Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco

Riepilogo

Questo protocollo comporta un non radioattivo In situ procedura che consente l'identificazione simultanea di due specie di trascrizione, ad una risoluzione singola cella, in sezioni sottili del cervello dei vertebrati.

Abstract

Qui si descrive una versione modificata di una fluorescenza doppio

Protocollo

Questo protocollo è stato sviluppato e raffinato basato sullo standard radioattivi e non radioattivi in situ metodi di ibridazione, in precedenza sviluppato da noi e gli altri di individuare uno o due specie di trascrizione nel tessuto cerebrale ^1-7. Il protocollo descritto di seguito ha una lunghezza totale di 2 o 3 giorni, a seconda del numero di interruzioni procedurale scelto dall'utente finale. Tutti i passaggi dettagliati di seguito sono essere condotte a temperatura ambiente, con l'eccezione della fase di ibridazione riboprobe e post-ibridazione lavaggi. Le soluzioni e buffer richiesto per tutti i passi necessari per questo metodo si possono trovare alla fine di questo protocollo.

1. Preparazione dei tessuti e di sezionamento

1. Decapitare ed estrarre il cervello del soggetto rapidamente, e mettetelo in uno stampo di plastica di dimensioni adeguate.
2. Coprire con tessuto cerebrale-Tek mezzo di inclusione e rapidamente posto lo stampo di plastica in un bagno dry-ice/alcohol per il congelamento rapido. Tessuti congelati possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso.
3. Utilizzando un criostato, raccogliere 2 o 3 sezioni di cervello per vetrino sul Superfrost carica Plus. diapositive. Spessore delle sezioni dovrebbe essere 10-12 micron. Le diapositive possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso.

2. Preparazione di Sephadex G50 colonne per purificazione della sonda

"Colonne Sephadex possono essere acquistati da fonti commerciali, però, mettiamo a disposizione di sotto di una alternativa a basso costo per la generazione di colonne, che sarà necessario per la purificazione della sonda.

1. Idrato quantità adeguata di Sephadex G50 polvere con RNase-free, DEPC trattati con acqua (per esempio, 2 g di polvere in 100 ml di DEPC trattati con acqua), soluzione brevemente mescolare e conservare a temperatura ambiente per far precipitare l'eccesso Sephadex G50.
2. Rimuovere il surnatante (strato superiore di acqua) a seguito Sephadex G50 precipitazioni.
3. Ripetere la procedura sopra 3 - 5 volte.
4. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere la soluzione G50 Sephadex in TE buffer (rapporto 1:1), e conservare a 4 ° C fino all'uso.
5. Luogo in autoclave lana di vetro in una sterile siringa da 1 ml e comprimerlo con lo stantuffo di fare uno strato compatto sul fondo, quindi posizionare la siringa in una provetta da 15 ml Falcon.
6. Mescolare bene la soluzione di Sephadex G50 a TE. Riempire la siringa / colonna con questa soluzione.
7. Centrifugare la colonna per 30 sec a 1000 giri.
8. Ripetere questa procedura fino a quando la colonna è quasi completamente riempito di Sephadex G50 perline.
9. Applicare 200 l di tampone colonna di lavaggio alla colonna e centrifugare per 2 min a 1000 rpm. Gettare flow-through.
10. Applicare 200 l di tampone colonna blocco alla colonna e centrifugare per 2 min a 1000 rpm. Ripetere questo passo 4-5 volte per equilibrare colonna. Le colonne possono essere conservati a 4 ° C fino all'utilizzo se sigillati con parafilm.

3. L'etichettatura e la Purificazione di Riboprobes

Di seguito dettaglio la generazione e la purificazione di un singolo riboprobe. Per dFISH, la preparazione di ciascuna sonda coinvolgerà la stessa metodologia, salvo che una delle due sonde sarà marcato con digossigenina (DIG)-tagged UTP, mentre l'altro con biotina-tagged UTP.

1. Preparare un concentrato (> 150 ng / mL) e purificate soluzione linearizzata cDNA di interesse sia per generare senso (controllo) o riboprobes antisenso.
2. In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, aggiungere 0,5-1 mg di cDNA purificato modello, 2 ml di tampone 5X etichettatura sonda, 1 l di DIG 10X (o biotina)-etichettatura mix, 0,5 l di RNasin e 1 microlitri della polimerasi RNA appropriato , e portare il volume finale della soluzione a 10 microlitri con RNasi-free (DEPC-trattati) l'acqua.
3. Incubare la soluzione in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2 ore.
4. Aggiungere 1 ml di tRNA (magazzino; 20 mg / mL), e 39 ml di buffer di colonna di blocco per la soluzione.
5. Preparare il Sephadex G50 colonna per la purificazione della sonda. A tal fine, aggiungere 50 microlitri di buffer di blocco per la colonna e girare per 10 secondi a 1000 giri.
   Ripetere questa operazione 2-3 volte per equilibrare la colonna (cioè, il pieno 50 microlitri applicata alla colonna vengono recuperati dopo il ciclo di centrifugazione).
6. Applicare la soluzione della sonda alla colonna Sephadex G50, la posizione di una provetta per microcentrifuga nuovo sul fondo della colonna, e girare per 3 min a 1000 rpm per ottenere il purificata 50 ml di soluzione riboprobe.
7. Valutare la qualità e la resa di riboprobe etichettati utilizzando uno standard di formaldeide-agarosio RNA gel o uno spettrofotometro.

4. Post-fissazione, acetilazione e ibridazione

1. Rimuovere sezioni dal freezer ° -80 C e permettere una temperatura ambiente per equilibrare. Successivamente, incubare sezioni di un freddo, appena reso soluzione paraformaldeide al 3% per 5 min.
2. Brevemente risciacquare sezioni in phosphate soluzione salina tamponata (PBS) due volte.
3. Disidratare sezioni attraverso una serie standard di alcool (70, 95, e 100%, 2 minuti ciascuna), e lasciarli asciugare all'aria.
4. Incubare le sezioni in una soluzione acetilazione per 10 minuti.
5. Sciacquare le sezioni 3 volte in 2X SSPE.
6. Disidratare sezioni ancora una volta attraverso la serie di alcol standard descritto in precedenza, e permettere loro di asciugare all'aria.
7. Preparare un adeguato volume di soluzione di ibridazione e aggiungere entrambi riboprobes alla soluzione (concentrazione di sonde: 1 ng / mL per ogni sonda). Volume totale della soluzione di ibridazione è determinato in base al numero di sezioni da ibridato (16 ml di soluzione di ibridazione per sezione).
8. Applicare un adeguato volume della soluzione di ibridazione alle diapositive tessuti e coprioggetto assicurando che nessun sovrapposizione bolle d'aria il tessuto.
9. Posizionare i vetrini in un portavetrini metallo. Titolare immergere in un bagno di olio minerale fissata a 65 ° C durante la notte. Assicurarsi che coprioggetto sono rivolto verso l'alto (cioè, l'aspetto laterale del supporto per diapositive devono essere a contatto con il fondo del contenitore olio minerale).

5. Post-ibridazione lava

1. Il giorno seguente, rimuovere con attenzione il supporto diapositive dal bagno d'olio minerale e brevemente sciacquarlo in cloroformio per rimuovere l'olio in eccesso dal diapositive.
2. Posizionare i vetrini in una soluzione di 2X SSPE per 5-10 min. Coprioggetto dovrebbe staccarsi da diapositive, mentre in soluzione.
3. Trasferire i vetrini in una nuova soluzione 2X SSPE, e tenerli per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Trasferire le sezioni in una soluzione contenente 2X SSPE più 50% formammide. La temperatura di questa soluzione dovrebbe corrispondere alla temperatura utilizzata nella procedura di ibridazione durante la notte. Tenere diapositive in questa soluzione per 1,5 ore.
5. Trasferimento sezioni per una soluzione di 0,1 X. SSPE preriscaldata alla stessa temperatura della fase di ibridazione. Incubare sezioni in questa soluzione per 30 min. Ripetere questo passaggio per altri 30 min.

6. Rilevazione e visualizzazione di Riboprobes

1. Trasferimento diapositive a tampone TNT a cui perossido di idrogeno 0,3% è stato aggiunto, per 10 minuti.
2. Lavare le sezioni in TNT tampone, 3 volte (10 min ciascuna).
3. Utilizzando una penna DAKO, disegnare un bene intorno l'area che contiene le sezioni del cervello. Soprattutto, si deve usare cautela per garantire che le sezioni non si asciugano.
4. Applicare 150 ml di tampone TNB di ogni diapositiva, e incubare sezioni in questa soluzione per 30 minuti, in una camera umida.
5. Rimuovere la soluzione in eccesso TNB da diapositive inclinazione.
6. Applicare 150 ml di soluzione contenente TNB perossidasi-coniugato anticorpo anti-DIG, e conservare i vetrini in camera umida per 2 ore. Concentrazione anticorpale deve essere determinata individualmente per ogni trascrizione di interesse prima di effettuare dFISH.
7. Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min.
8. Applicare 150 ml di Alexa 594-coniugato soluzione tyramide lavorando per ogni diapositiva, e memorizzarli in una camera umida per 1 ora. Questa soluzione deve essere preparata secondo le istruzioni del produttore.
9. Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min.
10. Sezioni incubare nel buffer TNT a cui perossido di idrogeno 0,3% è stata aggiunta per 10 - 30 min.
11. Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min.
12. Applicare 150 ml di tampone TNB per vetrino, e tenerli in camera umida per 30 min.
13. Rimuovere la soluzione in eccesso TNB da diapositive inclinazione.
14. Aggiungere 150 ml di soluzione contenente TNB perossidasi-coniugato anticorpi anti-biotina, e conservare i vetrini in camera umida per 2 ore.
15. Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min.
16. Applicare 150 ml di uno Alexa 488-coniugato soluzione tyramide al lavoro per le diapositive e le sezioni incubare per 1 ora. Questa soluzione deve essere preparata secondo le raccomandazioni del produttore.
17. Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, ogni 10 min.
18. Aggiungere 150 ml di soluzione Hoechst (1:1000 in TNT buffer) per le sezioni e tenerli in camera umida per 2 minuti.
19. Lavare le sezioni in TNT buffer; 3 volte, 5 minuti ciascuno.
20. Sezioni coprioggetto con una fluorescenza compatibile mezzo di montaggio (ad esempio, Vectashield o prolungare Antifade).

7. Rappresentante Risultati

Figura 1. Mostriamo qui i risultati ottenuti dFISH rappresentante nel cervello diamante mandarino. Vengono mostrati microfotografie ottenuti dal caudomedial nidopallium (NCM), l'analogo songbird della corteccia uditiva dei mammiferi. Sezioni di cervello sono stati ibridati con un riboprobe biotinilato diretta contro parvalbumina (A), un marker per una sub-popolazione di neuroni inibitori, e una DIG marcato ribosonde dirette contro l'attività del gene-dipendente Zenk (B), un marker affidabile per la canzone-driven neuroni. C) Sovrapposizione di (A) e (B) mostra una popolazione di neuroni inibitori che sono attivati ​​attraverso l'esperienza uditiva. Frecce e frecce indicano le cellule etichettate esclusivamente con ciascuno dei due riboprobes, e asterischi mostrano neuroni rappresentante co-esprimono entrambi trascrizioni di interesse. Barra di scala = 25 micron.

Discussione

Abbiamo usato questo protocollo per studiare come il cervello dei vertebrati è neurochemically e funzionalmente organizzato, e per determinare come comportamentale rilevante per l'impatto sensoriale stimoli il meccanismo genomico dei neuroni nel cervello adulto ^8-10. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo nel tessuto cerebrale di topi, ratti e uccelli canori, ma prevediamo che questo protocollo sarà facilmente adattabile alle sezioni del cervello ottenute da una serie di specie di vertebrati e, f...

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