עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NFSC 82101224 to YG)

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו (מס' 2021-847) על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג.
1. עיקור והכנת חומרים
<ol><li>יש לעקר את כלי הדיסקציה באמצעות חיטוי קיטור בטמפרטורה גבוהה ובלחץ גבוה ולייבש אותם באינקובטור של 50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>הכינו מראש 100 מ"ל של מדיום התרבית המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-10 מ"ג/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (הוסיפו 10 מ"ל FBS ו-10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פניצילין ל-90 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (EMEM) של דולבקו) ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.</li>
</ol>2. דיסקציה והסרה של העצם הטמפורלית לאיסוף אפיתל שמיעתי
<ol><li>הרדימו מספר כולל של 10 עכברים שזה עתה נולדו (בגילאי P3 ו-P5) על ידי עריפת ראשים על קרח. השתמש במתודולוגיה חלופית שאושרה מבחינה אתית, במידת הצורך.</li>
	<li>החזיקו את הראש במקומו, פתחו את הקרקפת לאורך תפר הקשת באמצעות מספריים מיקרו-ניתוחיים, הפרידו וקיבעו את הקרקפת באופן דו-צדדי עם האצבעות, כפי שמוצג באיור 1A.</li>
	<li>הסר את המוח באמצעות מעלית פריאוסטאלית קטנה וחתך את גולגולת הבסיס. חותכים את הגולגולת במספריים והופכים קדימה כדי לפתוח את הגולגולת; השתמש בקצה המספריים כדי לגרד את המוח ולחשוף את בסיס הגולגולת.</li>
	<li>התבוננו בעצמות הרקתיות הדו-צדדיות בבסיס הגולגולת (איור 1C). השתמשו במספריים כדי לחתוך את בסיס הגולגולת לאורך קו האמצע, לגרד את העור ולהסיר עצם מיותרת (איור 1D,D').</li>
	<li>שמרו והעבירו את העצמות הרקתיות לצלחות פטרי סטריליות בקוטר 35 מ"מ המכילות תמיסת מלח מאוזנת טרייה של האנק (HBSS) (איור 1E).</li>
	<li>השתמשו בשני מלקחיים מחודדים #5 כדי להסיר את הבולה ואת הרקמה שמסביב מהחלק הפטרוסי של העצם הרקתית (איור 1E). הערה: בשלב זה, המבוך הגרמי בעצם הרקתית של העכברים לא יסתייד לחלוטין וניתן יהיה לנתח אותו בקלות באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>החזיקו את המלקחיים ביד אחת כדי לקבע את החלק החצי עגול של העצם הרקתית ותקעו את כף הרגל התחתונה של המלקחיים בגומחת החלון העגולה ביד השנייה כדי להפריד את העצם הצידית של השבלול מפרוזדור הסקאלה. בזהירות להסיר את החלק petrous של העצם הטמפורלית מבלי לגעת אפיתל OC. לאחר מכן, הפרידו בזהירות והסרו את המבוך הגרמי של השבלול מהקצה הבסיסי לקצה האפי (איור 1F).</li>
	<li>בזהירות מיקרו לבודד את האיבר של אפיתל חושי קורטי מן modiolus באמצעות מלקחיים #5 מחודדים (איור 1G).</li>
	<li>אחזו ברצועה הספירלית, הפרידו אותה בזהירות מהסטריה וסקולריס בעזרת מלקחיים מיקרו-ניתוחיים, והעבירו את אפיתל השמע הנקי לצלחת תרבית סטרילית בקוטר 3 מ"מ המכילה HBSS באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר (איור 1H).</li>
	<li>אספו 20 דגימות מכל חיה והעבירו אותן במהירות לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ שמכילה HBSS לשלב ההכנה הבא (איור 1).</li>
</ol>3. דיסאגרגציה אנזימטית לקבלת תאי שיער שמיעתיים
<ol><li>להעביר את אפיתל השמיעה ל 10 מ"ל של DMEM טרי המכיל 0.25% טריפסין לדגור ב 37 ° C במשך 12 דקות.</li>
	<li>בעזרת קצה פיפטה של 200 μL, מפרידים בעדינות את תאי השערה מהלמינה הבסיסית ותאים אחרים תחת מיקרוסקופ פעיל.</li>
	<li>הוסף עוד 10 מ"ל של מדיום תרבית כדי לעכב את disaggregation.</li>
	<li>מסננים את התאים המרחפים בתווך התרבית דרך מסנן 70 מיקרומטר, אוספים את התסנין בצינור נקי של 50 מ"ל וצנטריפוגות אותו ב 300 × גרם למשך 5 דקות.</li>
	<li>יש להשהות מחדש את תאי השערה בלפחות 5 מ"ל של מדיום תרבית על ידי הקפאתם בעדינות מעלה ומטה באמצעות קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר. הימנעו מהחדרת בועות.</li>
	<li>מניחים מראש מכסה בתחתית צלחת בת שש בארות. ספרו את התאים ותרבו אותם בצפיפות של 106 תאים / מ"ל בלוחות של שש בארות.</li>
	<li>לגדל את התאים הדבקים ב 2 מ"ל של DMEM (המכיל 10% של FBS, 100 יחידות / מ"ל של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין) ב 37 ° C ו 5% CO2. לשנות את המדיום התרבותי כל יום. הערה: יש לציין כי שימוש בפרוטוקול זה אינו מביא לקבלת תאי שיער טהורים. בהתבסס על שיטת תרבית תאים ראשונית זו, אנו ממליצים להשתמש בתאי d2 או d3 למחקרים נוספים, שכן תאי שיער עשויים להוות כ-70% מהתאים בתרבית ולהיות במצב טוב.</li>
</ol>4. צביעה אימונופלואורסצנטית
<ol><li>קצרו את התאים בתרבית מ-d1 עד d6 (באר אחת ביום). שאפו את מדיום התרבית ושטפו תאים פי 2 במי מלח חוצצי פוספט (PBS).</li>
	<li>תקן תאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הסר את התאים המקבעים ושטוף במשך 3 x 3 דקות עם PBS.</li>
	<li>חדרו את התאים עם PBS המכיל 0.2% Triton X-100 למשך 10 דקות ב-RT.</li>
	<li>לדגור את התאים permeabilized עם פתרון חסימה המורכב של 10% FBS ב PBS במשך 20 דקות ב RT.</li>
	<li>הכתימו את התאים בנוגדן חד-שבטי אנטי-מיוזין (מדולל ב-1:200 ב-PBS) ב-4°C למשך הלילה.</li>
	<li>שטפו את התאים 3x עם PBS סטרילי ודגרו עליהם עם נוגדן משני (Alexa Fluor 594 עז נגד ארנב MYO7A, מדולל 1:500 ב-PBS) ופלואידין עם תווית פלואורסצאין (Alexa Fluor 488, כדי לזהות את מבנה התא) במשך שעתיים ב-RT.</li>
	<li>שטפו את התאים 3x עם PBS כדי להסיר את הנוגדנים המשניים.</li>
	<li>הוסף 1-2 טיפות של אמצעי הרכבה עם DAPI על המגלשות, הרכיב את הכיסויים והנח אותם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר כדי לצלם תמונות של התאים.</li>
</ol>5. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>בצע ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו בדיקות פוסט-הוק של Tukey כדי לנתח את השינויים בערכים האפורים של מיוזין-VIIa ופאלואידין לאורך זמן. השתמש בשיטת סימון האותיות כדי לסמן הבדלים סטטיסטיים.</li>
	<li>בצע ANOVAs חד-כיווניים נוספים ולאחר מכן בדיקות פוסט-הוק של Tukey כדי להשוות את יחס התאים החיוביים לפאלואידין בין דגימות תאים מיום 1 ליום 6 לבין יחס התאים החיובי מיוזין-VII באותם ימים.</li>
</ol>

טיפוח יעיל במבחנה של תאי שיער של שבלול העכבר

<ol>
	<li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning.">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).</li><li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+hair+cells:+The+sound-sensing+machines.">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li><li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults.">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li><li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss.">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li><li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Hearing+Loss:+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions.">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).</li><li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction.">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells.">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants.">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).</li><li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures.">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li><li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication.">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex.">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).</li><li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+auditory+HEI-OC1+cells.">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti.">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046 (2017).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li><li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3,+VGLUT3,+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice.">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development.">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בהשוואה לקו התאים HEI-OC1, תרביות ראשוניות של תאי שיער שכפלו בצורה מדויקת יותר את המצב הפיזיולוגי של תאים in vivo. לכן, שיטת התרבית הראשונית השמיעתית שנקבעה על ידי בידוד תאים חיים מאיברי השבלול וטיפוחם המיידי נראית ככלי רב ערך למחקר מקיף על מערכות שמיעתיות. טכניקות מסוימות חיוניות לתרבות מצליחה....

תאי שיער של השבלול ממלאים תפקידים חשובים בזיהוי צלילים ובהעברת אותות לעצב השמיעה. תאי שיער הם תאים מכניסטיים המתפקדים כקולטני חישה ראשוניים וממירים תנודות קול לאותות חשמליים בבעלי חוליות. אפיתל החישה של האוזן הפנימית של היונקים מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים. באזורים בסיסיים שונים בממברנה, תאי השערה קולטים צלילים בתדרים שונים (בין 20 ל-2,000 הרץ)1. תפקידם של תאי השערה החיצוניים הוא תהליך הגברה מכני פעיל המסייע לכוונן את האוזן הפנימית של היונקים, ומעניק רגישות גבוהה לקול. תאי השערה הפנימיים אחראים על זיהוי צלילים. לאחר דפולריזציה מדורגת, מידע אקוסטי מועבר למוח דרך סיבי עצב השמיעה2.
ליקוי שמיעה עלול להיגרם על ידי פגמים גנטיים, הזדקנות, טראומה לרעש או שימוש מופרז בתרופות אוטוטוקסיות, המהוות דאגה בריאותית מרכזית ברחבי העולם 3,4. ליקוי שמיעה נובע בעיקר מנזק בלתי הפיך לתאי השערה5. בנוגע לאובדן שמיעה הנגרם כתוצאה מרעש, למרות שהחוקרים הגיעו להסכמה על מספר פרטים של האטיולוגיה שלו, חסרה הבנה מקיפה של המנגנונים הבסיסיים הרבים. תאי השערה החיצוניים פגיעים במיוחד לחשיפת יתר אקוסטית6. תאי שיער שבלול רגישים למכנו מעורבים באובדן שמיעה הקשור לגיל; עם זאת, המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס ניוון תאי השערה עדיין אינם ידועים. מספר שינויים בתהליכים המולקולריים מובילים להזדקנות תאי שיער, עקה חמצונית, תגובת נזק לדנ"א, אוטופגיה וחוסר ויסות של ביטוי ושעתוק גנים הקשורים להתמחות תאי השערה7.
מכיוון שהאוזן הפנימית עטופה בעצם הרקתית, עמוק בעצם הקשה ביותר בגוף, היא אינה נגישה באופן ניסיוני, מה שמציב אתגר לחקירת מנגנוני התיקון וההתחדשות של תאי השערה. לפיכך, הקמת תרביות חוץ גופיות לחקר תפקודם של תאי השערה הפכה לשיטה אידיאלית למחקר על מנגנוני ההתחדשות והפציעה של האוזן הפנימית. ההליכים להכנת תרביות אורגנוטיפיות שבלול תוארו במחקרים קודמים 8,9,10. חוקרים ברחבי העולם השתמשו בטכניקות שונות של מיקרודיסקציה של שבלול והכנת פני שטח. למרות האתגרים המתמשכים, מערכות שונות של תרביות תאי שיער ראשוניות הוקמו בהצלחה במבחנה. תרביות איברי שבלול מכילות סוגי תאים שונים, כולל תאי שיער, תאי דייטר, תאי הנסן, תאי עמוד וסיבי עצב שמיעתיים. הבנה מעמיקה של השינויים בתאי השערה ברמה התאית והמולקולרית לאחר פציעה תאפשר פיתוח כלי מחקר חזקים יותר. מחקר זה נועד להדגים את השלבים לבידוד איברי השבלול מעכברי יילודים ולניתוק אנזימטי של תאי השערה השופעים לצורך מחקרי מבחנה. אופי התאים בתרבית אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm BioLite cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Nunc cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well palate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>310109005</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>BD Company</td>
			<td>352350</td>
			<td>using for filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>A11008</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>day 3-5 neonatal murine&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>provided by Xi&#39;an Jiaotong University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5#</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica anatomy microscope</td>
			<td>Germany</td>
			<td>S9i</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit plyclonal to Myosin VIIa</td>
			<td>Abcam company</td>
			<td>ab92996</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Belevor</td>
			<td>10cm/04.0524.10</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice

תאי שיער שבלול הם קולטני החישה של מערכת השמע. תאים אלה ממוקמים באיבר של קורטי, איבר החישה האחראי על השמיעה, בתוך מבוך הגלוסקמה של האוזן הפנימית. תאי שיער של השבלול מורכבים משני סוגים שונים מבחינה אנטומית ותפקודית: תאי שיער חיצוניים ופנימיים. נזק לכל אחד מהם גורם לאובדן שמיעה. יש לציין כי תאי השערה הפנימיים אינם יכולים להתחדש, והנזק להם הוא קבוע. לפיכך, טיפוח במבחנה של תאי שיער ראשוניים הוא הכרחי לחקר ההשפעות המגינות או המתחדשות של תאי שיער שבלול. מחקר זה נועד לגלות שיטה לבידוד וטיפוח תאי שיער של עכברים. 
לאחר הסרה ידנית של דופן השבלול הצידית, אפיתל השמע נותח בקפידה מהמודיולוס השבלול תחת מיקרוסקופ, הודגר בתערובת המורכבת מ-0.25% טריפסין-EDTA למשך 10 דקות ב-37°C, והושעה בעדינות בתווך תרבית באמצעות קצה פיפטה של 200 μL. תרחיף התאים הועבר דרך מסנן תאים, התסנין היה צנטריפוגי, והתאים גודלו בתרבית בלוחות של 24 בארות. תאי השערה זוהו על סמך יכולתם לבטא קומפלקס מכנוטרנסדוקציה, מיוזין-VIIa, המעורב במתחים מוטוריים, ובאמצעות תיוג סלקטיבי של F-אקטין באמצעות פאלואדין. התאים הגיעו למפגש של >90% לאחר 4D בתרבית. שיטה זו יכולה לשפר את הבנתנו את המאפיינים הביולוגיים של תאי שיער בתרבית חוץ גופית ולהדגים את היעילות של תרביות תאי שיער שבלול, ולבסס בסיס מתודולוגי מוצק למחקר שמיעתי נוסף.

Cochlear hair cells play important roles in sound detection and signal transmission to the auditory nerve. Hair cells are mechanistic cells that function as primary sensory receptors and convert sound vibrations into electrical signals in vertebrates. The sensory epithelium of the mammalian inner ear comprises a single row of inner hair cells and three rows of outer hair cells. In different basic membrane areas, hair cells perceive sounds at different frequencies (between 20 and 2,000 Hz)1. The function of outer hair cells is an active mechanical amplification process that helps fine-tune the mammalian inner ear, conferring high sensitivity to sound. Inner hair cells are responsible for detecting sounds. After graded depolarization, acoustic information is transmitted to the brain through the auditory nerve fibers2.
Hearing loss may be caused by genetic defects, aging, noise trauma, or the excessive use of ototoxic drugs, which constitute a major health concern worldwide3,4. Hearing loss mainly results from irreversible damage to hair cells5. Regarding noise-induced hearing loss, although researchers have reached a consensus on several details of its etiology, a comprehensive understanding of the numerous underlying mechanisms is lacking. Outer hair cells are particularly vulnerable to acoustic overexposure6. Mechanosensitive cochlear hair cells are involved in age-related hearing loss; however, the molecular and cellular mechanisms underlying hair cell degeneration remain unknown. Several changes in the molecular processes lead to hair cell aging, oxidative stress, DNA damage response, autophagy, and dysregulation of the expression and transcription of genes related to hair cell specialization7.
As the inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, it is experimentally inaccessible, posing a challenge to investigations into the mechanisms of hair cell repair and regeneration. Hence, establishing in vitro cultures for investigating the function of hair cells has become an ideal method for research on the regeneration and injury mechanisms of the inner ear. The procedures for preparing cochlear organotypic cultures have been described in earlier studies8,9,10. Investigators worldwide have employed various cochlear microdissection and surface preparation techniques. Despite the persistent challenges, various primary hair cell culture systems have been successfully established in vitro. Cochlear organ cultures contain various cell types, including hair cells, Deiters cells, Hensen&#39;s cells, pillar cells, and auditory nerve fibers. An in-depth understanding of the changes in hair cells at the cellular and molecular levels after injury will enable the development of more powerful research tools. This study aimed to demonstrate the steps for isolating cochlear organs from neonatal mice and enzymatically detaching the abundant hair cells for in vitro studies. The nature of the cultured cells was confirmed using immunofluorescence staining.

מחבר זרקור: התקדמות בטיפוח תאי שיער של עכברים למחקר שמיעתי 

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

The inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, posing a challenging to investigations. The cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells.We demonstrate the steps for isolating cochlear organs from your natural mice and asymmetrically detaching the abundant hair cells for in-vitro studies. The nature of the cultured cells, was confirmed using immunofluorescence staining. There are three primary culture method established by isolating living cells from cochlear organs, and immediately coaching them, pair to be a valuable tool for extensive research, are all three system.This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in-vivo cultured hair cells, and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

בעקבות פרוטוקול זה, זרענו את התאים המבודדים. זרעים ראשוניים של תאי שערת שבלול נחשבו מוצלחים אם התאים לא צפו בתווך התרבית והתפשטו תוך 24 שעות. קבענו את מספר תאי השערה לאחר שהם נדבקו והתפשטו לצברים שטוחים בתחתית המנה. לאחר יום אחד, תאי שיער חיים הודבקו בחוזקה לתחתית צלחת התרבית ותאים שאינם נדב...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Cultivating Mouse Hair Cells for Auditory Research at JoVE.com

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

האוזן הפנימית עטופה בעצם הרקתית, עמוק בעצם הקשה ביותר בגוף, מה שמציב אתגר לחקירות. טיפוח תאי שיער ראשוניים הוא הכרחי לחקר תאי שיער שבלול. מחקר זה נועד לגלות שיטה לבידוד וטיפוח תאי שיער של עכברים.אנו מדגימים את השלבים לבידוד איברי השבלול מהעכברים הטבעיים שלכם ולניתוק לא סימטרי של תאי השערה השופעים לצורך מחקרים במבחנה. אופי התאים בתרבית, אושר באמצעות צביעה immunofluorescence. ישנן שלוש שיטות תרבית עיקריות שנקבעו על ידי בידוד תאים חיים מאיברי השבלול, ואימון מיידי שלהם, זוג להיות כלי רב ערך למחקר מקיף, הן כל שלוש השיטות.שיטה זו יכולה לשפר את הבנתנו את המאפיינים הביולוגיים של תאי שיער בתרבית in-vivo, ולהדגים את היעילות של תרביות תאי שיער שבלול, ולבסס בסיס מתודולוגי מוצק למחקר שמיעתי נוסף.

isolation-culture-primary-cochlear-hair-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

1.6K Views.  The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. האוזן הפנימית עטופה בעצם הרקתית, עמוק בעצם הקשה ביותר בגוף, מה שמציב אתגר לחקירות. טיפוח תאי שיער ראשוניים הוא הכרחי לחקר תאי שיער שבלול. מחקר זה נועד לגלות שיטה לבידוד וטיפוח תאי שיער של עכברים.אנו מדגימים את השלבים לבידוד איברי השבלול מהעכברים הטבעיים שלכם ולניתוק לא ?...

Video: מחבר זרקור: התקדמות בטיפוח תאי שיער של עכברים למחקר שמיעתי 

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Dissection and Removal of the Temporal Bone to Collect Auditory Epithelia from Newborn Mice

To begin, securely hold the head of the euthanized newborn mice in place. Using micro operating scissors, open the scalp along the sagittal suture. Then, separate and immobilize the scalp bilaterally with the fingers.Use scissors to sever the cranium and flip it forward to access the skull. Employ a small periosteal elevator to extract the brain and then use the tip of the scissors to gently scrape the brain, revealing the base of the skull. Now, examine the bilateral temporal bones at the skull's base.Employ scissors to incise the base of the skull along the midline. Then, scrape off the skin and eliminate any unnecessary bone. Preserve and transfer the temporal bones to 35-millimeter sterile Petri dishes filled with fresh HBSS.Next, use a pair of 5 number pointed forceps to eliminate the bola and surrounding tissue from the petrous portion of the temporal bone. Hold the forceps with one hand to stabilize the semi-circular part of the temporal bone. Use the other hand to insert the lower tip of the forceps into the round window niche, separating the lateral bone of the cochlea from the scale of vestibule.Carefully remove the petrous portion of the temporal bone without contacting the Organ of Corti epithelium. Then, meticulously detach and extract the bony labyrinth of the cochlea, starting from the basal to the apical end. Using 5 number pointed forceps, carefully micro isolate the sensory epithelium of the Organ of Corti from the modiolus.Next, employ micro-operating forceps to hold the spiral ligament, and gently separate it from the stria vascularis. Transfer the clean auditory epithelium, using a 200 microliter pipette, to a three millimeter sterile culture dish containing HBSS. Place the isolated auditory epithelium in a 100 millimeter sterile Petri dish filled with HBSS for the subsequent preparation steps.

דיסקציה והסרה של העצם הרקתית לאיסוף אפיתליה שמיעתית מעכברים שזה עתה נולדו

Enzymatic Disaggregation of the Auditory Epithelium to Obtain Auditory Hair Cells

To begin, isolate the auditory epithelium from the temporal bone of newborn mice and transfer it to 10 milliliters of fresh DMEM containing 0.25%Trypsin, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 12 minutes. Using a 200 microliter pipette tip, gently separate the hair cells from the basal lamina and other cells using an operating microscope. Then add another 10 milliliters of culture medium to inhibit the disaggregation.Filter the suspended cells through a 70 micrometer filter. Collect the filtrate in a clean 50 milliliter tube and centrifuge it at 300G for five minutes. Using a 1000 microliter pipette tip, re suspend the hair cells in five milliliters of culture medium by gentle pipetting.Now place a cover slip at the bottom of a six well plate in advance. Count the cells and culture them at 10 to the sixth cells per milliliter density in the six well plate, grow the adherence cells in two milliliters of DMEM at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After one day of culturing the hair cells adhered firmly to the bottom of the dish.By the third day, the number of cells had doubled.