אנו מודים לחברי מעבדתו של פרופ' ג'ונהאי האן על הדיון וההערות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 32170970 ל- Y.T ו"פרויקט כחול ציאנין" של מחוז ג'יאנגסו ל- Z.C.Z.

פרוטוקול זה משתמש בזבובי w1118 בני 30 יום ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (BDSC_3605, ראה טבלת חומרים).
1. הכנת זבובי הפירות המיושנים
<ol><li>הכנת מזון<ol><li>הכינו תרבית עמילן תירס סטנדרטית על ידי ערבוב 50 גרם / ליטר קורנפלקס, 110 גרם / ליטר סוכר, 5 גרם / ליטר אגר ו 25 גרם / ליטר שמרים. מחממים את הקורנפלקס והשמרים במים כדי לג'לטין, ולאחר מכן ממיסים לחלוטין את כל החומרים.</li>
		<li>כאשר המדיום מתקרר ל 50-60 מעלות צלזיוס, מוסיפים 6 מ"ל / ליטר של חומצה פרופיונית ומיד לארוז אותם לתוך בקבוקי תרבית.</li>
	</ol></li>
	<li>גידול זבובים והכנת זבובים מזדקנים<ol><li>הרבו את זן הזבוב w1118בבקבוקים המכילים מדיום סטנדרטי לתרבית קורנפלור והכניסו את הבקבוקים לאינקובטור טמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, 68% לחות יחסית, תנאי תאורה של 500-1000 לוקס ומחזור אור כהה של 12 שעות: 12 שעות.</li>
		<li>מעבירים זבובים לבקבוק חדש כל 7 ימים בהתאם למחזור הגדילה של הזבובים, תוך שמירה על גיל אחיד של הפרטים באותו בקבוק.</li>
		<li>אספו את קבוצת הזבובים החדשה שבקעה מהבקבוק המקורי 3 ימים לאחר העברתם והכניסו אותם לבקבוק חדש. בעקבות העיקרון של החלפת הבקבוק כל 7 ימים, הם יהיו בתרבית עד סביב גיל 30 ימים.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת מזון רפואי וצינורות זכוכית לניטור
הערה: הליך הכנת צינור זכוכית עוקב אחר עבודתם של ג'ין ואחרים עם שינויים34.
<ol><li>ניקוי וייבוש צינורות זכוכית<ol><li>מניחים את צינור הזכוכית (קוטר 5 מ"מ x 65 מ"מ אורך, ראו טבלת חומרים) לתוך גדולה, משרים אותה ומרתיחים אותה במים מזוקקים כפול למשך 20 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים.</li>
		<li>מוציאים וצרורים את צינור הזכוכית, שוטפים את החלק הפנימי במים מזוקקים כפול 3-5 פעמים ומכניסים לתנור לייבוש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מדיום תרבית פשוטה (100 מ"ל)<ol><li>ממיסים 1.5 גרם אגר ו-5 גרם סוכרוז במים מזוקקים כפול, מחממים ומתרכזים עד 100 מ"ל.</li>
		<li>הוסף 600 μL חומצה propionic כאשר המדיום מתקרר לכ 70 ° C, מונע ממנו להתמצק באמצעות אמבט מים טמפרטורה קבועה.</li>
		<li>הוסף כ 4 מ"ל של מדיום פשוט ו Reserpine (ראה טבלה של חומרים) לתוך קטנה 10 מ"ל עד התרופה מגיע 20 מיקרומטר או 50 מיקרומטר. להוסיף dimethyl sulfoxide (DMSO) לריכוז של 0.2% בקבוצת הביקורת שלילית.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת צינורות זכוכית המכילים תרופות<ol><li>כדי להקל על זרימת המדיום, הכנס בזהירות אורך מתאים של צינור זכוכית לתוך קטנה. התווך ייכנס באופן טבעי לצינור הזכוכית עקב לחץ אטמוספרי.</li>
		<li>משוך את צינור הזכוכית כאשר מדיום התרבית מוצק לחלוטין ונגב את הקיר החיצוני כדי לקבל צינור זכוכית ניטור עם מדיום תרבית המכיל סמים בקצה אחד.</li>
		<li>מחממים את הפרפין המוצק בכוס עד שהוא נמס ב 70 מעלות צלזיוס, מכניסים את קצה צינור הזכוכית קרוב למזון לתוך נוזל הפרפין כ -5 מ"מ, ומסירים אותו במהירות. המתן עד שהפרפין יתמצק כדי לאטום את קצה המזון של צינור הזכוכית.</li>
	</ol></li>
</ol>3. תכנון ניסויי וטיפול בזבובים
<ol><li>תכננו את הניסוי לטיפול בזבוב לפי טבלה 1.</li>
</ol>4. הרכבת דרוזופילה וניטור שינה
הערה: ההליך להרכבת דרוזופילה עוקב אחר עבודתם של ג'ין ואחרים 34 עם שינויים.
<ol><li>מרדימים זבובים בגזCO2 , מכניסים אותם לצינורות זכוכית אטומים בפרפין (אחד לכל צינור), וחוסמים את הקצה שאינו מזון עם כדור צמר גפן סופג כדי למנוע מזבובים לברוח ולהבטיח זרימת אוויר.</li>
	<li>טען צינורות על צג האינפרא אדום לצורך ניטורם.<ol><li>הרכיבו את צינורות הזכוכית המכילים זבובים על צג אינפרא אדום באותו כיוון, ורשמו את מספר הצג ומספר החור המתאימים לכל תרופה.</li>
		<li>התאימו את היישור של כל צינור, וגרמו לקרני האינפרא אדום לעבור אנכית דרך מרכז טווח הפעילות של הזבוב.</li>
		<li>מקם את הצג בתוך אינקובטור של 25 מעלות צלזיוס הממוקם בחדר החושך של הזבוב, בהתאם להגדרות שצוינו: טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, צייטגבר 12 (ZT12) (שווה ערך לזמן המקומי 08:00 בערב) ו- ZT24 (שווה ערך לזמן המקומי 08:00 בבוקר). מערך זה מבטיח שהזבובים יחוו לסירוגין פרקי זמן של 12 שעות של אור וחושך. הערה: נסה לא לפתוח את הדלת עד להשלמת איסוף הנתונים לניטור כדי לשמור על סביבה יציבה בחממה במהלך הניטור.</li>
		<li>התחל ניטור באמצעות מערכת DAM2 (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>לאחר השלמת הניטור, הורד את הנתונים שנאספו בפורמט .txt מהמערכת.</li>
	</ol></li>
</ol>5. עיבוד נתונים
הערה: עיבוד הנתונים באמצעות מערכת DAM, DAMFileScan107 ו- SCAMP בוצע בהתאם להוראות באתרי האינטרנט הרשמיים שלהם (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>ייבא את קובץ txt לעיל לתוכנת DAMFileScan107 לסריקה וחלק אותו לפי הצורך כדי לקבל נתוני שינה.<ol><li>הגדר את שעת ההתחלה של נתוני הסגמנטציה ל- 8:01 (פילוח של דקה אחת) או 8:00 (פילוח של 30 דקות) בבוקר השלישי לאחר הפעלת המוניטורים, ושעת הסיום היא 8:00 בבוקר שלושה ימים לאחר שעת ההתחלה (איור 2A1). הערה: הזבובים חייבים להסתגל לסביבת הניטור למשך יום אחד לפחות. לכן, ניתן להגדיר את שעת ההתחלה של הנתונים המפוצלים ל-8 בבוקר ביום השלישי לאחר תחילת הצג.</li>
		<li>פצל את הנתונים במרווחי זמן של דקה ו- 30 דקות. שנה את האפשרות "אורך סל" לדקה אחת, שנה את האפשרות "סוג קובץ פלט" לקבצי ערוץ, שינוי שם ופלט. שיטת פילוח הנתונים של 30 דקות זהה לזו שלעיל (איור 2A2-5). הערה: בעת ביצוע פילוח נתונים במרווחים של דקה ו- 30 דקות, שינוי השם הסופי של שני הקבצים צריך להיות עקבי; אחרת, ייתכן שלא ניתן יהיה לקרוא אותו במהלך עיבוד Matlab לאחר מכן. במידת הצורך, ניתן לשנות את שם הקובץ לאחר הפלט כדי להקל על הבידול.</li>
	</ol></li>
	<li>עיבוד נתונים באמצעות SCAMP2020<ol><li>פתחו את חבילת התוכנית SCAMP2020 ב-Matlab, ולחצו פעמיים על Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (איור 2B).</li>
		<li>הוסף את תיקיית המשנה שלו "Vecsey SCAMP Scripts" לנתיב, מצא את הקובץ "scamp.m" בתיקיה זו והפעל אותו. בחלון המוקפץ הבא, בחרו את התיקיות של התהליך ברצף של דקה ו-30 דקות (איור 2C,D).</li>
		<li>בחר צג, לחץ על טען חלקות בודדות לתצוגה מקדימה (איור 3A1), ובדוק את התמונה שמופיעה. בטל את הסימון של הערוץ המתאים של זבובים מתים (איור 3A2, איור 3B).</li>
		<li>חזור על השלבים לעיל כדי לבדוק את כל הצגים.</li>
		<li>שנה את שם כל ערוץ בכל צג בהתבסס על התרופה המתאימה לבדיקה (איור 3A3), בחר את כל הצגים ולחץ על נתח נתונים נבחרים לניתוח (איור 3A4).</li>
		<li>ברירת מחדל לאפשרות שנבחרה, לחץ על נתח עבור סל נבחר, סמן ייצוא נתונים, ולבסוף לחץ על GRAPH 30 min סוגי נתונים עבור כל הימים עבור קבוצות נבחרות וייצוא כל הנתונים כדי להפיק את התוצאות (איור 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>בחר את הקובץ בשם s30 מקובץ ה- CSV, מצא את הערך הממוצע המתאים ואת נתוני השגיאה הסטנדרטיים עבור כל צג, גבה אותו ב- Excel לצורך שינוי והתאמה והדבק אותו ב- GraphPad Prism (ראה טבלת חומרים) כדי לצייר דיאגרמת מצב שינה (איור 4A,B).</li>
	<li>מצאו את הקובץ שנקרא "stdur" וחשבו את הערכים הממוצעים של שעות היום, הלילה והשינה הכוללת עבור כל זבוב בתוך שלושה ימים (איור 4A,C). הדבק את הנתונים בתוכנת פריזמה כדי להשלים את בדיקת ההבדל ולצייר גרף.</li>
</ol>

Advancing Sleep Disorder Treatments: A &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;-Based Screening Approach

<ol>
	<li>Le Bon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+REM+and+NREM+in+the+NREM-REM+sleep+cycle:+a+review+on+competing+concepts.">Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts.</a> Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).</li><li>Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+function:+Toward+elucidating+an+enigma.">Sleep function: Toward elucidating an enigma.</a> Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).</li><li>Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+quantitative+sleep+parameters+from+childhood+to+old+age+in+healthy+individuals:+developing+normative+sleep+values+across+the+human+lifespan.">Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan.</a> Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).</li><li>Li, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperexcitable+arousal+circuits+drive+sleep+instability+during+aging.">Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging.</a> Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).</li><li>Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+problems+in+the+elderly.">Sleep problems in the elderly.</a> Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).</li><li>Gulia, K. K., Kumar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+disorders+in+the+elderly:+a+growing+challenge.">Sleep disorders in the elderly: a growing challenge.</a> Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).</li><li>Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+aging:+1.+Sleep+disorders+commonly+found+in+older+people.">Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people.</a> Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).</li><li>Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+disorders+in+the+elderly:+Diagnosis+and+management.">Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management.</a> Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).</li><li>Foley, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+complaints+among+elderly+persons+-+an+epidemiologic-study+of+3+communities.">Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities.</a> Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).</li><li>Yu, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insomnia+Severity+Index:+psychometric+properties+with+Chinese+community-dwelling+older+people.">Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people.</a> Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).</li><li>Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+duration+and+sleep+quality+in+relation+to+12-year+cardiovascular+disease+incidence:+the+MORGEN+study.">Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study.</a> Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).</li><li>Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+disturbance+and+Alzheimer's+disease:+relationship+to+behavioral+problems.">Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems.</a> Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).</li><li>Schroeck, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+safety+and+efficacy+of+sleep+medicines+in+older+adults.">Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults.</a> Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).</li><li>Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+uncoupling+and+up-regulation+of+benzodiazepine+and+GABA+recognition+sites+following+chronic+diazepam+treatment+of+HEK+293+cells+stably+transfected+with+alpha1beta2gamma2S+subunits+of+GABA+(A)+receptors.">Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).</li><li>Lader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+benzodiazepine+dependence.">History of benzodiazepine dependence.</a> Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).</li><li>Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+dementia+in+patients+with+insomnia+and+long-term+use+of+hypnotics:+a+population-based+retrospective+cohort+study.">Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study.</a> Plos One. 7 (11), e49113 (2012).</li><li>Kang, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+use+and+risk+of+fracture+in+elderly+insomnia+patients.">Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients.</a> Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).</li><li>Kao, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+zolpidem+and+cancer+risk:+a+Taiwanese+population-based+cohort+study.">Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study.</a> Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).</li><li>Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+clinical+safety+of+ramelteon:+an+evidence-based+review.">Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).</li><li>Friedrich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+liver+injury+during+antidepressant+treatment:+results+of+amsp,+a+drug+surveillance+program.">Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).</li><li>Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+high-throughput+screening.">Overview of high-throughput screening.</a> Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).</li><li>Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+docking+and+structure-based+drug+design+strategies.">Molecular docking and structure-based drug design strategies.</a> Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).</li><li>Campbell, S. S., Tobler, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+sleep+-+a+review+of+sleep+duration+across+phylogeny.">Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).</li><li>Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+a+simple+animal+model+to+understand+sleep.">The need for a simple animal model to understand sleep.</a> Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).</li><li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster.">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).</li><li>Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurobiological+basis+of+sleep:+Insights+from+Drosophila.">The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila.</a> Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).</li><li>Jeibmann, A., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+of+brain+diseases.">Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).</li><li>Morse, D., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+after+time:+inputs+to+and+outputs+from+the+mammalian+circadian+oscillators.">Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators.</a> Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).</li><li>De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+an+emergent+model+for+delineating+interactions+between+the+circadian+clock+and+drugs+of+abuse.">Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse.</a> Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).</li><li>Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+variability+of+sleep+and+activity+as+biomarkers+of+ageing+in+Drosophila.">Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila.</a> Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).</li><li>Nall, A. H., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+screen+in+adult+Drosophila+identifies+VMAT+as+a+regulator+of+sleep.">Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep.</a> Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).</li><li>Jin, X., Gu, P., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+Drosophila+sleep+deprivation+using+single-chip+board.">Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).</li><li>Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+on+fragment+based+drug+design+approach+for+drug+discovery.">Counting on fragment based drug design approach for drug discovery.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).</li><li>Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+dimethyl+sulphoxide+(DMSO)+on+cochlear+organotypic+cultures.">Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures.</a> Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).</li><li>Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dimethyl+sulfoxide+on+the+gene+induction+of+cytochrome+P450+isoforms,+UGT-dependent+glucuronosyl+transferase+isoforms,+and+ABCB1+in+primary+culture+of+human+hepatocytes.">Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).</li><li>Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronobiotics+KL001+and+KS15+extend+lifespan+and+modify+circadian+rhythms+of+Drosophila+melanogaster.">Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster.</a> Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).</li><li>Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+effects+of+dimethyl+sulfoxide+(DMSO):+changes+in+sleep+architecture+in+rats.">Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats.</a> Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).</li><li>Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+activity+level+monitoring+using+the+Drosophila+Activity+Monitoring+(DAM)+System.">Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).</li><li>Gilestro, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+tracking+and+analysis+of+sleep+in+Drosophila+melanogaster.">Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster.</a> Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).</li><li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila.">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).</li><li>Donelson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+positional+tracking+for+long-term+analysis+of+Drosophila+sleep+and+locomotion+using+the+&amp;#34;tracker&amp;#34;+program.">High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the &amp;#34;tracker&amp;#34; program.</a> Plos One. 7 (5), e37250 (2012).</li><li>Cichewicz, K., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShinyR-DAM:+a+program+analyzing+Drosophila+activity,+sleep+and+circadian+rhythms.">ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms.</a> Communications Biology. 1, 25 (2018).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

השיטה המתוארת מתאימה לסינון מהיר של תרופות שינה קטנות ובינוניות. כיום, רוב שיטות סינון התרופות המקובלות בתפוקה גבוהה מבוססות על רמות ביוכימיות ותאיות. לדוגמה, המבנה והתכונות של הקולטן נבדקים כדי לחפש ליגנדות ספציפיות שיכולות להיקשר אליו22. גישה אחרת כוללת ניתוח מצב הקשירה וה?...

שינה, אחת ההתנהגויות החיוניות להישרדות האדם, מאופיינת בשני מצבים עיקריים: שינה של תנועת עיניים מהירה (REM) ושינה של תנועת עיניים לא מהירה (NREM)1. שנת NREM מורכבת משלושה שלבים: N1 (המעבר בין ערות לשינה), N2 (שינה קלה) ו-N3 (שינה עמוקה, שנת גלים איטיים), המייצגים את ההתקדמות מעירות לשינה עמוקה1. שינה ממלאת תפקיד מכריע בבריאות הגופנית והנפשית2. עם זאת, הזדקנות מפחיתה את משך השינה הכולל, יעילות השינה, אחוז השינה בגלים איטיים ואחוז שנת REM אצל מבוגרים3. אנשים מבוגרים נוטים לבלות יותר זמן בשינה קלה בהשוואה לשנת גלים איטיים, מה שהופך אותם לרגישים יותר להתעוררויות ליליות. ככל שמספר ההתעוררויות עולה, זמן השינה הממוצע יורד, וכתוצאה מכך דפוס שינה מקוטע אצל קשישים, אשר עשוי להיות קשור לעירור יתר של נוירוני Hcrt בעכברים4. נוסף על כך, ירידה תלוית גיל במנגנונים צירקדיים תורמת לשינוי מוקדם יותר במשך השינה 5,6. בשילוב עם מחלות פיזיות, לחץ פסיכולוגי, גורמים סביבתיים ושימוש בתרופות, גורמים אלה הופכים מבוגרים לרגישים יותר להפרעות שינה, כגון נדודי שינה, הפרעת התנהגות בשינה REM, נרקולפסיה, תנועות רגליים תקופתיות, תסמונת רגליים חסרות מנוחה והפרעות נשימה בשינה 7,8.
מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי הפרעות שינה קשורות קשר הדוק למחלות כרוניות בקרב קשישים9, כולל דיכאון 10, מחלות לב וכלי דם11 ודמנציה12. לטיפול בהפרעות שינה תפקיד מכריע בשיפור וטיפול במחלות כרוניות ובשיפור איכות החיים של אנשים מבוגרים. כיום, חולים מסתמכים בעיקר על תרופות כגון בנזודיאזפינים, שאינם בנזודיאזפינים ואגוניסטים לקולטני מלטונין כדי לשפר את איכות השינה13. עם זאת, בנזודיאזפינים יכולים להוביל לירידה ברגולציה של קולטנים ותלות לאחר שימוש ארוך טווח, מה שגורם לתסמיני גמילה חמורים עם הפסקת14,15. תרופות שאינן בנזודיאזפינים נושאות גם סיכונים, כולל דמנציה 16, שברים17 וסרטן18. אגוניסט קולטן מלטונין נפוץ, ramelteon, מפחית את חביון השינה אבל לא מאריך את משך השינה ויש לו חששות הקשורים לתפקוד הכבד עקב חיסול נרחב של מעבר ראשון19. אגומלטין, אגוניסט לקולטן מלטונין ואנטגוניסט לקולטן סרוטונין, משפר נדודי שינה הקשורים לדיכאון אך גם מהווה סיכון לנזק לכבד20. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בתרופות בטוחות יותר לטיפול או הקלה על הפרעות שינה. עם זאת, אסטרטגיות סינון התרופות הנוכחיות, המבוססות על ניסויים מולקולריים ותאיים בשילוב עם מערכות אוטומטיות וניתוח ממוחשב, הן יקרות וגוזלות זמןרב 21. אסטרטגיות תכנון תרופות מבוססות מבנה, המסתמכות על מבנה הקולטן ותכונותיו, דורשות הבנה ברורה של המבנה התלת-ממדי של הקולטן וחסרות יכולות ניבוי להשפעות התרופה22.
בשנת 2000, בהתבסס על קריטריוני השינה שהוצעו על ידי קמפבל וטובלר בשנת 1984 23, חוקרים הקימו מודלים פשוטים של בעלי חיים כדי לחקור שינה 24, כולל Drosophila melanogaster, אשר הציג מצבים דמויי שינה25,26. למרות ההבדלים האנטומיים בין דרוזופילה לבני אדם, מרכיבים נוירוכימיים רבים ומסלולי איתות המווסתים את השינה בדרוזופילה נשמרים בשנת יונקים, מה שמקל על חקר מחלות נוירולוגיות אנושיות 27,28. דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב גם במחקרי שעון ביולוגי, למרות הבדלים במתנדי הליבה בין זבובים ליונקים 29,30,31. לכן, דרוזופילה משמשת כאורגניזם מודל רב ערך לחקר התנהגות השינה וביצוע בדיקות סקר הקשורות לשינה.
מחקר זה מציע גישה חסכונית ופשוטה מבוססת פנוטיפ לסינון תרופות במולקולות קטנות לטיפול בהפרעות שינה באמצעות זבובים מזדקנים. ויסות השינה בדרוזופילה נשמר מאוד25, והירידה בשינה שנצפתה עם הגיל עשויה להיות הפיכה באמצעות מתן תרופות. לפיכך, שיטת סינון זו המבוססת על פנוטיפ שינה יכולה לשקף באופן אינטואיטיבי את יעילות התרופה. אנו מאכילים את הזבובים בתערובת של התרופה הנחקרת ומזון, מנטרים ומתעדים התנהגות שינה באמצעות Drosophila Activity Monitor (DAM)32, ומנתחים את הנתונים שנרכשו באמצעות חבילת הנתונים SCAMP2020 בקוד פתוח ב-MATLAB (איור 1). ניתוח סטטיסטי מתבצע באמצעות סטטיסטיקה ותוכנות גרפים (ראה טבלת חומרים). לדוגמה, אנו מדגימים את יעילותו של פרוטוקול זה על ידי הצגת נתונים ניסיוניים על Reserpine, מעכב מולקולות קטנות של טרנספורטר מונואמין שלפוחית שדווח כמגביר שינה33. פרוטוקול זה מספק גישה חשובה לזיהוי תרופות לטיפול בבעיות שינה הקשורות לגיל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ager</td>
			<td>BIOFROXX</td>
			<td>8211KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Climate Box</td>
			<td>PRANDT</td>
			<td>PRX-1000A</td>
			<td>official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM2 Drosophila Activity Monitor</td>
			<td>TriKineics</td>
			<td>DAM2</td>
			<td>official website:https://www.trikinetics.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM2system</td>
			<td>TriKineics</td>
			<td>version:v3.03</td>
			<td>official website:https://www.trikinetics.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMFileScan</td>
			<td>TriKineics</td>
			<td>version:1.0.7.0</td>
			<td>official website:https://www.trikinetics.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Activity Monitoring Incubator</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td>official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Bottles</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>51-17720</td>
			<td>official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila: w1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td>BDSC_3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>version:Excel 2016</td>
			<td>official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>TriKinetics</td>
			<td>PPT5x65</td>
			<td>official website:https://www.trikinetics.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLABR2022b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>version:9.13.0.2049777</td>
			<td>official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version:Prism 8.0.1</td>
			<td>official website:https://www.graphpad.com/features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>R817202-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>1245GR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAMP</td>
			<td>Vecsey Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput small molecule drug screening for age-related sleep disorders using drosophila melanogaster

שינה, מרכיב חיוני של בריאות ורווחה כללית, מציבה לעתים קרובות אתגרים לאנשים מבוגרים שחווים לעתים קרובות הפרעות שינה המאופיינות במשך שינה מקוצר ודפוסים מקוטעים. הפרעות שינה אלה קשורות גם לסיכון מוגבר למחלות שונות בקרב קשישים, כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם והפרעות פסיכולוגיות. למרבה הצער, התרופות הקיימות להפרעות שינה קשורות לתופעות לוואי משמעותיות כגון פגיעה קוגניטיבית והתמכרות. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בפיתוח תרופות חדשות, בטוחות ויעילות יותר להפרעות שינה. עם זאת, העלות הגבוהה ומשך הניסוי הממושך של שיטות סינון התרופות הנוכחיות נותרו גורמים מגבילים.
פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב- Drosophila melanogaster, מין בעל מנגנון ויסות שינה שמור מאוד בהשוואה ליונקים, מה שהופך אותו למודל אידיאלי לחקר הפרעות שינה אצל קשישים. על-ידי מתן תרכובות קטנות שונות לזבובים מזדקנים, אנו יכולים להעריך את השפעתם על הפרעות שינה. התנהגויות השינה של זבובים אלה נרשמות באמצעות מכשיר ניטור אינפרא אדום ומנותחות באמצעות חבילת הנתונים בקוד פתוח Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). פרוטוקול זה מציע גישת סינון זולה, ניתנת לשחזור ויעילה לוויסות שינה. זבובי פירות, בשל מחזור החיים הקצר שלהם, עלות הגידול הנמוכה וקלות הטיפול, משמשים כנושאים מצוינים לשיטה זו. לשם המחשה, רסרפין, אחת התרופות שנבדקו, הדגימה את היכולת לקדם את משך השינה אצל זבובים קשישים, והדגישה את יעילותו של פרוטוקול זה.

Sleep, one of the essential behaviors necessary for human survival, is characterized by two main states: rapid eye movement (REM) sleep and non-rapid eye movement (NREM) sleep1. NREM sleep comprises three stages: N1 (the transition between wakefulness and sleep), N2 (light sleep), and N3 (deep sleep, slow wave sleep), representing the progression from wakefulness to deep sleep1. Sleep plays a crucial role in both physical and mental health2. However, aging reduces total sleep duration, sleep efficiency, slow-wave sleep percentage, and REM sleep percentage in adults3. Older individuals tend to spend more time in light sleep compared to slow-wave sleep, making them more sensitive to nocturnal awakenings. As the number of awakenings increases, average sleep time decreases, resulting in a fragmented sleep pattern in the elderly, which may be associated with excessive excitation of Hcrt neurons in mice4. Additionally, age-related declines in circadian mechanisms contribute to an earlier shift in sleep duration5,6. In combination with physical illness, psychological stress, environmental factors, and medication use, these factors make older adults more susceptible to sleep disorders, such as insomnia, REM sleep behavior disorder, narcolepsy, periodic leg movements, restless legs syndrome, and sleep-disordered breathing7,8.
Epidemiological studies have shown that sleep disorders are closely linked to chronic diseases in the elderly9, including depression10, cardiovascular disease11, and dementia12. Addressing sleep disorders plays a crucial role in improving and treating chronic diseases and enhancing the quality of life for older adults. Currently, patients primarily rely on drugs such as benzodiazepines, non-benzodiazepines, and melatonin receptor agonists to enhance sleep quality13. However, benzodiazepines can lead to downregulation of receptors and dependence after long-term use, causing severe withdrawal symptoms upon discontinuation14,15. Non-benzodiazepine drugs also carry risks, including dementia16, fractures17, and cancer18. The commonly used melatonin receptor agonist, ramelteon, reduces sleep latency but does not increase sleep duration and has hepatic function-related concerns due to extensive first-pass elimination19. Agomelatine, a melatonin receptor agonist and serotonin receptor antagonist, improves depression-related insomnia but also poses a risk of liver damage20. Consequently, there is an urgent need for safer drugs to treat or alleviate sleep disorders. However, current drug screening strategies, based on molecular and cellular experiments combined with automated systems and computer analysis, are expensive and time-consuming21. Structure-based drug design strategies, relying on receptor structure and properties, require a clear understanding of receptor three-dimensional structure and lack predictive capabilities for drug effects22.
In 2000, based on the sleep criteria proposed by Campbell and Tobler in 198423, researchers established simple animal models to study sleep24, including Drosophila melanogaster, which exhibited sleep-like states25,26. Despite anatomical differences between Drosophila and humans, many neurochemical components and signaling pathways regulating sleep in Drosophila are conserved in mammalian sleep, facilitating the study of human neurological diseases27,28. Drosophila is also extensively used in circadian rhythm studies, despite differences in core oscillators between flies and mammals29,30,31. Therefore, Drosophila serves as a valuable model organism for studying sleep behavior and conducting sleep-related drug screening.
This study proposes a cost-effective and simple phenotype-based approach for screening small-molecule drugs to treat sleep disorders using aged flies. Sleep regulation in Drosophila is highly conserved25, and the decline in sleep observed with age may be reversible through drug administration. Thus, this sleep phenotype-based screening method can intuitively reflect drug efficacy. We feed the flies with a mixture of the drug under investigation and food, monitor and record sleep behavior using the Drosophila Activity Monitor (DAM)32, and analyze the acquired data using the open-source SCAMP2020 data package in MATLAB (Figure1). Statistical analysis is performed using statistics and graphing software (see Table of Materials). As an example, we demonstrate the effectiveness of this protocol by presenting experimental data on Reserpine, a small-molecule inhibitor of the vesicular monoamine transporter reported to increase sleep33. This protocol provides a valuable approach to identify drugs for treating age-related sleep problems.

Author Spotlight: Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System 

בדיקת תרופות במולקולות קטנות בתפוקה גבוהה להפרעות שינה הקשורות לגיל באמצעות Drosophila melanogaster

Reserpine הוא מעכב מולקולה קטנה של טרנספורטר מונואמין שלפוחית (VMAT), אשר מעכב את ספיגה מחדש של מונואמינים לתוך שלפוחיות presynaptic, המוביל שינה מוגברת33. ההשפעות מעודדות השינה של רסרפיין נבדקו בזבובים בני 30 יום, כאשר קבוצת הביקורת ניזונה אך ורק מדימתיל סולפוקסיד הממס (DMSO). בקבוצת Reserpine, זב...

Watch this Scientific Journal Video about Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System at JoVE.com

מוצג פרוטוקול לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה לשיפור השינה על ידי ניטור התנהגות השינה של זבובי פירות במודל דרוזופילה קשיש.

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

טכניקות סינון תרופות כוללות סינון בתפוקה גבוהה, המשתמש באוטומציה לגילוי תרופות, תכנונים מבוססי מבנה, ומציאת מולקולות קושרות קולטן המבוססות על המבנה, ועיצוב מבוסס פרגמנטים, המשתמש בתהודה מגנטית גרעינית ובספקטרומטריית מסות כדי לייעל מקטעים מולקולריים ולזהות את התרכובות. מערכת DAM מודדת שנת זבובים על ידי גילוי לבני קרן אינפרא אדום. עם זאת, שיטה זו יכולה להעריך יתר על המידה את השינה אם הזבובים נשארים סטטיים בקצה אחד של הצינור, או אם הזבוב אינו נייד במיוחד.יתר על כן, הסדר של כל תרופה שנבדקה עלול להשפיע על צריכת פרי הזבוב, מה שעלול להטות את תוצאות הניסוי. לכן, הניסוי שלנו ישלב מתיחות שונות כדי למתן גורמים אלה ולשפר את הדיוק. בהשוואה לשיטות מבוססות ניתוח וידאו, השיטה שלנו מציעה יכולות תפוקה גבוהה, מפחיתה את העלות ומפשטת את התפעול.כך שתהליך הנתונים הניסיוניים הוא גם פשוט יחסית, כאשר הגרף המתקבל מייצג חזותית את השפעות התרופה.

high-throughput-small-molecule-drug-screening-for-age-related-sleep

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Pharmacology

Behavior

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Unit 1

Pharmacotherapy of Depression and Anxiety Disorders

SCIENTISTS IN ACTION

1.5K Views.  Southeast University. טכניקות סינון תרופות כוללות סינון בתפוקה גבוהה, המשתמש באוטומציה לגילוי תרופות, תכנונים מבוססי מבנה, ומציאת מולקולות קושרות קולטן המבוססות על המבנה, ועיצוב מבוסס פרגמנטים, המשתמש בתהודה מגנטית גרעינית ובספקטרומטריית מסות כדי לייעל מקטעים מולקולריים ולזהות את התרכובות. מ...

Video: Author Spotlight: Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System 

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders characterized by shortened sleep duration and fragmented patterns. These sleep disruptions also correlate with an increased risk of various illnesses in the elderly, including diabetes, cardiovascular diseases, and psychological disorders. Unfortunately, existing drugs for sleep disorders are associated with significant side effects such as cognitive impairment and addiction. Consequently, the development of new, safer, and more effective sleep disorder medications is urgently needed. However, the high cost and lengthy experimental duration of current drug screening methods remain limiting factors.
This protocol describes a cost-effective and high-throughput screening method that utilizes Drosophila melanogaster, a species with a highly conserved sleep regulation mechanism compared to mammals, making it an ideal model for studying sleep disorders in the elderly. By administering various small compounds to aged flies, we can assess their effects on sleep disorders. The sleep behaviors of these flies are recorded using an infrared monitoring device and analyzed with the open-source data package Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). This protocol offers a low-cost, reproducible, and efficient screening approach for sleep regulation. Fruit flies, due to their short life cycle, low husbandry cost, and ease of handling, serve as excellent subjects for this method. As an illustration, Reserpine, one of the tested drugs, demonstrated the ability to promote sleep duration in elderly flies, highlighting the effectiveness of this protocol.

Presented is a protocol for high-throughput drug screening to improve sleep by monitoring the sleep behavior of fruit flies in an elderly Drosophila model.

Drug Screening Method for Sleep Regulation in an Elderly Drosophila melanogaster Model

Drug Screening Method for Sleep Regulation in an Elderly Drosophila melanogaster Model  

To begin, take a bottle of flies, transfer them into a new bottle every seven days in sync with their growth cycle. Collect the next generation of flies that hatch from the initial bottle three days after transferring, and place them into a fresh bottle. Next, place the glass tube into a large beaker.Fill it with double distilled water and boil for 20 minutes. Then remove and bundle the glass tube. Rinse it three to five times with double distilled water, and place the glass tube in an oven to dry.Using a pipette, add four milliliters of sample buffer and reserpine into a 10 milliliter small beaker. For the negative control group, add dimethyl sulfoxide until the concentration reaches 0.2%Carefully insert an appropriate length of glass tube into a small beaker to facilitate the flow of the medium. Wait for the culture medium to fully solidify.Before removing the glass tube, wipe the outer wall to acquire a monitoring glass tube ensuring that one end contains the culture medium with drugs. Then heat solid paraffin in a beaker at 70 degrees Celsius until it melts. Immerse the glass tube's end in the liquid paraffin for about five millimeters and quickly remove it.Wait for the paraffin to solidify to seal the food end of the glass tube. Put the anesthetized flies into paraffin sealed glass tubes and block the non-food end with an absorbent cotton ball. Load the tubes onto an infrared monitor to keep watch over them.Align each tube so the infrared rays run vertically through the center of the flies active range. Set the monitor inside an incubator housed in the flies sleep darkroom.

שיטת סינון תרופתי לוויסות שינה במודל Drosophila melanogaster קשיש

Analyzing the Effect of Reserpine on the Sleep Behavior of Drosophila melanogaster Using SCAMP2020 Data Package in MATLAB

Analyzing the Effect of Reserpine on the Sleep Behavior of Drosophila melanogaster Using SCAMP2020 Data Package in MATLAB  

To begin, monitor the sleep behaviors of flies using an infrared monitoring device and import the collected data in TXT format into the DAM file scan 107 software for scanning. Set the start time of the segmentation data to either 0800 or 0801 on the third morning after initiating the monitors to obtain one or 30 minute bin length data, respectively. Set the termination time to 8:00 AM on the third day post the set starting time.Adjust the bin length option to one minute and alter the output file type to channel files. Rename the file and generate the output. Now launch the SCAMP 2020 software package in MATLAB.Double click on Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB program. Added it sub-folder titled Vecsey SCAMP Scripts into the path. Locate the SCAMP.m file in that folder and run it. In the subsequent popup window sequentially select the folder named one minute and 30 minute. Then select a monitor and click on load individual C plots to preview.Inspect the image that appears and deselect the corresponding channel of any dead flies. Rename each channel in every monitor based on the corresponding drug to be tested. Select all monitors and click Analyze selected data for the analysis.Select the default option and then click on analyze for chosen bin feature. Check the export data box. Click on graph 30 minute data types for all days for selected groups, and export all data to generate the output of the results.Select the S30 file from the CSV file and locate the corresponding mean value and standard error data for each monitor. Save this data in Excel to make some adjustments before posting it into GraphPad Prism to formulate a sleep status diagram. Afterwards, locate the file named S-T-D-U-R and compute the average values of daytime, nighttime, and total sleep for each fly over three days.Paste data into GraphPad Prism to draw graphs. The sleep patterns of Reserpine and Dimethyl Sulfoxide on female and male flies over three consecutive days are shown. Quantitative analysis of the sleep behavior demonstrates a significant increase in sleep time in aged females fed Reserpine.The experiment on male flies also demonstrates a positive correlation between Reserpine concentration and the promotion of sleep.