עבודה זו נתמכה חלקית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82202473).

הסקירה הכללית של שלבי הפרוטוקול מוצגת באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת מדיה
<ol><li>הכינו מדיום תרבית עבור ADSC ללא אקסוזומים באמצעות 450 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית, 50 מ"ל של נסיוב בקר עוברי ללא אקסוזומים, ו-5 מ"ל של אנטיביוטיקה משולשת.</li>
</ol>2. החייאה וטיפוח ADSCs
הערה: לבצע החייאה ADSCs.
<ol><li>הפעילו מראש את קרינת ה-UV של השולחן האולטרה-נקי וחיטאו אותו למשך 30 דקות.</li>
	<li>מחממים מראש את המדיום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שלפו 2 צינורות של ADSCs קפואים (P3) מחנקן נוזלי ועוררו אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם טמפרטורה קבועה עד להפשרה מלאה. הערה: פתיחת צינור המקפיא לא צריכה להיות במגע עם מים כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>יש לחטא את הצינורית בהקפאה באמצעות 75% אלכוהול ולאחר מכן להעביר אותה לשולחן נקי במיוחד. שאפו את מתלה התא באמצעות פיפטה והניחו אותו בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.</li>
	<li>הכניסו את צינור הצנטריפוגה למכונת צנטריפוגות במהירות נמוכה ולצנטריפוגה במהירות של 250 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.</li>
	<li>מכינים ארבע מנות תרבית בקוטר 10 ס"מ ומכניסים 9 מ"ל בינוני לכל מנה. סמן את השם, סוג התא, הדור ותאריך הניסוי, ולאחר מכן חמם אותם מראש באינקובטור תאים תרמוסטטי של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לחטא את צינור הצנטריפוגה ולהעביר אותו לשולחן נקי במיוחד. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.</li>
	<li>מוסיפים 4 מ"ל בינוני ומסעירים בעדינות את התמיסה (1 x 10,5 תאים/מ"ל) עד שהיא מפוזרת באופן שווה. הערה: יש להיזהר שלא לסלק את כדורית התא בעת חילוץ הסופרנטנט.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של תרחיף תאים לכל מנה. נערו את הכלים בשיטת צלב. הערה: מקם את הלוח על משטח ישר ועורר אותו בדוגמת צלב (הזז אותו למעלה, למטה, שמאלה וימינה) במשך 5-6 חזרות. הימנע תנועות מעגליות, כפי שהם עלולים לגרום הצטברות תאים במרכז.</li>
	<li>התבוננו בתאים בהגדלה של פי 40 עם המיקרוסקופ האופטי, ולאחר מכן הכניסו את הכלים לאינקובטור. הערה: המטרה העיקרית של התבוננות בתאים היא לקבוע אם הם מפוזרים באופן שווה, מכיוון שפיזור לא אחיד ישפיע על הצמיחה הבאה.</li>
	<li>הכינו אמצעי החלפה עבור התאים.<ol><li>הפעילו מראש את קרינת ה-UV של השולחן האולטרה-נקי וחיטאו אותו למשך 30 דקות.</li>
		<li>מחממים מראש את המדיום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>התבוננו במצב התא תחת המיקרוסקופ האופטי בהגדלה של פי 40. רמת המפגש היא כ -50%. הערה: רמת המפגש מחושבת כיחס בין השטח התפוס על ידי התאים לשטח הפנים של צלחת הפטרי לאחר שהתאים נצמדים לקיר ונמתחים במלואם.</li>
		<li>מעבירים את צלחת התרבית לשולחן אולטרה נקי (רמת בטיחות ביולוגית 2) לאחר החיטוי ומסירים את המדיום.</li>
		<li>שטפו בעדינות כל צלחת תרבית פעמיים בתמיסת PBS במינון 2 מ"ל.</li>
		<li>מוסיפים 10 מ"ל בינוני לכל מנה. מעבירים את הכלים לאינקובטור.</li>
	</ol></li>
</ol>3. איסוף ה-ADSCs supernatant וחילוץ כלי הרכב החשמליים
<ol><li>הפעילו מראש את קרינת ה-UV של השולחן האולטרה-נקי וחיטאו אותו למשך 30 דקות.</li>
	<li>התבונן במצב התא תחת מיקרוסקופ. רמת המפגש היא כ-80%.</li>
	<li>מעבירים את התבשיל לשולחן נקי במיוחד לאחר החיטוי. בזהירות לאסוף את supernatant עם פיפטה ומניחים אותו בתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. הערה: ניתן להקפיא או למחוק תאים. אם אין צורך בסטריליות, ניתן לבצע את השלבים הבאים על שולחן הניתוחים. בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי ולאחר מכן להפעיל אותו מחדש מאוחר יותר. אם הניסוי נעצר, אחסנו את הסופרנאטנט במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ מכיוון שהוא עלול להשפיע על פעילות כלי הרכב החשמליים. הגישה האופטימלית היא לחלץ רכבים חשמליים באופן מיידי.</li>
	<li>צנטריפוגה (300 x גרם, 10 דקות, בטמפרטורת החדר) להסרת תאים מרחפים. אוספים את הסופרנאטנט עם פיפטה. הערה: אין לשפוך. השאירו מעט סופרנאטנט כדי למנוע מהגלולה להישאב.</li>
	<li>צנטריפוגה כדי להסיר פסולת תאית (2000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C), ולאחר מכן להמשיך לאסוף את supernatant עם פיפטה. הערה: נקודות המפתח זהות לשלב 3.4.</li>
	<li>סנן את supernatant עם קרום 0.22 um כדי להסיר חלקיקים גדולים ופסולת התא. הערה: סננו את הסופרנאטנט עם 2 מ"ל PBS סטרילי כדי להרטיב את קרום המסנן לפני הסינון.</li>
	<li>צנטריפוגה במכונת אולטרה-צנטריפוגות (10,000 x גרם, 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,00,000 x גרם במשך 70 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את הגלולה ולאסוף את supernatant. הערה: כלי הרכב החשמליים שהתקבלו טוהרו על ידי צנטריפוגה מספר פעמים כדי להגביר את טוהרם. ייתכן שהגלולה לא תהיה גלויה לעין בלתי. לכן, חשוב להפעיל את פיפטה בעדינות ולהשאיר מעט סופרנאטנט בתחתית כדי למנוע איסוף כדורים.</li>
	<li>מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה. השהה מחדש את הגלולה עם PBS וצנטריפוגה (1,00,000 x גרם, 70 דקות, 4 ° C). הערה: ייתכן שהגלולה לא תהיה גלויה לעין בלתי. לכן, כאשר שואפים את הסופרנאטנט עם פיפטה, קריטי להסיר את הסופרנאטנט בעדינות וביסודיות כדי למקסם את טוהר הרכבים החשמליים.</li>
	<li>הסר את supernatant ולקבל את גלולת EVs. להשעות אותו עם 1 מ"ל של PBS, להעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגה 1 מ"ל, ולאחסן אותו במקרר 4 ° C לגילוי הבא. הערה: ייתכן שהגלולה לא תהיה גלויה לעין בלתי. לכן, כאשר שואפים את הסופרנאטנט עם פיפטה, חשוב להסיר את הסופרנאטנט בעדינות וביסודיות כדי למקסם את טוהר הרכב החשמלי. אם הדגימות אינן נחוצות לתקופה ממושכת, אחסנו אותן במקרר של -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>

בידוד מבוסס אולטרה-צנטריפוגות של בועיות חוץ-תאיות ממערכות ADSC אנושיות

<ol>
	<li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Looking+forward.">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464 (2021).</li><li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/miRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke.">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration.">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li><li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes.">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202 (2017).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing).">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li><li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application.">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration.">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375/foxf1+axis.">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159 (2021).</li><li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles.">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122 (2023).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells.">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li><li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p/TGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK/NF-&#954;B+pathway.">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-&#954;B pathway.</a> Cytokine. 172, 156386 (2023).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy.">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482 (2018).</li><li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting.">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).</li><li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells.">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma:+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods.">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235 (2022).</li><li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment.">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109 (2018).</li></ol>

למחברים אין אינטרס כלכלי להצהיר.

במהלך תהליך הניסוי הפורמלי, מספר נקודות הן קריטיות להשגת תוצאות הניסוי הטובות ביותר. בהתבסס על ניסיון העבר שלנו, מומלץ לבחור במעבר 3-6 ADSCs, מכיוון שהם מבטיחים את מצב התא הטוב ביותר האפשרי. לפני P3, ייתכן שתאי דם אדומים, תאי אנדותל ותאים שונים אחרים לא נבדקו. לאחר P6, התאים עשויים להזדקן בהדרגה, מ?...

רוב ADSCs נגזרים מרקמת השומן והוכחו כמקדמים התחדשות ושחזור של רקמות ואיברים שונים, כולל שריר הלב, העצם והעור1. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתפקוד הרגנרטיבי של ADSCs עשוי לנבוע ממגע בין-תאי ומההשפעות הפרקריניות של התאים2. האפקט הפרקריני הוא אמצעי חשוב עבור תאים לתקשר ולהעביר מידע על פני מרחקים קצרים, ופונקציה זו מושגת באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs).
כלי רכב חשמליים הם מבני קרום דו-שכבתיים המיוצרים על ידי תאים, בקוטר הנע בין 40 ננומטר ל-160 ננומטר (עם ממוצע של כ-100 ננומטר). הם משפיעים על תפקודים תאיים שונים, כגון ייצור ציטוקינים, התפשטות תאים, אפופטוזיס ומטבוליזם 3,4. מחקרים רבים נערכו על תפקודים של ADSC EVs, כולל קידום התחדשות עצם, התחדשות רקמת רירית הפה, הישרדות רקמת שומן לאחר השתלת רקמות, ותיקון פצעים בעור 5,6,7,8. הפוטנציאל העצום של ADSC EVs ברפואה רגנרטיבית ניכר. קיימות שיטות שונות לחילוץ והפרדה של כלי רכב חשמליים מהסופר-נטנט, כגון טכניקות המבוססות על צנטריפוגה, משקעים, גודל מולקולרי, זיקה ומיקרופלואידיקה. שיטת האולטרה-צנטריפוגה נחשבת לתקן הזהב לבידוד כלי רכב חשמליים9. העיקרון הבסיסי של אולטרה-צנטריפוגה להפרדת EV מבוסס על העובדה שלחלקיקים במדגם יש מקדמי שיקוע משתנים, וכתוצאה מכך שיקוע וצבירה שלהם בשכבות הפרדה נפרדות. עם זאת, טרם נקבע פרוטוקול מפורט המדגיש את אמצעי הזהירות במהלך אולטרה-צנטריפוגה.
לכן, מחקר זה מתאר באופן אובייקטיבי את תרבות ADSC, איסוף supernatant ונהלי אולטרה-צנטריפוגה של כלי רכב חשמליים ונקודות מפתח עם זרימה לוגית של מידע ושפה רשמית ברורה. זה מספק התייחסות חשובה לניסויים עתידיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>4652</td>
			<td>0.22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium For Cell Culture</td>
			<td>OriCell</td>
			<td>BHDM-03011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)</td>
			<td>OriCell</td>
			<td>HUXMD-05002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Lx70-S8F2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>SC-3612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and characterization of extracellular vesicles from human adipose-derived mesenchymal stem cells

תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי (ADSCs) יכולים לקדם התחדשות ושחזור של רקמות ואיברים שונים. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שניתן לייחס את תפקודם הרגנרטיבי למגע בין תאים ולהשפעות פרקריניות של תאים. האפקט הפרקריני הוא דרך חשובה לתאים לתקשר ולהעביר מידע למרחקים קצרים, שבהם שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ממלאות תפקיד פונקציונלי כנשאיות. קיים פוטנציאל משמעותי ל-ADSC EVs ברפואה רגנרטיבית. מחקרים רבים דיווחו על יעילותן של שיטות אלה. כיום מתוארות שיטות שונות לחילוץ ובידוד כלי רכב חשמליים המבוססות על עקרונות כגון צנטריפוגה, משקעים, גודל מולקולרי, זיקה ומיקרופלואידיקה. אולטרה-צנטריפוגה נחשבת לתקן הזהב לבידוד כלי רכב חשמליים. עם זאת, פרוטוקול קפדני להדגשת אמצעי זהירות במהלך אולטרה-צנטריפוגה עדיין נעדר. מחקר זה מציג את המתודולוגיה והצעדים המכריעים הכרוכים בתרבות ADSC, איסוף סופרנאטנטים ואולטרה-צנטריפוגה של כלי רכב חשמליים. עם זאת, למרות שאולטרה-צנטריפוגה היא חסכונית ואינה דורשת טיפול נוסף, עדיין ישנם כמה חסרונות בלתי נמנעים, כגון שיעור התאוששות נמוך וצבירת רכב חשמלי.

Most ADSCs are derived from adipose tissue and have been demonstrated to promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs, including the myocardium, bone, and skin1. Recent research suggests that the regenerative function of ADSCs may be due to intercellular contact and the paracrine effects of the cells2. The paracrine effect is an important means for cells to interact and transfer information over short distances, and this function is achieved through extracellular vesicles (EVs).
EVs are double-layer membrane structures produced by cells, with a diameter ranging from 40 nm to 160 nm (with an average of about 100 nm). They affect different cellular functions, such as cytokine production, cell proliferation, apoptosis, and metabolism3,4. Numerous studies have been conducted on the functions of ADSC EVs, including promoting bone regeneration, oral mucosal tissue regeneration, adipose tissue survival after tissue transplantation, and skin wound repair5,6,7,8. The enormous potential of ADSC EVs in regenerative medicine is evident. Various methods exist for extracting and separating EVs from the supernatant, such as techniques based on centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. The ultracentrifugation method is widely considered the gold standard for isolating EVs9. The fundamental principle of ultracentrifugation for EV separation is based on the fact that particles in the sample have varying sedimentation coefficients, resulting in their sedimentation and aggregation in distinct separation layers. Nevertheless, a detailed protocol emphasizing precautions during ultracentrifugation has not yet been established.
Therefore, this study objectively outlines the ADSC culture, supernatant collection, and EVs ultracentrifugation procedures and key points with a logical flow of information and clear, formal language. This provides a valuable reference for future experiments.

מחבר זרקור: סטנדרטיזציה ושיפור המיצוי והטיהור של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-ADSCs אנושיים

טיהור ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי

Our research focuses on the preparation and purification of extracellular vesicles from human adipose-derived mesenchymal stem cells. The problem we want to solve is how to standardize this process and improve the purification efficiency. Currently, there are many technologies used to extract extracellular vesicles, such as ultracentrifugation, ultrafiltration, volume exclusion chromatography, polymer precipitation, immunoaffinity capture, microfluidic technology, and so on.However, ultracentrifugation is recognized as a gold standard, admittedly. In the future, we will focus on the application of extracellular vesicles as vectors, including carrying MRNA, plasmids, and other small molecules and transfecting them into cells.

ראשית, ADSCs אופיינו וזוהו, כולל המורפולוגיה10 שלהם ונוגדנים פני השטח. בהתבסס על איור 2A, נראה ש-ADSCs מסודרים בצורת ציר ויוצרים מערבולת לאחר צמיחה צפופה. התאים בתרבית התמינו לתאים אדיפוגניים, אוסטאוגניים וכונדרוגניים ונצבעו באדום שמן O, אדום אליזרין וכחול אלקיאן<sup cl...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Standardizing and Improving the Extraction and Purification of Extracellular Vesicles from Human ADSCs at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר את כל ההליכים, החל מגידול תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי (ADSCs) ואיסוף סופרנאטנט ועד לחילוץ בועיות חוץ-תאיות (EVs) באמצעות אולטרה-צנטריפוגה.

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...

המחקר שלנו מתמקד בהכנה וטיהור של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי. הבעיה שאנחנו רוצים לפתור היא איך לתקנן את התהליך הזה ולשפר את יעילות הטיהור. כיום, ישנן טכנולוגיות רבות המשמשות לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות, כגון אולטרה-צנטריפוגה, אולטרה-סינון, כרומטוגרפיה של אי הכללת נפח, משקעים פולימריים, לכידת זיקה חיסונית, טכנולוגיה מיקרופלואידית וכן הלאה.עם זאת, ultracentrifugation מוכר תקן זהב, יש להודות. בעתיד נתמקד ביישום שלפוחיות חוץ-תאיות כווקטורים, כולל נשיאת MRNA, פלסמידים ומולקולות קטנות אחרות והעברתם לתאים.

purification-characterization-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

401 Views.  Chinese PLA General Hospital. המחקר שלנו מתמקד בהכנה וטיהור של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי. הבעיה שאנחנו רוצים לפתור היא איך לתקנן את התהליך הזה ולשפר את יעילות הטיהור. כיום, ישנן טכנולוגיות רבות המשמשות לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות, כגון אולטרה-צנטריפוגה, אולטרה-סינון, כרומט...

Video: מחבר זרקור: סטנדרטיזציה ושיפור המיצוי והטיהור של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-ADSCs אנושיים

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

Resuscitation and Culture of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells (ADSCs) for Extracellular Vesicle Extraction

To begin, retrieve two cryopreservation tubes containing frozen human adipose-derived mesenchymal stem cells at passage three from liquid nitrogen. Agitate them in a 37 degree Celsius water bath until fully thawed. Then disinfect the tubes using 75%alcohol.Place the disinfected tubes on an ultra-clean table. Using a pipette, aspirate the cell suspension and transfer it to a 15 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube in a low speed centrifuge at 250 G and four degrees Celsius for five minutes.Meanwhile, prepare four 10-centimeter culture dishes and add nine milliliters of medium to each dish. Mark the name, cell type, generation, and the experiment date on each dish. Then preheat them in a 37 degree Celsius thermostatic cell incubator.Once the five minute centrifugation is over, disinfect the centrifuge tube before moving it to an ultra-clean table. Using a pipette, remove the supernatant and add four milliliters of medium to achieve the desired cell concentration. Gently agitate the solution until it is evenly dispersed.Next, add one milliliter of cell suspension to each preheated dish and shake it by agitating the same on a level surface in a cross pattern. Observe the cells at 40x magnification under an optical microscope before placing the dishes into the 37 degree Celsius incubator. On day two, observe the cell state under the optical microscope at 40x magnification before proceeding for exchange medium preparation.After disinfection, transfer the culture dishes to an ultra-clean table with Biosafety Level 2. Remove the medium from each culture dish. Rinse the dish gently with two milliliters of PBS solution twice and add 10 milliliters of medium to each dish.Transfer the cells to the incubator until they're ready for supernatant collection.

החייאה ותרבית של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן (ADSCs) למיצוי שלפוחית חוץ-תאית

Extracting Extracellular Vesicles (EVs) from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell Culture

To begin, collect the supernatant from the human adipose-derived mesenchymal stem cell culture once the cells are 80%confluent. Collect the supernatant carefully using a pipette and transfer it to a 50 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 300 x g for 10 minutes at room temperature to remove suspended cells, then use a pipette to collect the supernatant without disturbing the pellet.Centrifuge the supernatant at 2000 x g for 10 minutes at four degrees Celsius to remove cellular debris. Collect the resultant supernatant with a pipette and filter it through a 0.22 micron membrane to remove large particles and cell debris. Subject the filtrate to ultra centrifugation at 10, 000 x g for 30 minutes at four degrees Celsius.Then perform a final centrifugation at 100, 000 x g for 70 minutes at four degrees Celsius. Using a pipette, remove the supernatant without collecting the pellet. Resuspend the pellet in PBS before centrifuging the tube at 100, 000 x g for 70 minutes at four degrees Celsius.Remove the supernatant and resuspend the obtained pellet of extracellular vesicles, or EVs, in one milliliter of PBS. Finally, transfer the EV suspension to a one milliliter centrifuge tube and store it at four degrees Celsius until further analysis. Transmission electron microscopy clearly revealed the cup-shaped structure of the EVs with a bilayer membrane.Nanoparticle tracking analysis indicated that they have a particle size distribution of around 50 to 150 nanometers. Western blot analysis showed that the characteristic marker proteins of EVs were expressed smoothly.