עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (42307173 ו-42107328) והתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח (2022YFD1500202 ו-2022YFF1001800). P.W, Z.X עיצבו את המחקר. P.W, B.X, Z.C, J.X ו-N.Z ניתחו את הנתונים ויצרו את הנתונים. פ"ו כתב את הטיוטה הראשונה של כתב היד. Z.X., R.Z. ו-Q.S. תיקנו את כתב היד.

פרוטוקול זה ישים בדרך כלל למיקרוביוטה של קרקע ריזוספרה מצמחים שונים. כאן, מלפפון משמש כדוגמה. פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. בידוד חיידקים
<ol><li>בידוד קרקע ריזוספרה<ol><li>תרבות מלפפונים<ol><li>יש לחטא זרעי מלפפון בתמיסת 75% אתנול ונתרן היפוכלוריט 2% (NaClO), ולאחר מכן לשטוף אותם במים סטריליים11.</li>
			<li>להנביט את הזרעים בתנאים סטריליים ולבחור את אלה המגיעים לשלב שני העלים12. לאחר מכן, השתילו את שתילי המלפפון המונבטים באופן עקבי בעציצים המכילים 2 ק"ג אדמה שחורה. הערה: שני סוגים של אדמה שחורה ממקומות שונים בצפון מזרח סין משמשים להפחתת טעויות שיטתיות.</li>
		</ol></li>
		<li>הכנת תרחיף קרקע<ol><li>הכן חיץ PBS-S באמצעות הנוסחה: 6.33 גרם של NaH2PO4· H2O, 16.5 גרם של Na2HPO4·7H2O, 200 μL של סילווט L-77, ו-1 ליטר מים מזוקקים.</li>
			<li>כאשר השתילים מגיעים לשלב12 בעל ארבעת העלים, הופכים את העציץ ומבודדים את השורשים יחד עם אדמת ריזוספירה בעובי 2 מ"מ באמצעות כפפות מעוקרות.</li>
			<li>מקם את השורשים בחיץ PBS-S של 30 מ"ל בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר ניעור של 20 דקות, סננו את המתלה דרך מסנן תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר כדי להסיר שורשים ומשקעים גדולים.</li>
			<li>מעבירים את התסנין לצינור צנטריפוגה נוסף של 50 מ"ל, צנטריפוגות אותו ב 3200 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ומאחסנים אותו באופן זמני ב -4 מעלות צלזיוס.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>מיצוי של תאי חיידקים בקרקע ריזוספרה. הערה: מתודולוגיה זו מאמצת את שיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית13, אם כי שיטת הצנטריפוגה ההדרגתית של צפיפות Nycodenz14 חלה גם על שלב זה.<ol><li>דללו את תרחיף הקרקע בתמיסת 0.2% Na4P2O7 ל-500 מ"ל וצנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 10 דקות כדי להפריד תחילה אורגניזמים מהקרקע.</li>
		<li>הומוגניזציה מחדש של המשקע, צנטריפוגה אותו באותה מהירות נמוכה במשך 60 שניות, ולחזור על התהליך שלוש פעמים. ערבבו את הסופרנאטנטים, צנטריפוגו אותם במהירות של 12,000 x גרם למשך 20 דקות, ואז השליכו את הסופרנאטנט.</li>
		<li>להשהות מחדש את המשקע ב 50 מ"ל של חיץ PBS-S, המהווה את השעיית תאי חיידקי הקרקע ריזוספרה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ריצוף וזיהוי מיקרוביוטה של ביופילם ריזוספירה
<ol><li>הכנת מדיה הערה: מרק סויה טריפטי (TSB) וחומרים עם מינימום מלחים גליצרול גלוטמט (MSgg) זמינים באופן מסחרי. הניסוחים שלהלן הם לעיון בלבד.<ol><li>הכן TSB בינוני באמצעות הנוסחה הבאה: 15 מיקרוגרם / מ"ל טריפטון, 5 מיקרוגרם / מ"ל פפטון סויה, 5 מיקרוגרם / מ"ל NaCl, pH = 7.</li>
		<li>הכן מדיום MSgg באמצעות הניסוח הבא: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3-(N-morpholino) פרופאן חומצה סולפונית (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM תיאמין, 0.5% גליצרול, 0.5% גלוטמט, 50 מיקרוגרם / מ"ל טריפטופן, 50 מיקרוגרם / מ"ל פנילאלנין, pH = 7.</li>
		<li>כדי להכין מדיית TSB-MSgg, ערבב מדיית TSB עם מדיית MSgg ביחס של 1:1 (v/v)15.</li>
	</ol></li>
	<li>קוקולטורה של ביופילם פליקל<ol><li>לדגור על תרחיף התא בתווך TSB ב 30 ° C במשך הלילה (בדרך כלל 12 שעות) כדי להפעיל את החיידקים.</li>
		<li>מניחים מסנני תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר על צלחות 24 בארות. לדגור על החיידקים במדיה TSB ולהגדיר שלוש חזרות. לטפח את biofilm pellicle במשך 36 שעות ב 30 ° C. הערה: אם הביופילם הכדורי מהשלב האחרון אינו מעובד היטב, מדיום TSB-MSgg הוא תחליף יעיל למדיום TSB.</li>
		<li>הסר את המסנן המכיל את הביופילם הכדורי. הוסף 2 מ"ל של חיץ PBS-S לצלחת תא חדשה של 24 בארות, מקם לתוכו את מסנן 24 הבארות כדי לשטוף את הביופילם, והסר את התאים החופשיים. חזרו על תהליך הכביסה שלוש פעמים.</li>
	</ol></li>
	<li>מיצוי DNA של ביופילם כדורי<ol><li>חלץ את גנום הביופילם באמצעות ערכת DNA בהתאם להוראות היצרן.</li>
	</ol></li>
	<li>ריצוף בתפוקה גבוהה הערה: חברות ביוטכנולוגיה יכולות לסייע בהשלמת ניסויי ריצוף עבור רוב המעבדות. אם יש צורך בהרכב מיקרוביאלי בתמיסה הנותרת, רצף אותו בשלב זה. שלב הרצף משתנה בהתאם למכשירים. פעל בהתאם להוראות היצרן. שלב 2.4.1 מיועד להמחשה בלבד.<ol><li>להגביר את אזורי V3-V4 של הגן 16S rRNA בהתבסס על מסד הנתונים עם רצפי גנים 16S rRNA באורך מלא. צור OTUs של מינים לפי מספר הרצפים המינימלי לכל מדגם16. קבץ את ביאורי סיווג המינים ורכוש את הרכבי הקהילות מכל מדגם.</li>
		<li>בהתבסס על נתוני הריצוף, בחרו את חמשת הזנים המובילים מבחינת השפע היחסי שלהם.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד חיידקים בתפוקה גבוהה ותרבית הערה: שלב זה מתוכנן על פי המתודולוגיה המיקרוביולוגית והביואינפורמטית העדכנית ביותר17. שיטת הצלחת המצופה בדילול זמינה כאן לבידוד חיידקים, אם כי היא גוזלת יותר זמן ופחות ממוקדת בהשוואה לטכניקות בעלות תפוקה גבוהה.<ol><li>מערבבים את הביופילם המתורבת. השתמשו בדילול מגביל כדי להבטיח שלא יותר מ-30% מהבארות בצלחת בת 24 הקידוחים יראו צמיחת חיידקים. הערה: כדי לקבוע את הדילול המתאים ביותר, בצע ניסויים מקדימים באמצעות מגוון רחב של קצבי דילול. הדילול האופטימלי צריך להכיל לא יותר משני חיידקים למיליליטר, המייצגים דגירה חיידקית בפחות מ -30% מהבארות.</li>
		<li>הגבירו את גן ה-rRNA 16S של החיידקים תוך הוספת תוויות לבארות וללוחות וריצוף שלהם באמצעות פלטפורמת Illumina בעלת התפוקה הגבוהה17.</li>
		<li>בצע ניתוחים ביואינפורמטיים באמצעות תוכנה זמינה מסחרית כדי לקבל מידע טקסונומי על טוהר ומינים עבור כל תרבות.</li>
		<li>טפחו את חמשת החיידקים הטהורים השופעים ביותר על ידי תרבית קו רציף והשתמשו בגליצרול כדי לשמר את החיידקים בטמפרטורה של -80°C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. בניית קהילות מיקרוביאליות סינתטיות
<ol><li>תרבות ביופילם משוחזרת הערה: לקבלת פרטים, עיין ב- Ren et al.18. 5 הזנים מתאימים ל-31 שילובים סינתטיים, כולל 5 מינים בודדים, 10 שני מינים, 10 שלושה מינים, 5 ארבעה מינים וקונסורציום אחד של חמישה מינים.<ol><li>דוגרים על 5 הזנים בתווך TSB עד שה-OD600 שלהם מגיע ל-1 כדי להפעיל אותם.</li>
		<li>הכינו מספר צלחות 24 בארות עם TSB בינוני והניחו עליהן מסנני תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר. הערה: אם הביופילם מהשלב האחרון אינו מעובד היטב, מדיום TSB-MSgg הוא תחליף יעיל למדיום TSB.</li>
		<li>לדגור על 31 שילובים של קהילות סינתטיות במדיום. ודא שמספר החיידקים החיסוני עקבי בכל באר. הגדר שלוש חזרות לכל שילוב.</li>
		<li>טפחו את הביופילם בטמפרטורה של 30°C למשך 36 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות של ביופילם כדורי<ol><li>בצע את אותו הליך כמו בשלב 2.2.3.</li>
		<li>מעבירים את הביופילם לצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה 180 מיקרוליטר של תמיסת קריסטל סגול ומכתימים אותה למשך 20 דקות.</li>
		<li>העבירו את הדגימה המוכתמת לצלחת אחרת בת 24 בארות המכילה 200 מיקרוליטר של 96% אתנול, פזרו אותה למשך 30 דקות ומדדו OD590.</li>
	</ol></li>
</ol>4. כימות מספר תא פליקל
הערה: כדי לקבוע את היחס של כל מין ואת ספירת התאים בתמיסה הכדורית והנותרת, יש צורך ב- PCR כמותי. לקבלת פרטים, עיין ב- Sun et al.16.
<ol><li>תכננו פריימרים ספציפיים לזנים עבור קהילות החיידקים הסינתטיים שנבחרו.</li>
	<li>השתמש ברוארי כדי לבצע השוואות גנום ולגלות את הגנים הספציפיים לזן של עותק יחיד של כל מבודד. ודא כי פריימרים ממוקדים לגנים אלה.</li>
	<li>ליגזה את השברים המוגברים לפלסמידים PMD19T. צור עקומות סטנדרטיות באמצעות פלסמידים המכילים מקטעים מתאימים כתבניות.</li>
	<li>בצע את אותם השלבים שהוזכרו בשלב 2.2.</li>
	<li>הכן רכיבי תגובה באופן הבא: 7.2 μL של H2O, 10 μL של 2x qPCR Master mix, 0.4 μL של 10 μM של כל פריימר, ו- 2 μL DNA של תבנית.</li>
	<li>בצע PCR עם מכשיר PCR בזמן אמת בתנאים הבאים: 95 ° C למשך 10 דקות, 40 מחזורים של 95 ° C עבור 30 שניות, ו- 60 ° C במשך 45 שניות, ולאחר מכן קטע עקומת התכה סטנדרטי.</li>
	<li>בצע שישה שכפולים ביולוגיים עבור כל טיפול.</li>
</ol>

פיתוח ביופילמים סינרגטיים ממינים מרובים מאדמת ריזוספרה

<ol>
	<li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li><li>Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+community+structure+of+the+rhizosphere.">Anatomy and community structure of the rhizosphere.</a> Rhizosphere. , 11-34 (1990).</li><li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health.">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).</li><li>Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-growth-promoting+rhizobacteria.">Plant-growth-promoting rhizobacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).</li><li>Compant, S., Cl&#233;ment, C., Sessitsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+bacteria+in+the+rhizo-+and+endosphere+of+plants:+Their+role,+colonization,+mechanisms+involved+and+prospects+for+utilization.">Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization.</a> Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).</li><li>Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocontrol+of+Bacillus+subtilis+against+infection+of+Arabidopsis+roots+by+Pseudomonas+syringae+is+facilitated+by+biofilm+formation+and+surfactin+production.">Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production.</a> Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).</li><li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbiome+interactions:+From+community+assembly+to+plant+health.">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+stimulates+resident+rhizosphere+Pseudomonas+stutzeri+for+plant+health+through+metabolic+interactions.">Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions.</a> ISME J. 16, 774-787 (2021).</li><li>Pandhal, J., Noirel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+ecosystems+for+biotechnology.">Synthetic microbial ecosystems for biotechnology.</a> Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).</li><li>Grosskopf, T., Soyer, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+microbial+communities.">Synthetic microbial communities.</a> Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana.+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota.">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528, 364-369 (2015).</li><li>Bakken, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+purification+of+bacteria+from+soil.">Separation and purification of bacteria from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).</li><li>Yang, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell+extraction+from+fresh+and+stored+soil+samples:+Impact+on+microbial+viability+and+community+compositions.">Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions.</a> Soil Biol Biochem. 155, 108178 (2021).</li><li>Ren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+multispecies+biofilm+formation+and+quantitative+PCR-based+assessment+of+individual+species+proportions,+useful+for+exploring+interspecific+bacterial+interactions.">High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions.</a> Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+interactions+affect+the+biomass+of+synthetic+bacterial+biofilm+communities.">Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities.</a> mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cultivation+and+identification+of+bacteria+from+the+plant+root+microbiota.">High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota.</a> Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).</li><li>Ren, D., Madsen, J. S., S&#248;rensen, S. J., Burnolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+biofilm+synergy+among+bacterial+soil+isolates+in+cocultures+indicates+bacterial+interspecific+cooperation.">High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation.</a> ISME J. 9, 81-89 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066 (2024).</li><li>Palkov&#225;, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+microorganisms:+Laboratory+versus+nature.">Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature.</a> EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+in+plant-microbe+beneficial+interactions:+a+toolbox+for+precise+management+of+beneficial+microbes.">Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes.</a> Curr Opin Microbiol. 72, 102269 (2023).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בהתאם לפרוטוקול, נבנות סדרה של קהילות ביופילם סינתטיות חזקות המבוססות על המיקרוביוטה באדמת ריזוספרה מצמחים שונים. באמצעות טכניקות PCR כמותיות, הרכב כל קהילה מפוענח בבירור. הביומסה של הביופילם מצביעה על עוצמת האינטראקציות המטבוליות הפוטנציאליות שלהם, אם כי תכונות ומנגנונים שונים מאחורי ש?...

ביופילמים מייצגים קהילות מיקרוביאליות מורכבות המודבקות על משטחים או מקושרות לממשקים. קיימת הכרה רחבה בכך שרוב החיידקים שנתקלים בהם בסביבות שונות, כגון סביבות טבעיות, סביבות קליניות והקשרים תעשייתיים, שורדים בתוך קהילות ביופילם1. באדמה, הריזוספרה – המקיפה את פני השטח של השורש ואת האזור הסמוך לו בעובי 2 מ"מ – יוצרת נישה אקולוגית עם זמינות מוגברת של חומרי מזון. חיידקים ספציפיים פיתחו אסטרטגיות לניצול נישה זו, טיפוח התרבות מיקרוביאלית וטיפוח היווצרות קהילות ביופילם בריזוספרה2.
מיקרובים ריזוספרה נחשבים ל"גנום השני" של צמחים3. מיקרואורגניזמים מעודדי גדילה של צמחים (PGPM) עוסקים בסימביוזה הדדית עם צמחים, ומספקים פונקציות משמעותיות לקידום צמיחה ובקרה ביולוגית4. מצד אחד, PGPM יכול לספק חומרים מזינים לשורשי הצמח, לשפר את ספיגת החומרים המזינים, להגן מפני פתוגנים ולפרק מזהמים באדמת הריזוספרה5. מצד שני, PGPM משתמש בהפרשה של שורשי צמחים כמקור תזונתי לצמיחה ואבולוציה, ובכך משפיע על אדמת הריזוספרה ועל מערכת השורשים באמצעות חילוף החומרים שלהם. ראוי לציין כי התנאי המוקדם לכל הפונקציות הללו הוא התיישבות יעילה של PGPM בריזוספרה הצמח, יצירת ביופילמים יציבים6.
ביופילם ריזוספרה משפיע על תהליך ההרכבה של מיקרובים ריזוספרה, והמאפיינים הרקתיים והמרחביים של הרכבת מיקרובי ריזוספרה קשורים קשר הדוק לאינטראקציה שלביופילם 7 של מינים מרובים. הוא משמש כמרכז של אינטראקציות צמחים-מיקרוביום, ומספק להם נישה יציבה ונשלטת לאינטראקציה יעילה. לכן, חקר ביופילם של ריזוספרה הוא גם כיוון חשוב להשגת תובנה לגבי האינטראקציה בין צמחים למיקרובים.
עם זאת, כיום יש מעט מחקר על ביופילמים מרובי מינים של ריזוספרה. המורכבות הגבוהה של הרכב המיקרוביום מקשה לענות על שאלות אקולוגיות בסיסיות סביב קהילות מיקרוביאליות טבעיות8. בתהליך הניסויים יש לקחת בחשבון תנאים רבים, כגון סוג הקרקע, סוג הצמח והמספר הגדול של קהילות מיקרוביות. גורמים שונים מגבילים את המחקר של ביופילמים מרובי מינים של ריזוספרה.
כדי להמשיך ולחקור קהילות ביופילם רב-מינים מאדמת ריזוספרה, כגון אינטראקציות סינרגטיות בין מינים או הזנה צולבת של מטבוליטים8, רצוי לבנות באופן מלאכותי קהילה מיקרוביאלית סינתטית פשוטה, מייצגת, יציבה וניתנת להסרה בתנאי מעבדה 9,10. כאן, פרוטוקול סטנדרטי משלב כמה מהטכניקות המיקרוביולוגיות והביואינפורמטיות העדכניות ביותר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 % Na4P2O7 solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>20041418</td>
			<td>Used to dilute the soil suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Nylon Cell Filter</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>F613463-0001</td>
			<td>Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% NaClO solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>L03336903</td>
			<td>Used to sterilize the seeds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>Merck &#38; Co., Inc.</td>
			<td>PSRP010</td>
			<td>Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Bioolook Scientific Research Special</td>
			<td>2360010</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% C2H5OH solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>801769680</td>
			<td>Used to sterilize the seeds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii XL-1</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strains isolated from rhizosphere soil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus velezensis SQR9</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strains isolated from rhizosphere soil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria DNA Kit</td>
			<td>Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.</td>
			<td>D3350020000K04U021</td>
			<td>Used to extract bacterial DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Soil I</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black soil from Jilin Province.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Soil II</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Black soil from Heilongjiang Province.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Strains isolated from rhizosphere soil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td>
			<td>10035048</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>G508009-0001</td>
			<td>High-speed centrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td>
			<td>Vazyme Biotech Co.,Ltd.</td>
			<td>Q311-02</td>
			<td>Used for DNA amplification in qPCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.</td>
			<td>NB026143</td>
			<td>Used for aseptic operation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd</td>
			<td>GNP-9080BS-<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Used for microbial cultivation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cristal Violet Dye</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>A600331</td>
			<td>Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cucumber Seed</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#34;Jinchun I&#34; cucumber seed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culturome v 1.0</td>
			<td>The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10011918</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge</td>
			<td>Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.</td>
			<td>BCD-556WKPM(Q)</td>
			<td>Used for strain preservation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Bioolook Scientific Research Special</td>
			<td>2180020</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroponic Planting Basket</td>
			<td>Yulv Furniture Store</td>
			<td>6526262626</td>
			<td>Used for cucumber hydroponics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td>
			<td>10017618</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td>
			<td>7791186</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td>
			<td>10400101</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msgg Medium</td>
			<td>Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.</td>
			<td>BES20791KB</td>
			<td>Pellicle biofilm culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Merck &#38; Co., Inc.</td>
			<td>S9390-100G</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCI</td>
			<td>Chinasun Specialty Products co., Ltd.</td>
			<td>HS0416</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Merck &#38; Co., Inc.</td>
			<td>S9638-25G</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-S Buffer</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>E607008-0001</td>
			<td>Basic buffer for living tissues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanine</td>
			<td>RYON</td>
			<td>RT3486L005</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>BS-1000-T</td>
			<td>Used for strain inoculation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMD19T Plasmid</td>
			<td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.</td>
			<td>D102A</td>
			<td>Used to generate qPCR standard curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pot</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>YHHWS2401</td>
			<td>Used for cucumber soil culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer for qPCR</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for DNA amplification in qPCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roary</td>
			<td>The Wellcome Trust SangerInstitute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to design primers of qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd</td>
			<td>ZQTY-50S</td>
			<td>Used for solution mixing and microbial cultivation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.</td>
			<td>SL77080596</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy peptone</td>
			<td>Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd</td>
			<td>HB8275</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.</td>
			<td>76713100010</td>
			<td>Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td>
			<td>SW150302</td>
			<td>Used to wash the pellicle biofilm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized Nitrile Gloves</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>223016852LLZA</td>
			<td>Used for basic experimental operations.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template DNA</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for DNA amplification in qPCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Bioolook Scientific Research Special</td>
			<td>2180020</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td>Used to prepare TSB media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>Bioolook Scientific Research Special</td>
			<td>2190020</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Medium</td>
			<td>Guangdong Huankai Microbial Sci. &#38; Tech. Co.,Ltd.</td>
			<td>024048</td>
			<td>Broad-spectrum bacterial medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB-Msgg Meidium</td>
			<td>Nanjing Agricultural University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>C0310520123</td>
			<td>Used to prepare MSgg media.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an approach to constructing multispecies biofilm communities from rhizosphere soil

הביופילם הרב-מיני הוא אורח חיים טבעי ודומיננטי של חיידקים בטבע, כולל באדמת ריזוספרה, אם כי ההבנה הנוכחית שלו מוגבלת. כאן, אנו מספקים גישה להקמת קהילות ביופילם סינרגטיות של מינים מרובים. הצעד הראשון הוא לחלץ תאים מאדמת ריזוספרה בשיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית. לאחר מכן, תאי אדמה אלה מחוסנים לתוך מדיום התרבית כדי ליצור ביופילם כדורי. לאחר 36 שעות של דגירה, הרכב החיידקים של הביופילם והתמיסה שמתחתיו נקבעים באמצעות שיטת ריצוף הגן rRNA 16S. בינתיים, בידוד חיידקים בתפוקה גבוהה מביופילם כדורי מתבצע בשיטת הדילול המגביל. לאחר מכן, 5 טקסי החיידקים המובילים נבחרים עם השפע הגבוה ביותר בנתוני ריצוף הגן rRNA 16S (דגימות ביופילם pellicle) לשימוש נוסף בבניית קהילות ביופילם מרובות מינים. כל השילובים של 5 טקסי החיידקים נקבעו במהירות באמצעות צלחת בת 24 בארות, שנבחרה עבור יכולת היווצרות הביופילם החזקה ביותר על ידי בדיקת צביעת הקריסטל הסגול, וכומתה על ידי qPCR. לבסוף, קהילות הביופילם הסינתטיות החזקות ביותר של חיידקים מרובי מינים הושגו באמצעות השיטות לעיל. מתודולוגיה זו מספקת הדרכה אינפורמטיבית לביצוע מחקר על ביופילם מרובה מינים של ריזוספרה וזיהוי קהילות מייצגות לחקר העקרונות השולטים באינטראקציות בין מינים אלה.

Biofilms represent intricate microbial communities either affixed to surfaces or linked with interfaces. There is broad acknowledgment that the majority of bacteria encountered in various environments, such as natural habitats, clinical settings, and industrial contexts, endure within biofilm communities1. In soil, the rhizosphere&#8212;encompassing the root surface and its adjacent 2 mm thick region&#8212;forms an ecological niche with heightened nutrient availability. Specific bacteria have evolved strategies to exploit this niche, fostering microbial proliferation and fostering the formation of biofilm communities in the rhizosphere2.
Rhizosphere microbes are considered the &#39;second genome&#39; of plants3. Plant growth-promoting microorganisms (PGPM) engage in mutualistic symbiosis with plants, providing significant growth promotion and biocontrol functions4. On the one hand, PGPM can supply nutrients to plant roots, enhance nutrient uptake, defend against pathogens, and degrade pollutants in the rhizosphere soil5. On the other hand, PGPM utilizes plant root exudates as a nutrient source for growth and evolution, thereby influencing the rhizosphere soil and root system through their own metabolism. It is worth noting that the prerequisite for all these functions is the effective colonization of PGPM in the plant rhizosphere, forming stable biofilms6.
Rhizosphere biofilm affects the assembly process of rhizosphere microbes, and the temporal and spatial characteristics of rhizosphere microbe assembly are closely related to the interaction of multispecies biofilm7. It serves as the hub of plant-microbiome interactions, providing a stable and controllable niche for them&#160;to interact effectively. Therefore, studying rhizosphere biofilm is also an important direction to gain insight into the interaction between plants and microbes.
However, there is currently little research on rhizosphere multispecies biofilms. The high complexity of microbiome composition makes it challenging to answer fundamental ecological questions surrounding natural microbial communities8. In the process of experiments, many conditions, such as soil type, plant type, and the large number of microbial communities, need to be considered. Various factors limit the research of rhizosphere multispecies biofilms.
To further investigate multispecies biofilm communities from rhizosphere soil, such as interspecies synergistic interactions or metabolite cross-feeding8, it is desirable to artificially construct a simplified, representative, stable, and tractable synthetic microbial community under laboratory conditions9,10. Here, a standardized protocol combines several of the latest microbiological and bioinformatic techniques.

מחבר זרקור: פיתוח קהילות מיקרוביאליות סינתטיות לייצור דשנים ביולוגיים מהדור השני

גישה לבניית קהילות ביופילם רב-מינים מאדמת ריזוספרה

In our research, we focus on rhizosphere bacteria and biofertilizers, and we aim to develop a synthetic bacterial communities that will be used as second-generation biofertilizers. The focus of our research on rhizosphere bacteria has shift from single-strain to community-level. However, there is no standard methods for building synthetic bacterial communities.Currently, there is still uncertainty regarding the compatibility and colonization ability of synthetic bacterial communities predicted by microbiome analysis. Thus, it is also a major bottleneck in the development of second-generation biofertilizers. Compared to large sequencing data of conventional methods, our culture first, identify later approach greatly reduces the amount of work involved in 60S rRNA gene sequencing.It is cost-effective to create synthetic bacterial communities that colonize roots quickly and efficiently. Our future research will focus on biological function of bacterial communities based on multispecies biofilms, and we will pay particular attention to promoting plant growth, improve plant stress resistance, and protecting plant health.

בעקבות ההליך שהוזכר, נצפים שיפועים משמעותיים ביכולת יצירת הביופילם ממיקרוביוטת הקרקע של ריזוספרה מלפפון (איור 1). ריצוף אמפליקון ביופילם אישר את המין בכדורית (איור 2). בהתבסס על מיפוי החום של נתוני ריצוף, נבחרו חמשת מיני החיידקים המובילים שהשפע שלהם בכדורית ...

כאן מוצג הליך מהיר וסטנדרטי להקמת קהילות ביופילם סינרגטיות מרובות מינים מקרקעות ריזוספרה שונות. זהו פרוטוקול ייחודי שנועד לחקור ולדמות את המיקרוביוטה המורכבת של קרקע ריזוספרה.

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

an-approach-to-constructing-multispecies-biofilm-communities-from

Research

JoVE Journal

Biology

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

489 Views.  Nanjing Agricultural University. במחקר שלנו, אנו מתמקדים בחיידקי ריזוספרה ודשנים ביולוגיים, ואנו שואפים לפתח קהילת חיידקים סינתטיים שתשמש כדשנים ביולוגיים מהדור השני. מוקד המחקר שלנו בחיידקי ריזוספרה עבר מזן יחיד לרמת הקהילה. עם זאת, אין שיטות סטנדרטיות לבניית קהילות חיידקים סינתטיים.

Video: מחבר זרקור: פיתוח קהילות מיקרוביאליות סינתטיות לייצור דשנים ביולוגיים מהדור השני

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current understanding of it is limited. Here, we provide an approach to rapidly establish synergistic multispecies biofilm communities. The first step is to extract cells from rhizosphere soil using the differential centrifugation method. Afterward, these soil cells are inoculated into the culture medium to form pellicle biofilm. After 36 h of incubation, the bacterial composition of the biofilm and the solution underneath are determined using the 16S rRNA gene amplicon sequencing method. Meanwhile, high-throughput bacterial isolation from pellicle biofilm is conducted using the limiting dilution method. Then, the top 5 bacterial taxa are selected with the highest abundance in the 16S rRNA gene amplicon sequencing data (pellicle biofilm samples) for further use in constructing multispecies biofilm communities. All combinations of the 5 bacterial taxa were quickly established using a 24-well plate, selected for the strongest biofilm formation ability by the crystal violet staining assay, and quantified by qPCR. Finally, the most robust synthetic bacterial multispecies biofilm communities were obtained through the methods above. This methodology provides informative guidance for conducting research on rhizosphere multispecies biofilm and identifying representative communities for studying the principles governing interactions among these species.

A rapid and standardized procedure for establishing synergistic multispecies biofilm communities from various rhizosphere soils is presented here. It is a unique protocol designed to probe and simulate the complex rhizosphere soil microbiota.

Constructing Multispecies Biofilms from Rhizosphere Samples for Developing Advanced Biofertilizers

To begin, obtain cucumber seeds and disinfect them with 75%ethanol, followed by 2%sodium hypochlorite solution. After rinsing the seeds in sterile water, germinate them under sterile conditions. Transplant the consistently sprouted, two-leaf stage seedlings into pots containing two kilograms of black soil.When the seedlings reach the four-leaf stage, invert the pot and isolate the roots along with two millimeter thick rhizosphere soil using sterilized gloves. Place the roots in 30 milliliters of PBSS buffer in a 50 milliliter centrifuge tube. Shake the tube for 20 minutes and filter the suspension through a 100 micrometer nylon cell filter to remove roots or large sediments.Transfer the filtrate to another 50 milliliter centrifuge tube and centrifuge it at 3, 200 G for 15 minutes at room temperature. Temporarily store the tube at four degrees Celsius before extraction of rhizosphere soil bacterial cells.

בניית ביופילמים מרובי מינים מדגימות ריזוספרה לפיתוח דשנים ביולוגיים מתקדמים

Sequencing and Identification of Multispecies Biofilm Microbiota from Rhizosphere Samples

To begin, establish a multi-species rhizosphere biofilm, and obtain the microbiota cell suspension. Mix triptych soy broth media with minimal salts glycerol glutamate media in a one-to-one ratio. Incubate the cell suspension in the medium at 30 degrees Celsius overnight to activate the bacteria.Place 100 micrometer nylon cell filters on a 24 well plate. Inoculate the bacterial suspension in three replicates and cultivate the pellicle biofilm for 36 hours at 30 degrees Celsius. Remove the filter containing the pellicle biofilm and add two milliliters of PBSS buffer to a new 24 well cell plate.Place the filter into the plate to wash the biofilm and remove the free cells. After identification and cultivation of the main five species in the biofilm, incubate the 31 combinations of synthetic communities in the medium. Following the mentioned procedure, significant gradients in biofilm-forming capacity from cucumber rhizosphere soil microbiota were observed.Biofilm amplicon sequencing confirmed the presence of various species in the pellicle.