשום בו זמנית את מאפייני הגירוי של אבי העורקים ואת התגובות התאיות של נוירונים מוטוריים בקנה מידה של תא יחיד. בהשוואה למהדק טלאי המוח, מהדק טלאי חוט השדרה קשה יותר, מכיוון שחוט השדרה מוגן היטב על ידי תעלת החוליות בנפח זעיר.לכן, פרוטוקול זה מספק פרטים טכניים בניתוח מיקרו מהיר של חוט השדרה ותחזוקה לאחור כדי להשיג כדאיות תאים טובה יותר. מהדק טלאי מאפשר הבנה ייחודית של השידורים הסינפטיים והבנה של פוטנציאלי פעולה, קידוד פעילויות דפוס על ידי גירוי חוט השדרה.

the-ex-vivo-preparation-spinal-cord-slice-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

1.5K Views.  Tsinghua University. גירוי חוט השדרה יכול לעזור לחולים לפתור את רוב תפקודי התנועה לאחר פציעה. רוב תאי העצב אמורים לבצע התנהגויות של מצב חושי. חקר התגובה החשמלית של רוב תאי העצב יכול לסייע בהבנת ההיגיון הבסיסי של נוירומודולציה של עומס בעמוד השדרה.מהדק טלאי הוא שיטת תקן הזהב לרישומים אלקטרופ?...

Video: מחבר זרקור: קידום גירוי חוט השדרה - חקר התגובות התאיות של נוירונים מוטוריים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי 

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

Spinal Cord Dissection for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons

After exposing the heart of an anesthetized rat, cut the right atrium using fine scissors and inject 100 milliliters of chilled perfusing fluid at approximately two milliliters per second within one minute. Position the rat in the prone position. Cut the spine at the anterior superior iliac spine and the curvature shifting point of the thoracic column.Immediately place the isolated spine into the oxygenated ice cold perfusing solution to wash off residual blood and fat tissue. Then transfer the isolated spine to the anatomical tray with its dorsal side up and the rostral end near the operator. Fill the tray with 50 milliliters of continuously oxygenated ice cold cutting solution.Under a dissection microscope, cut the vertebral pedicles on both sides from the rostral end using micro scissors. Next, delicately sever the dura mater along its dorsal midline with micro scissors. Lift the rostral part of the spinal cord carefully and cut the nerve root, leaving about one millimeter reserved.After the spinal cord has been separated from the vertebral canal, secure it with the ventral side facing up using two insect pins. Trim any excessive nerve roots, leaving about one millimeter intact. Then separate the lumbar enlargement to a length of six to seven millimeters using a micro scissor.

דיסקציה של חוט השדרה לרישום מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים

Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons

After dissecting the spinal cord and separating the lumbar enlargement, place the lumbar enlargement on a 35 degree slope with the dorsal side up and the caudal side down. Absorb any excess water on the tissue surface using an absorbent filter paper. Carefully pour the molten agarose gel into the Petri dish containing the lumbar enlargement.Position the Petri dish in the ice water mixture to ensure rapid gel cooling. Shape the gel into a cube of 15 by 10 by 10 millimeters, and mount it onto the specimen disc using super glue. Adjust the vibratome settings to a thickness of 350 micrometers, a speed of 0.14 to 0.16 millimeters per second, an amplitude of one millimeter, and a vibration frequency of 85 hertz.Now, use the cover slide tweezers to clip a slice and place it into the incubation chamber, filled with continuously oxygenated artificial cerebrospinal fluid.

הכנת פרוסת חוט השדרה לרישום מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים

Patch-Clamp Recording to Study the Electrical Responses of Motor Neurons to Spinal Cord Stimulation

To begin, place the prepared spinal cord slice in the recording chamber. Then place the anode of the micro-manipulation system near the dorsal midline in the cathode close to the dorsal root entry zone for proper spinal cord stimulator positioning. Now switch to a 60X objective lens to identify a healthy neuron having a smooth and bright surface without visible nuclei.Slightly decrease the infrared intensity, turn on the fluorescent light source, and adjust the light filter to the wideband ultraviolet excitation option. Now, select an appropriate Fluoro-Gold-positive motor neuron and gradually lower the electrode until it is near the neuron. As the pipette contacts its surface, look for a small membrane indentation at the tip level and release the previously-applied positive pressure.Then apply negative pressure to the pipette using a syringe and wait until the resistance value rises to gigaohms on the software interface. Clamp the membrane potential at minus 70 millivolts. Press the fast capacitance compensation button on the amplifier's software interface, then apply a brief negative pressure to rupture the cell membrane and press the slow capacitance compensation button on the amplifier's software interface.Apply the spinal cord stimulation for one to two seconds keeping the amplitude between one and 10 milliamperes. Determine the motor threshold by gradually increasing the stimulation amplitude until the first action potential is observed. Distinguish delayed and immediate firing motor neurons using a five-second depolarizing current injection around rheobase in the current clamp mode.After turning off the spinal cord stimulation, continue recording the membrane potentials to capture the spontaneous action potentials firing. When the amplitude of spinal cord stimulation was raised, the membrane potential was increased, and the action potentials were triggered every 10 to 20 pulses. After the spinal cord stimulation was turned off, the neuron fired a series of spontaneous action potentials for a short period of time.Then, the resting membrane potential returned to minus 65 millivolts.