High-throughput Assay per Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi

Riepilogo

Un test high-throughput per fenotipo Salmonella in vitro o di altra associazione batterica, l'invasione, e la replica in fagociti con capacità high-throughput è stato sviluppato. Il metodo è stato impiegato per valutare Salmonella gene knockout ceppi mutanti per il loro coinvolgimento in interazioni ospite-patogeno.

Abstract

Le specie Salmonella sono agenti patogeni zoonotici e principali cause di malattie di origine alimentare negli esseri umani e bestiame ^1. La comprensione dei meccanismi alla base delle interazioni Salmonella -host sono importanti per chiarire la patogenesi molecolare di infezione da Salmonella. Il dosaggio di protezione gentamicina a fenotipo associazione Salmonella, l'invasione e la replica in fagociti è stato adattato per consentire lo screening high-throughput per definire i ruoli dei mutanti di delezione di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium nelle interazioni host utilizzando RAW 264.7 macrofagi murini. Nell'ambito di questo protocollo, la varianza nelle misurazioni è significativamente ridotto rispetto al protocollo standard, perché wild-type e più ceppi mutanti possono essere testati nello stesso piatto di cultura e, allo stesso tempo. L'uso di pipette multicanale aumenta la produttività e migliora la precisione. Inoltre, le preoccupazioni relative a usare meno host cellule per pozzetto in 96-ben piatto cultura sono stati affrontati. Qui, il protocollo della vitro Salmonella invasione test modificati utilizzando fagociti è stato impiegato con successo per fenotipo 38 singoli mutanti di delezione Salmonella per l'associazione, l'invasione e la replica intracellulare. I fenotipi in vitro sono presentati, alcuni dei quali sono stati successivamente confermato di avere in fenotipi vivo in un modello animale. Pertanto, la modifica, test standardizzato per fenotipo Salmonella associazione, l'invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput potrebbe essere utilizzato più ampiamente per studiare le interazioni batteri-ospite.

Introduzione

Salmonella non tifoidi sono importanti cause di malattie enteriche in tutti i vertebrati. Salmonellosi nell'uomo è tra le prime malattie di origine alimentare batterica ^1. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni di Salmonella con i loro host di origine animale è ottenuta principalmente attraverso lo studio di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (STM) in colture di tessuti e modelli animali di infezione. Guadagnando intuizioni nelle interazioni STM-ospite ci aiuterà a capire come Salmonella sopravvivere e crescere all'interno di cellule ospiti. La prima sfida nello studio di queste interazioni è quello di identificare il maggior numero possibile di fattori che partecipano sia da ospite e patogeno, ma questi sforzi sono in gran parte ostacolato dalle notevoli difficoltà di trattare con due sistemi biologici complessi indipendenti simultaneamente, vale a dire, di accoglienza e di Salmonella, in condizioni fisiologiche. Inoltre, la grande repertoOire di Salmonella e geni ospitanti potenzialmente codificanti fattori coinvolti in interazioni ospite necessitano di high-throughput piattaforma biologico per affrontare questa sfida.

Un modificato, test standardizzato per fenotipo associazione Salmonella, l'invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput è stato sviluppato per esaminare un ampio set di geni probabilmente impegnati in interazioni Salmonella -host. Il saggio di protezione gentamicina è stato sviluppato nel 1973 ^2, ma è stato accuratamente descritto da Elsinghorst nel 1994 ^3,4. Ora è diventato uno strumento standard per lo studio di molti batteri patogeni intracellulari ex vivo, tra cui Salmonella ^5,6. Batteri internalizzati evitare di essere ucciso da alcuni antibiotici, come la gentamicina, che non possono penetrare le cellule eucariotiche ^3. Sfruttando questo fenomeno, il saggio protezione Gentamicina misura la sopravvivenza e la crescita di ba intracellularepatogeni cterial. Tre eventi durante l'infezione, cioè, l'associazione con le cellule eucarioti, l'invasione e la replica, possono essere valutati per batteri patogeni intracellulari in base l'intervallo di tempo tra l'infezione, il trattamento Gentamicina, e in seguito di incubazione (Figura 1). Linee di cellule eucariotiche forniscono un ambiente fisiologico che è meno complessa di modelli animali per studi di interazione ospite-patogeno.

Il test di protezione gentamicina è una piattaforma appropriata per studiare le interazioni STM-ospite, ma il test standard in un piatto di coltura 24 pozzetti num bassa velocità. Analisi computazionale dei set di dati in vivo identificato 149 prodotti genici Salmonella che si prevede di interagire con circa 300 prodotti genici ospite (dati non pubblicati). Il test di protezione gentamicina standard non ha la capacità di fenotipo questo numero di mutanti in modo efficiente.

In Additione, il saggio di protezione Gentamicina può teoricamente rilevare l'invasione di anche un singolo batterio. A causa di questa sensibilità intrinseca, i dati grezzi sono suscettibili di variazioni tecniche quando ripetuto in tempi diversi. I controlli interni e la presentazione dei dati relativi dopo la normalizzazione sono essenziali per l'interpretazione significativa dei risultati. Alla luce di queste considerazioni, una versione modificata, standardizzato test di protezione gentamicina è stato sviluppato per migliorare la capacità di test e aumentare la precisione.

Il protocollo seguito è dettagliata e illustrata per eseguire il test di protezione Gentamicina modificato utilizzando 96 pozzetti piatti della cultura e la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 murino. Rispetto al protocollo standard a 24 pozzetti piastre di coltura, il protocollo modificato presenta i seguenti vantaggi: 1) Uso di 96 pozzetti piatti della cultura permette fino a 10 diversi ceppi mutanti per essere phenotyped compresi i controlli interni positivi e negativi con potenza statistica sufficiente;2) La varianza dei risultati è notevolmente ridotta, in quanto i ceppi mutanti vengono testate nello stesso piatto cultura e allo stesso tempo; 3) L'uso di pipette multicanale aumenta il throughput riducendo la fatica dell'operatore. Infine, il confronto a 24 pozzetti piastre di coltura, le preoccupazioni di meno cellule ospiti per pozzetto a 96-ben piatto cultura sono state affrontate attraverso l'ottimizzazione e la standardizzazione del protocollo.

In sintesi, la modifica, test standardizzato per vitro fenotipo Salmonella o altra associazione batterica, l'invasione e la replica in fagociti aumenta la precisione e raggiunge la capacità high-throughput riducendo la fatica dell'operatore.

Protocollo

1 murino macrofagi RAW264.7 Colture Cellulari

1. Crescere basso numero passaggio macrofagi murini, RAW264.7 (Il numero ATCC ^®, TIB-71) in una coltura cellulare pallone ventilato cap T-75 filtro Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) , 0,5% NaHCO ₃ e 1% 100x non essenziali aminoacidi (NEAA) a 37 ° C, in un incubatore CO ₂ 5%.
2. Una volta che le cellule raggiungono una confluenza del 60-80% nel pallone, utilizzare un raschietto cella per raccogliere le cellule, e contare le cellule in un emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare.
3. Risospendere le cellule e diluire la concentrazione cellulare in 2,5 x 10 ⁵ / ml in mezzo di coltura cellulare fresca DMEM. Utilizzare pipette multicanale al piatto 200 ml di mezzo di coltura cellulare DMEM contenente 5 x 10 ⁴ cellule in ciascun pozzetto di 96 pozzetti piastre di coltura cellulare.
4. Piatto quattro pozzi di ogni ceppo Salmonella. Impostare tre piatti separati per un setdi phagocytic dosaggio cellule invasione, e contrassegnarli con "associazione", "invasione" e "replica", rispettivamente.
5. Posizionare le piastre del 5% di CO ₂ incubatore a 37 ° C ON per consentire alle cellule macrofagi per attaccare al fondo dei pozzetti.

2 Preparazione di Salmonella wild-type e mutanti

1. Lo stesso giorno della preparazione delle cellule macrofagi RAW264.7, raccogliere singole colonie di wild-type (WT) Salmonella enterica sierotipo Typhimurium 14028s, DinvA mutanti, DphoP mutanti, e ceppi mutanti di prova desiderati, e la cultura li in Luria-Bertani ( LB) brodo integrato con antibiotici come appropriato. Usare ogni set dei fagociti saggi cellule invasione di testare fino a 10 ceppi mutanti (DinvA mutante e DphoP mutanti sono difettosi in invasione e replicazione intracellulare, rispettivamente).
2. Crescere i batteri per 14 ore a 37 ° C con sHaking a 220 rpm in 5 ml di brodo LB in vagamente 14 ml con tappo in polipropilene in una provetta a fondo tondo. LB brodo contiene antibiotici appropriati, nel nostro caso, la maggior parte dei ceppi mutanti sono resistenti alla kanamicina, 50 mg / ml
3. Il giorno successivo, Subculture ciascuna delle ON colture di ceppi di Salmonella in pianura 5 ml di brodo LB in un rapporto di 1:50 per un ulteriore 4 ore con agitazione a 220 rpm.
4. Leggi OD ₆₀₀ valori di ogni coltura batterica su uno spettrofotometro, e ogni lettura dovrebbe variare 0,6-1,2 per ottimizzare Salmonella patogenicità isola-1 di tipo III, sistema di secrezione (SPI-1 TTSS) l'espressione del gene per l'invasione.
5. Utilizzare la formula di 1 OD ₆₀₀ = 7,5 x 10 ⁸ UFC / ml di valutare la concentrazione batterica, poi diluire batteri ad una concentrazione di 5 x 10 ⁶ UFC / ml in mezzo di coltura cellulare fresca DMEM.

3 Invasion Assay in 96 pozzetti Cultura Piatto

1. Rimuovere le tre cel 96 pozzettipiastre di l di coltura dalla CO ₂ incubatore e lavare i pozzetti una volta con 200 ml di 1x tampone PBS.
2. Dopo il lavaggio e la rimozione completa di PBS, aggiungere 200 microlitri batteri in terreno DMEM (vedi sopra) in ogni pozzetto. Ciò si traduce in 1 x 10 ⁶ cellule di Salmonella in ciascun molteplicità bene e di infezione (MOI) di 20: 1.
3. Centrifugare le piastre a 1000 xg in un vettore sigillata per 10 minuti, quindi sostituire piastre (tempo zero) a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 30 min. Per ogni ceppo, istituito almeno quattro pozzetti in duplicato.
4. Dopo 30 minuti, togliere le piastre dal termostato e lavare tre volte con 200 ml di PBS 1x per rimuovere i batteri non associati.
5. Dopo il lavaggio, salvare la piastra etichettato con "associazione" per un ulteriore trattamento. Aggiungere 200 ml di terreno DMEM contenente 100 mg / ml di gentamicina in ogni pozzetto delle piastre contrassegnati con "invasione" e "replica" per to uccidere la salmonella extracellulare. Riportare le piastre a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per un ora supplementare.
6. Salvare un bene da ogni ceppo infetto per registrare la conta delle cellule macrofagi, trattare il resto dei pozzi sul piatto "associazione" con 200 ml di 1x PBS contenente 1% Triton X-100 per 10 min. La soluzione Triton lisare cellule macrofagi e rilasciare Salmonella associata.
7. Harvest Salmonella da ogni pozzetto e metterli in 1,5 ml provette Eppendorf. Eseguire tre 10 diluizioni seriali di piegatura con 900μl 1x PBS sui campioni raccolti da ogni pozzetto, vortice viene eseguita tra ogni diluizione.
8. Piatto terza diluizione, 10 ^-3, sia su LB (WT) o LB Kan (mutanti) piatti. Etichettare le piastre con un'adeguata nome Salmonella ceppo, numero di diluizione, il punto ora e la data.
9. Dopo vortex la terza provetta di diluizione, dispensare campione di 10 microlitri sulla superficie del agar e ripetere fnostri tempi per un totale di 5 gocce. Assicurarsi di spazio cinque 10 microlitri scende in modo uniforme sulle piastre di Petri piatto ^7.
10. Dopo le gocce penetrare nel agar, girare i piatti più e incubare una notte a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
11. Trattare pozzi salvati per il conteggio dei macrofagi con 150 1XPBS microlitri contenenti 0,25% tripsina-EDTA per 10 min.
12. Dopo tripsinizzazione, posto macrofagi in 1,5 ml provette Eppendorf e li trattano con 50 ml di FBS per neutralizzare soluzione di tripsina / EDTA, colorano le cellule con 0,4% Trypan blu e punteggio attraverso l'utilizzo emocitometro.
13. Una volta trascorso il incubazione di un hr, rimuovere il "invasione" e piatti "replica" dal CO ₂ incubatore, lavare i pozzetti come "Step 3.4".
14. Salvare la piastra "invasione" per un ulteriore trattamento come "Step 3,6-3,12".
15. Aggiungere 200 ml di terreno DMEM contenente 10 mg / ml di gentamicina perla piastra "replica" per mantenere la clearance della Salmonella extracellulare nel mezzo. Riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per un ulteriore 22,5 ore.
16. Il giorno seguente, rimuovere la piastra "replica" di 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore, lavare i pozzetti come "Step 3.4" e trattarli come "Step 3,6-3,12".
17. Infine, rimuovere le piastre di agar dopo incubazione overnight a 37 ° C incubatore e segnare il numero di colonie batteriche.
18. Una buona distribuzione delle colonie deve essere compresa tra 10 e 100 colonie, ogni punto contiene circa 2 a 20 colonie, sarebbe difficile segnare se ci fossero più di 20 colonie su un punto. Se il conteggio è troppo bassa o troppo alta, replate il campione con 10-diluizioni maggiori o minori a seconda delle necessità.

Analisi 4. Dati

1. Calcolare i (unità di formazione di colonie per ml) CFU di ogni piatto in base alla placcaturavolume e fattore di diluizione.
2. Accertare il numero di Salmonella per macrofagi attraverso la conta delle cellule macrofagi registrato da ogni ceppo.
3. Calcolare le medie geometriche della CFU per macrofagi di almeno tre esperimenti indipendenti per associazione cellulare, invasione o la replica rispettivamente, e normalizzare ulteriormente la WT per il valore relativo.
4. Analizzare i dati per l'associazione, l'invasione, e la replica da parte di Student t-test, rispettivamente, confrontando ogni ceppo di WT, e determinare la significatività statistica del p-value.

Risultati

Vedere i risultati rappresentativi (Figura 2) dopo che i dati sono tracciate in base alla fagocitosi test invasione delle cellule modificate. I dati comprendono cinque diversi ceppi, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A e B. mutante Δ Inva, noto per essere difettoso per l'invasione, e ΔphoP noti per essere difettoso per la replica ^8, sono utilizzati come controlli positivi per valutare la validità sperimentale . Infatti, nel saggio di invasione modificato, un mutant...

Discussione

Il test di protezione gentamicina è ampiamente usato per studiare l'invasione e la replica di batteri patogeni intracellulari all'interno della cellula ospite, ed è soprattutto un importante strumento biologico per lo studio di agenti patogeni, come la Salmonella, la cui invasione è il passo presupposto indispensabile per l'infezione ^1. La protezione dosaggio standard di gentamicina nella comunità di ricerca di Salmonella è implementato in 24-ben piatto cultura ^5....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Fetal bovine serum	HyClone	SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Cell scraper	BD Falcon	353086
96-well Cell culture plate	Corning Incorporated	3595
Luria-Bertani (LB) broth	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube	BD Falcon	352059
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycin solution	Sigma	K0254
Gentamicin solution	Sigma	G1272
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200
Trypan blue	Sigma	T8154