לפני תחילת assay, אנחנו צריכים לוודא כי ריאגנטים הבאים מוכנים כראוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 50 מ&quot;מ הצפת אשלגן, pH 7.5. הכן באמצעות 11.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​phospate dibasic אשלגן, הידראט של מים מטוהרים והתאמת pH עם 1M HCl. פתרון זה ממוקם ב 37 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.65% משקל / נפח פתרון קזאין, שהוכן על ידי ערבוב של 6.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של קזאין ב חיץ 50 mM אשלגן זרחתי. בהדרגה הגדילו את הטמפרטורה פתרון עם ערבוב עדין 80-85 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות עד פיזור אחיד מושגת. חשוב מאוד לא להרתיח את הפתרון. PH הוא מותאם אז אם יש צורך עם NaOH ו HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 110 חומצה Trichloroacetic פתרון מ&quot;מ, שהוכן על ידי דילול המניות 1:55 6.1N עם מים מטוהרים. חומצה Trichloroacetic היא חומצה חזקה יש לנהוג בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 mM Folin &amp;, או מגיב Ciolcaltea של פנול של Folin, המהווה את הפתרון יגיב עם טירוזין לחולל שינוי צבע למדידה יהיה קשור ישירות לפעילות של פרוטאזות. מגיב פנול של Folin היא חומצה וצריך לטפל בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן 500 mM פתרון קרבונט, שהוכן באמצעות 53 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של סודיום קרבונט anyhydrous של מים מטוהרים. פתרון diluent האנזים, אשר מורכב של 10 הצפת נתרן אצטט מ&quot;מ עם Acetate סידן 5mm, pH 7.5, בשעה 37 ° C. פתרון זה מה שאנו משתמשים בו כדי להמיס דגימות פרוטאז מוצק או לדלל פתרונות האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המניה 1.1 mM L-tyrosine תקן פתרון. הוכן באמצעות 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​L-tyrosine ב מטוהרים מים מחוממים בעדינות עד טירוזין נמס. כמו קזאין, אינם להרתיח את הפתרון הזה. אפשר תקן L-tyrosine כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. פתרון זה יהיה מדולל יותר כדי להפוך עקומת הרגילה שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטאז פתרון. מיד לפני השימוש, לפזר פרוטאז בפתרון diluent אנזים מוכן בשלב 6. </li></ol> במידת הצורך, להשתמש במדגם פרוטאז מוצק של פעילות קבועה מראש, אשר מומס באמצעות diluent האנזים 0.1-0.2 יחידות / מ&quot;ל. פתרון זה משמש כביקורת חיובית assay בקרת איכות כמו אימות עבור החישובים נבצע לקביעת פעילות האנזים. הגדרת Assay פרוטאז ועקומות רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את זה assay, למצוא בקבוקוני מתאים אשר יחזיקו כ - 15 MLS. במשך כל אנזים זה תיבחן, 4 צלוחיות נדרשים. בקבוקון אחד ישמש ריק, ושלושה אחרים ישמשו לפעילות assay של שלושה דילולים של פרוטאז. שלושה דילולים שימושיים בעת בדיקת חישובים הסופית אחד נגד השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר כל אחד של ארבעה בקבוקונים, להוסיף 5mls של הפתרון שלנו 0.65% קזאין. תנו להם לאזן באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שונות כרכים של פתרון אנזים ייבדקו שלוש צלוחיות של מדגם הבדיקה, אך לא ריקה. מערבבים על ידי מתערבלים דגירה של 37 מעלות בדיוק עשר דקות. פעילות הפרוטאז והשחרור תוצאתי של טירוזין במהלך תקופה זו הדגירה היא מה יהיה נמדד בהשוואה בין דגימות הבדיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה זה 10 דקות, מוסיפים את 5 ה-MLS של מגיב TCA על צינור אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של תמיסת האנזים צינור אחד, אפילו ריק, כך נפח הסופי של פתרון האנזים במבחנה כל 1 מ&quot;ל. הדבר נעשה על חשבון הערך ספיגת של האנזים עצמו כדי להבטיח את הנפח הסופי במבחנה כל שווה. דגירה הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה זה 30 דקות, ייתכן שתרצה להגדיר דילולים תקן טירוזין שלך. השתמש ב-DRAM 6 צלוחיות (צלוחיות DRAM ניתן להחליף עם צינורות פוליפרופילן) אשר יכול בקלות להחזיק 8 MLS. כדי שש צלוחיות, להוסיף את הפתרונות 1.1 mM טירוזין מניות רגיל עם הכרכים הבאים MLS: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50. אין להוסיף שום תקן טירוזין על ריק. סטנדרטים התחתון עשוי להיות נחוץ עבור דגימות מבחן טמא שיניבו שינוי צבע קטנה. לאחר פתרון סטנדרטי טירוזין נוספה, להוסיף נפח מתאים של מים מטוהרים לכל הסטנדרטים להביא את נפח 2-MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 30 דקות, לסנן כל הפתרונות מבחן ריק באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק הסינון. סינון נדרשת להסיר כל insolubles מן הדגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הסינון 2 MLS של דגימות בדיקה תסנין ריק 4 צלוחיות DRAM שיכול להכיל לפחות 8 MLS. אותו סוג של הבקבוקון שבו הסטנדרטים היו מוכנים ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל בקבוקונים המכילים את הסטנדרטים ריק רגיל, להוסיף 5mls של סודיום קרבונט. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מוסיפים 1 מ&quot;ל של ריאגנט של Folin מייד לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט להסדיר כל טיפה pH נוצר על ידי תוספת של מגיב של Folin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט על דגימות הבדיקה TESריק לא. פתרונות אלה הופכים מעונן לאחר תוספת של סודיום קרבונט. הוספת ריאגנט של Folin, אשר יגיב בעיקר עם טירוזין חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בקבוקוני ה-DRAM ידי מתערבלים לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li></ol> לאחר דגירה זה, אתה צריך לשים לב שהסטנדרטים יש הדרגתיות של צבע correlating עם כמות של טירוזין הוסיף, הריכוזים הגבוהים ביותר של טירוזין המופיעים האפלים ביותר. ניתן גם לשים לב לשינוי צבע ניכר דגימות הבדיקה שלנו. 2mls של פתרונות אלה מסוננים באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק לתוך cuvettes מסנן מתאים. כעת, assay מתבצע, אתה יכול להמשיך ספקטרופוטומטר כדי להקליט ספיגת הערכים שלנו. </li></ol> מדידת ספיגת ואת חישוב פעילות האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספיגת של דגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר באמצעות אורך גל של 660nm. נתיב האור מוגדר 1cm. הקלט את ספיגת ערכים של תקנים, תקן ריק, דגימות מבחן אחר, מבחן ריק. לאחר שכל הנתונים נאספו, עקומת סטנדרט ניתן ליצור. על מנת ליצור את עקומת, ההבדל בין ספיגת ריק תקן תקן חייב להיות מחושב. זהו ערך ספיגת לייחס סכום של טירוזין של פתרונות סטנדרטיים. לאחר החישוב הפשוט הזה, ליצור את עקומת סטנדרט באמצעות תוכנית גרפים לעלילה שינוי ספיגת הסטנדרטים שלנו על ציר Y, ​​לעומת הסכום micromoles עבור כל הסטנדרטים שלנו 5 על ציר ה-X. <table style="width: 416px; height: 118px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> נפח תקן טירוזין </th><th style="text-align:center"> uMoles טירוזין </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי נקודות הנתונים הוזנו, ליצור קו בכושר הטוב ביותר ואת המשוואה מדרון המקביל. מצא את השינוי ספיגת בדגימות בדיקה על ידי חישוב ההפרש בין ספיגת במבחן מדגם ואת ספיגת ריק הבדיקה. הכנסת ערך ספיגת אחד של דגימות בדיקה למשוואה מדרון ופתרון תגרום micromoles של שחרור טירוזין במהלך התגובה הזאת proteolytic בפרט. כדי לקבל את הפעילות של האנזים יחידות מ&quot;ל /, לבצע את החישוב הבא: (ושווי טירוזין umole שוחרר) x (11) יחידות / מ&quot;ל אנזים = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = סה&quot;כ נפח (ב מיליליטר) של assay 10 = שעה של assay (בדקות) לפי ההגדרה היחידה 1 = נפח האנזים (ב מיליליטר) של האנזים המשמש Volume 2 = (ב מיליליטר) המשמשים קביעת Colorimetric קח את מספר ושווי micromoles טירוזין שוחרר המתקבל המשוואה המדרון הכפל אותו ב מהנפח הכולל של assay ב-MLS, שבמקרה שלנו הוא 11mls. מחלקים ערך זה על ידי שלושה כמויות אחרות: הזמן של assay, אשר רצנו 10 דקות, נפח של אנזים המשמש assay, שהיה מגוונות (בואו להשתמש 1ml), נפח מ&quot;ל המשמש לגילוי colorimetric, אשר עשוי שונים המבוססים על קובט שלך. השתמשנו 2 MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micromoles של טירוזין מחולק זמן מדידת התשואות דקות של פעילות הפרוטאז שנקרא &quot;יחידות&quot;. אנחנו יכולים לבטל את יחידות למדידת נפח במונה וגם במכנה, משאיר מדידה של פעילות האנזים במונחים של יחידות / מ&quot;ל. על מנת לקבוע את הפעילות מדגם פרוטאז מוצק מדולל diluent האנזים, אנו מחלקים את הפעילות שלנו ביחידות / ml ידי ריכוז מוצק המשמש assay זה במקור מ&quot;ג / מ&quot;ל. והותיר אותנו עם פעילות במונחים של יחידות / מ&quot;ג . יחידות / מ&quot;ל אנזים יחידות / מוצק מ&quot;ג = _____________________ מ&quot;ג מוצק / מ&quot;ל אנזים </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

הוכחנו רק אותך איך לנתח פעילות הפרוטאז באמצעות פעילות assay אוניברסלי של סיגמא פרוטאז. בנוסף, assay זו שימושית כדי להבטיח פרוטאזות שלנו קבעו דווקא פעילות לפני שתקבל אותם עבור הניסויים שלך. כפי שראיתם, בעת ביצוע הליך זה, זה בעל חשיבות עליונה לזכור חום הן קזאין ופתרונות טירוזין לאט, לא להרתיח אותם. כמו כן, זה קריטי כדי להכין את החסר שונה עבור שני תקני שלך למדגם כל מבחן שיש לך.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

פרוטאזות לשבור אג&quot;ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות, וזה מה שאנחנו עושים במהלך הליכי בקרת האיכות שלנו. ב assay זו, קזאין משמש מצע. כאשר אנו בודקים פרוטאז מעכל קזאין, טירוזין חומצה אמינית משוחרר יחד עם חומצות אמינו אחרות ושברי פפטיד. מגיב Folin ו Ciocalteus פנול, או של Folin בעיקר מגיב עם טירוזין חינם לייצר chromophore בצבע כחול, אשר לכימות ומדד כערך ספיגת על ספקטרופוטומטר. טירוזין יותר כי הוא שוחרר מבית קזאין, יותר chromophores נוצרים חזקה יותר פעילות של פרוטאז. ספיגת ערכים שנוצר על ידי פעילות של פרוטאז הם לעומת עקומת רגיל, אשר מופק על ידי מגיבים בכמויות ידוע של טירוזין עם מגיב FC לתאם שינויים ספיגת עם כמות של טירוזין ב micromoles. מתוך עקומת סטנדרט הפעילות של דגימות פרוטאז ניתן לקבוע במונחים של יחידות, המהווה את הסכום micromoles ושווי טירוזין שוחרר מבית קזאין לדקה. כדי להציג את המאמר הזה בסינית, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">לחץ כאן</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

פרוטאזות לשבור אג&quot;ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות.

סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

<a class="grey_button" href="/video/910">
ChineseVersion
</a>

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alcohols and Phenols

SCIENTISTS IN ACTION

76.3K Views.  Sigma Aldrich.  ChineseVersion 

Video: Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Biochemistry

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Cancer Research

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Fluorogenic פפטיד Assay המחשוף, למסך לפעילות הפרוטאוליטי: יישומים עבור הקורונה ספייק הפעלת חלבון

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Immunology and Infection

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

זיהוי ישיר של איזולבוגלנדינים ברקמות באמצעות חלבון היתוך D11 scFv-אלקליין פוספטאז ואימונופלואורסנציה

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

Transcript

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST