עבודה זו נתמכה על ידי מענק מספר "PGC2018-095795-B-I00" מ- Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) ועל ידי מענקים "Grupo de Referencia: E35_17R" ומענק מספר "LMP220_21" מ- Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) ל- PF-S ו- RM-L.

שבירה מיטוכונדריאלית בדגימות רקמה קטנות לאנליזה סופר-מורכבת

<ol>
	<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li><li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes.">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li><li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+respiratory+supercomplexes:+the+plasticity+model.">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li><li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes.">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes.">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li><li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes.">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes.">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).</li><li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly,+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain.">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li><li>Moreno-Loshuertos, R., Fern&#225;ndez-Silva, P., Ostojic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li><li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells:+structural+versus+functional+role.">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li><li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes.">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases.">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li><li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system:+implications+for+pathology.">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).</li><li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex.">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li><li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition.">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li><li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients.">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases.">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).</li><li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism.">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li><li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+supercomplexes:+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders.">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).</li><li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging.">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li><li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer.">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance.">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).</li><li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer.">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).</li><li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells.">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).</li><li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+hot+can+mitochondria+be?+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria.">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li><li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane.">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li><li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1.">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li><li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV.">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li><li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity.">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452 (2011).</li><li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle:+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity.">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).</li><li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes.">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells:+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers.">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li><li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants.">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Vizarra, E., Fern&#225;ndez-Silva, P., Enr&#237;quez, J. A., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).</li><li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enr&#237;quez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page.">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

ההתאמות המתודולוגיות שהוכנסו בפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו למנוע הפסדים ולהגדיל את התשואה תוך שמירה על פעילויות מורכבות במיטוכונדריה (שהיא חיונית כאשר הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות נפגעת) ולשחזר את התבנית הצפויה של SCs ברקמה או בקו התא (ראו איור 2C). למטרה זו ומכיוון ...

סופרקומפלקסים (SCs) הם קשרים על-מולקולריים בין קומפלקסים בודדים של שרשרת הנשימה 1,2. מאז הזיהוי הראשוני של SCs ותיאור הרכבם על ידי קבוצת Schägger 2,3, שאושר מאוחר יותר על ידי קבוצות אחרות, נקבע כי הם מכילים מתחמי נשימה I, III ו- IV (CI, CIII ו- CIV, בהתאמה) בסטואיכיומטריות שונות. ניתן להגדיר שתי אוכלוסיות עיקריות של SCs, אלה המכילות CI (ו- CIII בלבד או CIII ו- CIV) ובעלות משקל מולקולרי גבוה מאוד (MW, החל ~ 1.5 MDa עבור SC הקטן יותר: CI + CIII2) ואלה המכילות CIII ו- CIV אך לא CIV, עם גודל קטן בהרבה (כגון CIII2 + CIV עם ~ 680 kDa). SCs אלה מתקיימים יחד בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי עם קומפלקסים חופשיים, גם בפרופורציות שונות. לכן, בעוד CI נמצא בעיקר בצורותיו הקשורות (כלומר, ב- SCs: ~ 80% בלב בקר ויותר מ -90% בסוגי תאים אנושיים רבים)3, CIV שופע מאוד בצורתו החופשית (יותר מ -80% בלב בקר), כאשר CIII מראה התפלגות מאוזנת יותר (~ 40% בצורתו החופשית השופעת יותר, כעמום, בלב בקר).
בעוד קיומם מקובל כיום, תפקידם המדויק עדיין נתון לוויכוח 4,5,6,7,8,9,10. על פי מודל הפלסטיות, פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בודדים יכולים להתקיים בהתאם לסוג התא או למצב המטבולי 1,7,11. אופי דינמי זה של ההרכבה יאפשר לתאים לווסת את השימוש בדלקים זמינים ואת היעילות של מערכת הזרחן החמצוני (OXPHOS) בתגובה לשינויים סביבתיים 4,5,7. SCs יכולים גם לתרום לשליטה בקצב ייצור מיני חמצן תגובתי ולהשתתף בייצוב ותחלופה של קומפלקסים בודדים 4,12,13,14. שינויים בסטטוס ההרכבה של SC תוארו בהקשר של מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים15,16 ועם תהליך ההזדקנות17.
לפיכך, שינויים בדפוסי SC תוארו בשמרים בהתאם למקור הפחמן המשמש לצמיחה2 ובתאי יונקים בתרבית כאשר גלוקוז מוחלף בגלקטוז4. שינויים דווחו גם בכבד עכברים לאחר צום8 ובאסטרוציטים כאשר חמצון חומצות השומן המיטוכונדריאלי נחסם18. בנוסף, ירידה או שינויים ב- SCs ו- OXPHOS נמצאו בתסמונת בארת19, אי ספיקת לב20, מספר הפרעות מטבוליות21 ונוירולוגיות 22,23,24, וגידולים שונים 25,26,27,28 . השאלה אם שינויים אלה בהרכבה וברמות SC הם הגורם העיקרי או מייצגים השפעות משניות במצבים פתולוגיים אלה עדיין נחקרת15,16. מתודולוגיות שונות יכולות לתת מידע על הרכבה ותפקוד של SCs; אלה כוללים מדידות פעילות 8,29, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי30,31 ופרוטאומיקה32,33. חלופה שימושית שנמצאת בשימוש הולך וגובר ומהווה את נקודת המוצא לחלק מהמתודולוגיות שהוזכרו לעיל היא הקביעה הישירה של מצב הרכבה SC על ידי אלקטרופורזה מקורית כחולה (BN) שפותחה למטרה זו על ידי קבוצתו של Schägger34,35.
גישה זו דורשת פרוצדורות ניתנות לשחזור ויעילות כדי להשיג ולהמיס קרומי מיטוכונדריה וניתן להשלים אותה על ידי טכניקות אחרות כגון ניתוח פעילות בג'ל (IGA), אלקטרופורזה מממד שני וכתם מערבי (WB). מגבלה במחקרים על דינמיקת SC על ידי אלקטרופורזה BN יכולה להיות כמות התאים ההתחלתיים או דגימות רקמות. אנו מציגים סדרה של פרוטוקולים לניתוח הרכבה ותפקוד SC, המותאמים לשיטות הקבוצה של Schägger, שניתן ליישם על דגימות תאים או רקמות טריות או קפואות החל מ -20 מ"ג רקמה בלבד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis Tris</td>
			<td>Acrons Organics</td>
			<td>327721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue G-250</td>
			<td>Serva</td>
			<td>17524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue R-250</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1125530025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamino&#160; benzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acids free BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10775835001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Teflon pestle</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>196102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>121512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>121509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>MTOL-P0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCO1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN1001BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Running Buffer (20x)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDUFA9 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium salt (NBT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pb(NO3)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDVF Membrane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>10600023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methasulfate (PMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDHA Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin/penicillin</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UQCRC1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria for mitochondrial supercomplex analysis from small tissue and cell culture samples 

במהלך העשורים האחרונים, הראיות שהצטברו על קיומם של סופרקומפלקסים נשימתיים (SCs) שינו את הבנתנו את ארגון שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה, והולידו את הצעת "מודל הפלסטיות". מודל זה מניח את הדו-קיום של פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בהתאם לרקמה או למצב חילוף החומרים הסלולרי. האופי הדינמי של ההרכבה ב-SCs יאפשר לתאים לייעל את השימוש בדלקים זמינים ואת יעילות העברת האלקטרונים, למזער את ייצור מיני החמצן הריאקטיביים ולהעדיף את יכולתם של התאים להסתגל לשינויים סביבתיים. 
לאחרונה דווח על חריגות בהרכבת SC במחלות שונות כגון הפרעות נוירודגנרטיביות (אלצהיימר ופרקינסון), תסמונת בארת', תסמונת לי או סרטן. התפקיד של שינויים הרכבה SC בהתקדמות המחלה עדיין צריך להיות מאושר. עם זאת, הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות כדי לקבוע את מצב הרכבה SC הוא לעתים קרובות אתגר. זה קורה עם ביופסיה או דגימות רקמה קטנות או שיש לחלק אותן לניתוחים מרובים, עם תרביות תאים שיש להם צמיחה איטית או מגיעים מהתקנים מיקרופלואידים, עם כמה תרביות ראשוניות או תאים נדירים, או כאשר יש לנתח את ההשפעה של טיפולים יקרים מסוימים (עם ננו-חלקיקים, תרכובות יקרות מאוד וכו '). במקרים אלה נדרשת שיטה יעילה וקלה ליישום. מאמר זה מציג שיטה המותאמת להשגת שברים מיטוכונדריאליים מועשרים מכמויות קטנות של תאים או רקמות כדי לנתח את המבנה והתפקוד של SCs מיטוכונדריאליים על ידי אלקטרופורזה טבעית ואחריה בדיקות פעילות בג'ל או כתם מערבי.

Supercomplexes (SCs) are supramolecular associations between individual respiratory chain complexes1,2. Since the initial identification of SCs and the description of their composition by the group of Sch&#228;gger2,3, later confirmed by other groups, it was established that they contain respiratory complexes I, III, and IV (CI, CIII, and CIV, respectively) in different stoichiometries. Two main populations of SCs can be defined, those containing CI (and either CIII alone or CIII and CIV) and with very high molecular weight (MW, starting ~1.5 MDa for the smaller SC: CI + CIII2) and those containing CIII and CIV but not CI, with much smaller size (such as CIII2 + CIV with ~680 kDa). These SCs coexist in the inner mitochondrial membrane with free complexes, also in different proportions. Thus, while CI is mostly found in its associated forms (that is, in SCs: ~80% in bovine heart and more than 90% in many human cell types)3, CIV is very abundant in its free form (more than 80% in bovine heart), with CIII showing a more balanced distribution (~40% in its more abundant free form, as a dimer, in bovine heart).
While their existence is now generally accepted, their precise role is still under debate4,5,6,7,8,9,10. According to the plasticity model, different proportions of SCs and individual complexes can exist depending on the cell type or the metabolic status1,7,11. This dynamic nature of the assembly would allow cells to regulate the use of available fuels and the efficiency of the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system in response to environmental changes4,5,7. SCs could also contribute to control the reactive oxygen species generation rate and participate in the stabilization and turnover of individual complexes4,12,13,14. Modifications of the SC assembly status have been described in association with different physiological and pathological situations15,16 and with the aging process17.
Thus, changes in the SC patterns have been described in yeast depending on the carbon source used for growth2&#160;and in cultured mammalian cells when glucose is substituted by galactose4. Modifications have also been reported in mouse liver after fasting8 and in astrocytes when mitochondrial fatty acid oxidation is blocked18. In addition, a decrease or alterations in SCs and OXPHOS have been found in Barth syndrome19, heart failure20, several metabolic21 and neurological22,23,24 disorders, and different tumors25,26,27,28. Whether these alterations in SC assembly and levels are a primary cause or represent secondary effects in these pathological situations is still under investigation15,16. Different methodologies can give information about the assembly and function of SCs; these include activity measurements8,29, ultrastructural analysis30,31, and proteomics32,33. A useful alternative that is increasingly being employed and is the starting point for some of the previously mentioned methodologies is the direct determination of SC assembly status by Blue native (BN) electrophoresis developed for this purpose by Sch&#228;gger&#39;s group34,35.
This approach requires reproducible and efficient procedures to obtain and solubilize mitochondrial membranes and can be complemented by other techniques such as in-gel activity analysis (IGA), second-dimension electrophoresis, and western blot (WB). A limitation in the studies on SC dynamics by BN electrophoresis can be the amount of starting cells or tissue samples. We present a series of protocols for the analysis of SC assembly and function, adapted from Sch&#228;gger&#39;s group methods, that can be applied to fresh or frozen cell or tissue samples starting from as little as 20 mg of tissue.

מחבר זרקור: חשיפת דינמיקה של מערכת זרחן חמצוני ותפקידים מיטוכונדריאליים בבריאות ובמחלות

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

Our research is focused on better understanding mitochondrial biogenesis, in particular, the OXPHOS System organization and Regulation, and also on defining the role that mitochondria play in diseases from cancer to neurodegenerative disorders. Mitochondria perform multiple and essential roles in the cell, conditioning its whole metabolism and survival. We're slowly increasing our knowledge of mitochondrial complexity, and its contribution to cell adaptation mechanisms in health and disease.We have contributed to establish a new organization model for the OXPHOS system, the plasticity model that integrates previous proposals and assumes the coexistence of super complexes and free complexes in different proportions to optimize its function and allow cellular adaptations. Our protocol allows starting from small tissues or cell culture samples to obtain enough mitochondrial protein amounts to analyze super complexes assembly and status and function by blue native electrophoresis or other techniques. We can do this reproducibly in a short time with a simple equipment and relatively with low costs.

תפוקת המיטוכונדריה המתקבלת בעקבות הפרוטוקולים המתוארים לעיל משתנה בהתאם למספר גורמים כגון קו התא או סוג הרקמה, אופי הדגימות (כלומר, אם נעשה שימוש ברקמות טריות או קפואות), או יעילות תהליך ההומוגניזציה. יבולים צפויים של מיטוכונדריה מקווי תאים ורקמות שונים נאספים בטבלה 2. לאחר קבלת ?...

Read this Scientific Article Protocol about Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

המחקר שלנו מתמקד בהבנה טובה יותר של ביוגנזה מיטוכונדריאלית, בפרט, הארגון והרגולציה של מערכת OXPHOS, וגם בהגדרת התפקיד שהמיטוכונדריה ממלאים במחלות מסרטן ועד הפרעות נוירודגנרטיביות. מיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרובים וחיוניים בתא, ומתנים את כל חילוף החומרים וההישרדות שלו. אנו מגדילים בהדרגה את הידע שלנו על מורכבות המיטוכונדריה, ותרומתה למנגנוני הסתגלות תאים בבריאות ובמחלות.תרמנו להקמת מודל ארגוני חדש למערכת OXPHOS, מודל הפלסטיות המשלב הצעות קודמות ומניח דו-קיום של קומפלקסים-על וקומפלקסים חופשיים בפרופורציות שונות כדי לייעל את תפקודו ולאפשר התאמות תאיות. הפרוטוקול שלנו מאפשר להתחיל מרקמות קטנות או דגימות תרבית תאים כדי לקבל מספיק כמויות חלבון מיטוכונדריאלי כדי לנתח קומפלקסים-על, הרכבה וסטטוס ותפקוד על ידי אלקטרופורזה מקורית כחולה או טכניקות אחרות. אנו יכולים לעשות זאת באופן משוחזר בזמן קצר עם ציוד פשוט יחסית עם עלויות נמוכות.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples 

643 Views.  University of Zaragoza. המחקר שלנו מתמקד בהבנה טובה יותר של ביוגנזה מיטוכונדריאלית, בפרט, הארגון והרגולציה של מערכת OXPHOS, וגם בהגדרת התפקיד שהמיטוכונדריה ממלאים במחלות מסרטן ועד הפרעות נוירודגנרטיביות. מיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרובים וחיוניים בתא, ומתנים את כל חילוף החומרים וההישרדות שלו. אנו ...

Video: מחבר זרקור: חשיפת דינמיקה של מערכת זרחן חמצוני ותפקידים מיטוכונדריאליים בבריאות ובמחלות

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial electron transport chain organization, giving rise to the proposal of the "plasticity model." This model postulates the coexistence of different proportions of SCs and complexes depending on the tissue or the cellular metabolic status. The dynamic nature of the assembly in SCs would allow cells to optimize the use of available fuels and the efficiency of electron transfer, minimizing reactive oxygen species generation and favoring the ability of cells to adapt to environmental changes. 
More recently, abnormalities in SC assembly have been reported in different diseases such as neurodegenerative disorders (Alzheimer's and Parkinson's disease), Barth Syndrome, Leigh syndrome, or cancer. The role of SC assembly alterations in disease progression still needs to be confirmed. Nevertheless, the availability of enough amounts of samples to determine the SC assembly status is often a challenge. This happens with biopsy or tissue samples that are small or have to be divided for multiple analyses, with cell cultures that have slow growth or come from microfluidic devices, with some primary cultures or rare cells, or when the effect of particular costly treatments has to be analyzed (with nanoparticles, very expensive compounds, etc.). In these cases, an efficient and easy-to-apply method is required. This paper presents a method adapted to obtain enriched mitochondrial fractions from small amounts of cells or tissues to analyze the structure and function of mitochondrial SCs by native electrophoresis followed by in-gel activity assays or western blot.

This protocol describes a technique for the analysis of respiratory supercomplexes when only small amounts of samples are available.