Sviluppo di un Rat modello Alfa-sinucleina per la malattia di Parkinson mediante iniezione stereotassica di un ricombinante vettore virale adeno-associato

Riepilogo

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Abstract

Al fine di studiare i meccanismi molecolari della malattia di Parkinson (PD) e di sviluppare nuove strategie terapeutiche, ricercatori scientifici si basano su modelli animali. L'identificazione di geni PD-associata ha portato allo sviluppo di modelli di PD genetiche. modelli murini α-SYN più transgenici sviluppano progressiva patologia α-SYN, ma non riescono a visualizzare perdita di cellule dopaminergiche chiaro e deficit comportamentali dopamina-dipendente. Questo ostacolo è stato superato con il targeting diretto della substantia nigra con vettori virali sovraesprimono geni PD-associata. Locale consegna del gene utilizzando vettori virali fornisce un modo interessante per esprimere transgeni nel sistema nervoso centrale. Regioni specifiche del cervello possono essere mirati (ad esempio, la substantia nigra), espressione può essere indotta nella cornice adulti e alti livelli di espressione può essere raggiunto. Inoltre, possono essere utilizzati diversi sistemi di vettori basati su vari virus. Il protocollo descrive tutti i passi fondamentali per eseguire un vettore viraleiniezione nella substantia nigra del ratto di sviluppare un modello animale virale basato su vettori alfa-sinucleina per il morbo di Parkinson.

Introduzione

Per studiare la fisiopatologia del PD e di sviluppare nuove strategie terapeutiche, vi è un urgente bisogno di modelli animali che assomigliano da vicino le neuropatologia, fisiologia e motorie sintomi di PD umana. Più alto è il valore predittivo, il meglio che possiamo tradurre le nuove terapie da modelli animali per i pazienti.

La scoperta di alfa-sinucleina (α-SYN) come primo gene PARCO nel 1997 ha portato allo sviluppo dei primi modelli di PD genetiche. Molti topi transgenici che sovraesprimono wild-type umana (WT) o mutante (A30P, A53T) α-SYN sono stati generati negli ultimi dieci anni. I livelli di α-SYN sovraespressione hanno dimostrato di essere cruciale nello sviluppo della patologia. Anche il ceppo di topi, la presenza o l'assenza di endogena α-SYN e se la lunghezza o una forma troncata si esprime, gioca un ruolo (APPROFONDIMENTI DI Magen e Chesselet ^1). Sovraespressione di entrambi WT e diversi mutanti clinici di umana &# 945; -SYN in topi transgenici induce accumulo patologico di α-SYN e disfunzione neuronale ^2-6. Tuttavia, fino a modelli murini α-SYN ora la maggior parte transgenici non sono riusciti a visualizzare perdita di cellule dopaminergiche chiaro e deficit comportamentali dopamina-dipendente.

Questo ostacolo è stato superato con il targeting diretto della substantia nigra (SN) con vettori virali sovraesprimono α-SYN. vettori virali sono derivati ​​da virus che possono facilmente infettare cellule, introdurre materiale genetico nel loro genoma dell'ospite e forzare la cellula ospite per replicare il genoma virale per produrre nuove particelle virali. I virus possono essere progettati per i vettori non virali-replicanti che mantengono la loro capacità di entrare nelle cellule e di introdurre geni. Eliminando parti del genoma virale e sostituirli con i geni di interesse, applicazione del vettore si tradurrà in una singola infezione rotonda senza replica nella cellula ospite, generalmente designato come 'trasduzione'. vettori virali cun essere utilizzati sia per la sovraespressione e il silenziamento genico. Il transgene espresso può essere una proteina reporter (ad esempio, la proteina fluorescente verde o lucciola luciferasi) ^7, una proteina terapeutica per applicazioni di terapia genica ^8-10 o, come ci concentreremo su in questo articolo, una proteina correlata alla malattia usato per la malattia di modellazione ^{11 -14.}

Vettore virale mediata consegna del gene fornisce un modo alternativo per esprimere transgeni nel SNC con diversi vantaggi. Utilizzando la consegna transgene locali, le regioni specifiche del cervello possono essere mirati. Inoltre, l'espressione del transgene può essere indotta durante l'età adulta diminuire il rischio di meccanismi di compensazione durante lo sviluppo. Inoltre, i modelli possono essere creati in diverse specie e ceppi. Infine, diversi transgeni possono facilmente essere combinati. Utilizzando vettori virali, i livelli di espressione del transgene alta possono essere raggiunti, che potrebbe essere fondamentale poiché l'insorgenza della malattia e la gravità di frequente dipendono dal livello di Sovraespression.

Sono stati sviluppati vari sistemi di vettori basati sul virus diversi. La scelta del sistema vettore dipende dalle dimensioni del gene di interesse, la durata desiderata di espressione genica, la cellula bersaglio e biosicurezza. Per il trasferimento di geni stabile nel cervello, lentivirale (LV) e ricombinante virale adeno-associato (rAAV) vettori sono ormai considerati i sistemi vettoriali di scelta dato che portano ad espressione genica efficace e di lungo termine nel cervello dei roditori. Per specifico orientamento dei neuroni dopaminergici (DN) della SN, vettori rAAV sono gradualmente outcompeted vettori LV causa dei loro titoli più alti e l'efficienza di trasduzione del DN.

I migliori modelli di roditori basato α-SYN attualmente disponibili sono stati sviluppati da un approccio combinato utilizzando più recenti sierotipi di AAV (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) e ottimizzato costrutti vettoriali, titoli, e la purezza ^15,16. Il vettore titolo nonché il vettore purezza influenza direttamenteil risultato fenotipica del modello. Eccessive titoli vettoriali o lotti vettore non sufficientemente purificate possono causare tossicità non-specifica. Pertanto, opportuni vettori di controllo sono indispensabili. investimento di tempo considerevole nel vettore di produzione, upscaling, e le procedure di purificazione virali hanno anche dimostrato essenziale per ottenere lotti riproducibili e di alta qualità di vettore.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono svolte in conformità con la Direttiva del Consiglio Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) e approvati dal Comitato di Bioetica dell'Università di Lovanio (Belgio).

1. ricombinante AAV produzione e purificazione

Nota: la produzione di vettore rAAV e purificazione è stata eseguita dal Leuven Viral Vector core (LVVC) come descritto in precedenza ^17.

1. Brevemente, transfect subconfluenti bassa (<50) passaggio cellule HEK 293T aderenti utilizzando lineare polietilenimmina 25kD 150 soluzione trasfezione nM NaCl e tre differenti plasmidi in un rapporto di 1: 1: 1 in terreno DMEM 2% di siero fetale bovino. Dopo 24 h di incubazione a 37 ° C in 5% CO _2, sostituire il mezzo con mezzo DMEM 2% di siero fetale bovino fresco.
   Nota: I plasmidi sono i costrutti per sierotipo AAV7, il plasmide transfer AAV che codifica il mutante A53T umano α-SYN sotto il controllo del CMVie migliorata synapspromotore in1 e il pAdvDeltaF6 adenovirale aiutante plasmide ^17.
2. Raccogliere le medie 5 giorni dopo la trasfezione transiente e concentrarsi con filtrazione a flusso tangenziale ^17.
3. Purificare le particelle di vettore rAAV dal mezzo di concentrato utilizzando un passo iodixanolo gradiente ^17.
4. Utilizzare le tecniche standard di real-time PCR per genomica copia (GC) determinazione. In questo protocollo, un titolo vettore di 3.0 E11 GC / ml è stato utilizzato per sviluppare un modello di ratto basato α-SYN per PD ^17.

2. iniezione stereotassica di α-SYN rAAV vettore nel SN del Topo (Figura 2)

1. Casa otto settimane ratti Wistar femmine del peso di circa 200-250 g sotto un normale / ciclo buio 12 ore di luce con libero accesso a cibo pellet e l'acqua del rubinetto.
2. Sottoporre il topo per via intraperitoneale (ip) anestesia contenente una miscela di ketamina (60 mg / kg) e medetomidina (0,4 mg / kg). Una volta che il ratto è anestetizzato e non reagiscequando comprimendo i diversi zampe, somministrare una via sottocutanea micro-transponder sul retro del ratto per un riconoscimento ulteriore utilizzando un implanter micro-transponder. Controllare se il micro-transponder è posizionata correttamente e può essere letto dal dispositivo di lettura.
3. Tagliare i capelli sulla sommità del cuoio capelluto. Applicare un anestetico locale sia sul cuoio capelluto e le orecchie. Eseguire il resto della procedura chirurgica sotto flusso laminare utilizzando tecniche asettiche.
4. Mettere i topi in una cornice testa stereotassica utilizzando due barre orecchio, una bocca e un bar naso. Coprire il corpo del ratto con una coperta di carta per evitare un calo della temperatura corporea. Applicare un lubrificante oculare per evitare gli occhi secchi.
5. Disinfettare il cuoio capelluto con jodium 1% in isopropanolo 70% e fare una piccola incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto. Delicatamente raschiare via le membrane sul cranio e risciacquare con soluzione salina. Lasciare il cranio asciugare per alcuni minuti. Osservare le suture craniche ed i due punti di riferimento: Bregma e Lambda.
6. Per iniettare il vettore rAAV nella SN, definire le coordinate verso Bregma (antero-posteriore 5,3 mm; mediolaterale 2,0 mm e dorsoventrale: 7,2 mm calcolati dalla dura).
   Nota: Le tre coordinate tridimensionali per ciascuna regione di interesse può essere calcolato utilizzando un stereotassiche atlante del cervello di ratto, applicando Bregma come punto di riferimento anatomici.
7. Riempire una siringa da 10 ml microiniezione (30 gauge 20 mm) con rAAV vettoriale e posizionarlo nello strumento stereotassico collegata ad una pompa microiniezione motorizzato. Controllare il volume rilasciando una goccia di vettore ed eliminare in polivalente pulizia detergente a pH 9 (es RBS).
8. Controllare visivamente se la testa è fissata direttamente al telaio di testa e valutare l'asse sinistra-destra. Cura di definire visivamente le antero-posteriore e medio-laterale coordinate per Bregma e Lambda e misurare la loro altezza usando un ago da 30 mm calibro 20 nel braccio dorsoventrale del telaio stereotassico.
   1. consentire amassimo di differenza 0,3 millimetri in altezza tra bregma e lambda. Posizionare l'ago sulla Bregma e applicare il antero-posteriore e le coordinate mediolaterale spostando il antero-posteriore e il braccio medio-laterale del telaio stereotassico.
9. Nel luogo di iniezione, misurare l'altezza del cranio e assicurarsi che non si discosta di più di 0,3 mm dalla altezza del bregma. Praticare un foro nel cranio con un diametro di circa 2 mm. Misurare l'altezza della dura, questo servirà come punto di riferimento per applicare la coordinata dorsoventrale. Alternativamente sottrarre uno spessore fisso per il cranio (0,9 mm).
10. Penetrare la dura madre utilizzando un ago calibro 26 e assorbire il sangue con un fazzoletto di carta sterile. Attendere fino a quando tutto il sanguinamento si è fermato prima di procedere.
11. Lentamente inserire la microiniezione siringa da 10 ml pre-caricato con soluzione di vettore nel cervello alla profondità predeterminata (dorsoventrale coordinate). Attendere 1 min con l'ago in posizione. Iniettare 3 mldi soluzione di vettore (3,0 E11 genoma copie / ml (dose vettore media) o 1.0 E12 GC / ml (dose alta vettore) di rAAV2 / 7 α-SYN o eGFP controllo vettoriale) utilizzando la pompa microiniezione motorizzata con un rendimento di 0,25 ml / min.
12. Dopo l'iniezione, tenere l'ago in posizione per altri 5 minuti prima di rimuoverlo lentamente. Stitch il cuoio capelluto con poliestere intrecciato rivestito 3.0, disinfettare con 1% jodium nel 70% isopropanolo e rimuovere delicatamente l'animale dallo strumento stereotassico. In primo luogo allentare la barra di naso e la bocca, poi le due barre per le orecchie.
13. Per invertire l'anestesia, iniettare il ratto per via intraperitoneale con 0,5 mg / kg atipamezolo e posizionare il ratto in una gabbia pulita su una piastra riscaldante a 38 ° C finché non si sveglia. Coprire il ratto con una coperta carta per evitare un calo della temperatura corporea.
14. Fornire un facile accesso a cibo e acqua per le prime ore. Monitorare il ratto per i primi giorni. Se necessario applicare l'analgesia.
    Nota: Non vi è alcuna necessità di rimuovere i punti di sutura da tha il cranio. Dopo 1-2 settimane il cranio è completamente riparato e le cuciture si allenti.

3. Valutazione della rAAV2 / 7 α-SYN ratti iniettati Utilizzo non invasiva PET Imaging, test comportamentali e analisi immunoistochimica

1. Per seguire la cinetica di nigrostriatale dopaminergica neurodegenerazione in modo non invasivo nel corso del tempo nei singoli animali, quantificare trasportatore della dopamina (DAT) rilegatura utilizzando piccoli animali tomografia ad emissione di positroni (PET) e un tracciante del DA Transporter ad esempio ^[18 F] -FECT ¹⁶ .
2. Per verificare se il livello di dopaminergico neurodegenerazione è sufficiente per indurre difficoltà motorie nei ratti, sottoporre i ratti al test del cilindro per valutare l'uso degli arti anteriori spontanea.
   1. Posizionare il topo in un 20 cm di larghezza chiaro cilindro di vetro e videotape il comportamento durante i movimenti verticali lungo il muro e l'atterraggio dopo un posteriore. Nota il numero di contatti effettuati da ciascuna zampa per un totale di 20contatti. Per una descrizione dettagliata dei criteri di punteggio vedere Schallert et al. ¹⁸ esprimere il numero di contatti arti anteriori deteriorati (ad esempio, delle zampe anteriori di sinistra) in percentuale del totale dei contatti arti anteriori (sinistra più zampa anteriore destra).
      Nota: ratti di controllo non lesionati con entrambe le zampe altrettanto dovrebbe segnare circa il 50% in questo test.
3. Eseguire immunoistochimica (IHC) analisi per valutare il livello di espressione del transgene e perdita di cellule dopaminergiche.
   1. Nelle diverse fasi finali, sacrificare i ratti con una overdose di pentobarbital sodico (60 mg / kg, ip) ed eseguire una perfusione intracardial con soluzione salina fredda seguita da 4% paraformaldeide in PBS ^19. Fissare i cervelli notte a 4 ° C e tagliare 50 micron di spessore sezioni di cervello coronali utilizzando un microtomo vibrante.
   2. Eseguire IHC colorazione su sezioni free-floating utilizzando anticorpi contro α-SYN e tirosina idrossilasi per analizzare i livelli di espressione di α-SYN e il LEvel di neurodegenerazione ^16.

Risultati

Lo schema generale di questo esperimento è raffigurato in figura 1

sovraespressione rAAV 2/7 mediata di A53T α-SYN induce deficit motori dopamina-dipendente.
Per verificare se il livello di α-SYN sovraespressione è sufficiente per indurre difficoltà motorie nei ratti, abbiamo sottoposto i topi al test del cilindro per valutare l'uso degli arti anteriori spontanea (Figur...

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo. Il titolo di vettore e la purezza vettoriale influenza direttamente l'esito fenotipica del modello. Eccessive titoli vettoriali o lotti vettore non sufficientemente purificate possono causare tossicità non-specifica. Pertanto, l'uso di lotti vettoriali di alta qualità e appropriati vettori di controllo è indispensabile. Inoltre, l'esatto posizionamento della testa del ratto nel telaio stereotassico e la determinazione accurata delle coordina...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female 8 weeks old Wistar rats	Janvier	/	200-250 g
Ketamine (Nimatek)	Eurovet animal health	804132
Medetomidine (Dormitor)	Orion-Pharma/ Janssen Animal Health	1070-499
Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel	Astrazeneca	0137-547
Terramycine	Pfizer	0132-472
Buprénorphine (Vetergesic)	Ecuphar	2623-627
Jodium 1% isopropanol	VWR	0484-0100
stereotactic head frame	Stoeling	/
Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2)	Hamilton/ Filter Service	7803-07
atipamezole (Antisedan)	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T α-SYN vector	LVVC, KU Leuven	/	https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
sodium pentobarbital (Nembutal)	Ceva Santé	0059-444
microtome	Microm	HM650
rabbit polyclonal synuclein Ab	Chemicon	5038	1:5,000
rabbit polyclonal TH Ab	Chemicon	152	1:1,000
Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph	Siemens/ Concorde Microsystems	/
radioligand: 18F-FECT	In house	/
L-dopa: Prolopa 125	Roche		6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
Foetal bovine serum	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD linear polyethylenimine (PEI)	Polysciences	/
OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition	Elsevier	/