Immunostaining Per visualizzare Murine enterico nervoso Sistemi Di Sviluppo

Riepilogo

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Abstract

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Introduzione

Un funzionamento del sistema nervoso enterico (ENS), che controlla la motilità, l'assorbimento dei nutrienti, e il flusso sanguigno locale, è essenziale per la vita ^1. L'ENS è formata da cellule della cresta neurale (NCC) che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino, dove si differenziano in gangli contenente neuroni e cellule gliali. Malattia di Hirschsprung (HSCR, online eredità mendeliana in Man), una malattia congenita multigeneic con un'incidenza di 1 su 4.000 nati vivi, può essere considerato il prototipo per lo studio della malattia formazione ENS perturbato. In HSCR, NCC non riescono a migrare verso e colonizzare lunghezze variabili del hindgut distale ^2. Inoltre, altro gastrointestinale comune (GI) difetti di sviluppo nella popolazione pediatrica, come le malformazioni anorettali, atresie intestinali e disturbi della motilità sono associati a disturbi nelle funzioni di base ENS, e sono probabilmente associate a sottili, sottovalutati, alterazioni anatomiche e cambiamenti funzionaliENS ^3-6. Pertanto, le tecniche che ci permettono di capire le determinanti dello sviluppo della formazione dell'ENS possano far luce sulla patogenesi e potenziale trattamento dei disturbi del tratto gastrointestinale in età pediatrica.

Dopo la migrazione e la colonizzazione, NCC differenzia in neuroni con marcatori specifici per il loro fenotipo neurotrasmettitore. Neuroni colinergici comprendono circa il 60% dei neuroni enterici ^7, e possono essere rilevate mediante colorazione per la colina acetiltransferasi (ChAT), l'enzima di sintesi per il neurotrasmettitore acetilcolina eccitatorio. Storicamente, i tentativi di visualizzare i neuroni colinergici sono stati confusi da diverse specificità antigenica di anticorpi diretti contro il sistema nervoso centrale (SNC) Discuti contro il sistema nervoso periferico (SNP) ChAT ^8-10. Tuttavia, gli anticorpi diretti contro placentare ChAT riconoscere sia centrale che periferico ChAT ^11-13, e noi abbiamo le tecniche recentemente descritte che permettono di visualizzazione di ENS neuroni colinergici ad alta sensibilità in precedenza in sviluppo che è stato raggiunto con chat line giornalista ^14.

Qui vi presentiamo una tecnica per dissezione, fissaggio e immunostaining del tratto GI murino embrionale visualizzare espressione neurotrasmettitore ENS nei neuroni. Per questi studi, abbiamo utilizzato topi ChAT-Cre accoppiate con R26R: animali tdTomato per produrre chat Cre; R26R:: floxSTOP topi tdTomato (definiti come chat Cre tdTomato tutto il manoscritto): floxSTOP. Questi animali sono stati poi accoppiati con omozigoti topi reporter chat-GFP, per ottenere topi che esprimono entrambi giornalisti fluorescenti che consentono di rilevare l'espressione ChAT ^14. Questi due animali giornalista sono su uno sfondo C57BL / 6J e sono disponibili in commercio (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Protocollo

L'Università del Wisconsin Animal Care and Use Committee ha approvato tutte le procedure.

1. preparazione di soluzioni

1. Utilizzare fosfato 1x salina tamponata (PBS) come tampone di dissezione e la soluzione di risciacquo.
2. Preparare 30% di saccarosio pesando 30 g di saccarosio e posto in una bottiglia. Aggiungere 99 ml di PBS 1x e aggiungere 1 ml di 10% di sodio azide. Mescolare accuratamente fino a quando tutti saccarosio è disciolto. Conservare a 4 ° C fino richiesto.
3. Preparare una soluzione bloccante mescolando 1x PBS, 3% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,1% Triton-X-100. Mescolare bene e conservare in frigorifero fino al momento.
4. Preparare la soluzione 8% paraformaldeide (PFA) in PBS 1x pesando la quantità appropriata di PFA in 1x PBS e incubare a 65 ° C fino a completa dissoluzione. Conservare in aliquote di 25 ml nel -20 ° C freezer fino al momento. Diluire al 4% PFA in 1x PBS, il giorno di utilizzo.

2. Embrione e Gut Dissectione

1. In conformità con Institutional Animal Care and Use Committee protocolli approvati, l'eutanasia a tempo topo incinta e trasferire l'utero in un 60 millimetri piastra di Petri contenente ghiacciata 1x PBS.
2. Al microscopio dissezione con forbici affilate, tagliare la parete uterina aperta per esporre gli embrioni. Rimuovere gli embrioni dall'utero e posto in una 60 millimetri piastra di Petri pulita contenente freddo ghiaccio 1x PBS.
3. Euthanize ogni embrione per decapitazione in 1x PBS ghiacciato. Se si sta utilizzando topi transgenici contenenti proteine ​​fluorescenti, in condizioni di illuminazione a fluorescenza, di identificare gli embrioni transgenici positivi.
4. Sezionare il tratto GI da ogni embrione utilizzando un microscopio dissezione. Utilizzando una pinza sottile, orientare l'embrione tale che il lato sinistro sia rivolto verso l'alto e il lato destro è contro il fondo della scatola di Petri. Rimuovere la parete superiore del corpo dall'embrione per esporre gli organi interni. Inserire pinza sottile tra la parete dorsale del corpo e gli organi interni. CrOss pinza contro l'altro in una azione di taglio a forbice per rimuovere gli organi interni dall'embrione.
5. Ulteriori sub-sezionare il tratto GI lontano dagli organi circostanti e quindi inserire ogni tratto GI in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente ghiacciata 1x PBS.

3. Fissazione di GI Tracts

1. Sciacquare ogni tratto GI 3 volte con 1x PBS freddo e poi sostituirli con 4% PFA. Fissare i tratti GI nei tubi microcentrifuga 1,5 ml su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente per 1,5 ore. Risciacquare tratti gastrointestinali 3 volte per 5 minuti a temperatura ambiente e quindi per 1 ora sull'agitatore oscillante. In questa fase, memorizzare i tratti GI a 4 ° C in 30% di saccarosio in 1x PBS contenente 0,1% di azide di sodio fino a quando necessario.
   NOTA: In alternativa, memorizzare gli embrioni in saccarosio al 30% fino ad un anno senza alcun effetto sulla integrità dei tessuti. Conservazione dei campioni nel 30% di saccarosio consente poi l'elaborazione dei campioni sia per immunocolorazione o in ottobre per crio-sectioning. In alternativa, procedere con il protocollo di immunocolorazione descritto di seguito.

4. Immunostaining Protocol

1. Se i campioni sono stati memorizzati nel 30% di saccarosio, risciacquare 3 volte per 20 minuti in 1x PBS su una piattaforma oscillante.
2. Posizionare i tratti GI in una soluzione bloccante su una piattaforma oscillante per 1h a RT.
3. Rimuovere la soluzione di saturazione e incubare i tratti GI con la quantità appropriata di anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante sia per 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C su una piattaforma oscillante. Utilizzare 1: 1.000 diluizione degli anticorpi umani contro Hu (siero ottenuto da paziente), 1: 1.000 diluizione di anticorpo pollo anti-proteina fluorescente verde (GFP) e diluizione 1: 100 di capra anticorpo anti-Chat.
   NOTA: Utilizziamo un anticorpo anti-Hu umano che è stato ottenuto localmente da un paziente, tuttavia, gli anticorpi anti-Hu sono disponibili in commercio, per esempio, anti-Hu mouse (uso in diluizione 1: 500).
4. Sciacquare i tratti GI in 1x PBS3 volte per 5 minuti e poi per 1 ora a RT su una piattaforma oscillante.
5. Sostituire la 1x PBS con anticorpi secondari diluiti 1: 500 in soluzione bloccante su una piattaforma oscillante sia per 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Utilizzare asino tintura ammina reattiva anti-umano come DyLight, asino Cy2 anti-pollo e asino anti-capra Cy5. Se si utilizza il mouse anti-Hu anticorpi quindi utilizzare una diluizione 1: 500 di asino anti-topo ammina reattiva tintura 405.
   NOTA: L'intensità della GFP endogena ed espressione tdTomato e la chiarezza di immunostaining aumentano con l'età evolutiva. Tipicamente immunostain viscere embrionali singolarmente in provette da 0,2 ml con 150 ml di soluzione di colorazione al fine di ridurre il volume di anticorpo utilizzato e anche per garantire la colorazione efficiente del tessuto.
6. Risciacquare tratti GI in 1x PBS 3 volte per 5 minuti e poi per 1 ora a RT su una piattaforma oscillante.
7. Mettere qualche goccia di soluzione di montaggio a fluorescenza con DAPI su un vetrino. Immergere TRA GIct nel mezzo di montaggio fluorescenza e aggiungere un vetro di copertura direttamente sulla parte superiore del tessuto. Il mezzo di montaggio -G fluorescenza è un composto solubile in acqua che fornisce una tenuta semi-permanente.
   NOTA: mezzo di montaggio Usa fluorescenza come Vectashield che è un glicerolo basato mezzo che impedisce allo sbiadimento e photobleaching di anticorpi montaggio. Entrambi i prodotti consentono tessuti per essere conservati per lunghi periodi di tempo a 4 ° C.
8. Catturare immagini di ciascuna di fluoroforo usando un microscopio confocale. Utilizzare le lunghezze d'onda di eccitazione per fluorofori e filtri impiegati presentati nella tabella 3.
9. Eseguire l'analisi dell'immagine computerizzata con software adeguati a seconda del tipo di confocale utilizzato per catturare le immagini.

Risultati

Abbiamo già descritto la generazione di topi che esprimono entrambi giornalisti fluorescenti GFP e tdTomato che rilevano espressione ChAT ^14. In breve, i topi Chat-Cre sono stati accoppiati con R26R: floxSTOP: tdTomato animali per produrre chat Cre; R26R: topi tdTomato (chiamati ChAT-Cre tdTomato): floxSTOP. Questi animali sono stati poi accoppiati con omozigoti topi reporter Chat-GFP. Gli embrioni sono stati isolati e tessuti sono stati sezionati prima d...

Discussione

Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che i difetti intestinali in HSCR non sono limitati al colon agangliare ma esteso prossimalmente, anche nel piccolo intestino ganglionated ^5,15,16. Queste alterazioni sono cambiamenti nella ENS neuronale densità e neurotrasmettitore fenotipo e possono rappresentare dismotilità che è stata osservata nei pazienti con HSCR. Abbiamo utilizzato le tecniche di cui sopra nei nostri sforzi per comprendere le determinanti della formazione ENS. In particolare, queste te...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Oxoid	BR0014G
Sucrose	Fisher	S2
Sodium azide	Fisher	BP9221
Bovine serum albumin	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Paraformaldehyde	Sigma	158127
60 mm Petri dishes	Fisher	FB0875713A
Fluorescence microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Fine forceps	Fine science tools	11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Glass slides	Fisher	12-550-15
Cover glass	VWR	16004-330
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon