L'analisi di espressione genica tramite rilevazione di attività di β-galattosidasi in embrioni di topo intero

Riepilogo

Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Si tratta di una procedura facile e veloce per monitorare l'espressione genica durante lo sviluppo che può essere applicato anche a sezioni di tessuto, organi o cellule coltivate.

Abstract

L'Escherichia coli LacZ gene che codifica per β-galattosidasi, è in gran parte utilizzato come reporter per l'espressione genica e come tracciante negli studi di lignaggio cellulare. La classica reazione istochimica si basa sull'idrolisi del substrato X-gal in combinazione con gli ioni ferrici e ferrosi, che produce un precipitato insolubile blu che è facile da visualizzare. Di conseguenza, attività della β-galattosidasi serve come indicatore per il modello di espressione del gene di interesse lo sviluppo procede. Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il conseguente metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Inoltre, è disponibile una procedura per chiarire interi embrioni per visualizzare meglio il X-gal macchiatura in regioni più profonde dell'embrione. Risultati costanti ottenuti eseguendo questa procedura, anche se l'ottimizzazione delle condizioni di reazione è necessaria per ridurre l'attività di sfondo. Limitazioni nel dosaggio dovrebbero essere considerati anche, specialmente per quanto riguarda le dimensioni dell'embrione intero supporto della colorazione. Il nostro protocollo prevede un sensibile e un metodo affidabile per la rilevazione di β-galattosidasi durante lo sviluppo del mouse che possa essere applicato alle sezioni al criostato, nonché di organi interi. Così, la dinamica espressione genica durante lo sviluppo possa essere facilmente analizzati utilizzando questo protocollo in interi embrioni, ma anche espressione dettagliata a livello cellulare può essere valutato dopo il sezionamento della paraffina.

Introduzione

Al fine di descrivere il pattern di espressione genica specifici, l'uso di geni reporter come marcatori è stato fondamentale dalla drosofila ai mammiferi. Negli esperimenti che coinvolgono gli animali transgenici e knockoui, il gene batterico β-galattosidasi (LacZ) di Escherichia coli (Escherichia coli) è uno dei più ampiamente usato^{1,2,3, 4}. β-galattosidasi (β-gallone) catalizza l'idrolisi di β-galactosides (come il lattosio) in monosaccaridi (glucosio e galattosio)⁵. Il substrato più comunemente usato è il X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glicoside che viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, generando 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galattosio. Il primo è ossidato in un dimero che, quando utilizzato combinato con potassio ferri- e ferro-cianuro, produce un caratteristico insolubile, colore blu precipitare (Figura 1)⁶.

Il gene LacZ iniziò ad essere usato come un gene reporter più di trenta anni fa^7,8. Solitamente, LacZ viene inserito a valle di un promotore endogeno nel luogo l'open reading frame, quindi può essere utilizzato nella cultura batterica e cella per visualizzare le celle che contengono un inserto particolare, così come negli animali transgenici come tracciante di endogeno pattern di espressione genica durante lo sviluppo⁹. A questo proposito, la visualizzazione dell'attività della β-galattosidasi è stato ampiamente utilizzata in drosofila per comprendere i processi cellulari e dello sviluppo da singole cellule ai tessuti tutta. Genetica della drosofila favorisce la generazione di linee stabili in cui un costrutto di P-elemento modificato contenente il gene reporter che lacZ è inserito in modo casuale posizioni nel genoma. Così, quando posto sotto l'influenza degli elementi enhancer può guidare l'espressione in modo specifico del tessuto, che ha permesso l'analisi sistematica dei modelli di espressione di molti geni negli ultimi due decenni¹⁰. Inoltre, l'uso di topi transgenici per monitorare l'espressione del gene LacZ consente inoltre di rilevazione degli eventi di ricombinazione genica di Cre-loxP mediata ricombinazione e la localizzazione dei derivati mutante cellule embrionali staminali in analisi chimerici ¹¹, che facilita il controllo di LacZ espressione in tessuti specifici come pure temporaneamente. Inoltre, in interi embrioni, rilevamento dell'attività β-galattosidasi può produrre pattern di colorazione differenziale alle diverse intensità che si possono comodamente osservare attraverso diversi stadi di sviluppo per analizzare i cambiamenti temporali nell'espressione del gene ^8,12.

In questo articolo, presentiamo un protocollo per visualizzare l'espressione genica attraverso il X-gal macchiatura nel tessuto intero supporto nelle fasi iniziali dello sviluppo degli embrioni del mouse. Vi presentiamo questo metodo istochimico come una tecnica altamente sensibile e poco costoso che favorisce un rilevamento accurato delle cellule con etichettate intero supporto esemplari o al livello cellulare dopo paraffina embedded tessuti o embrioni. Il metodo consente la visualizzazione diretta di macchiatura nel tessuto del mouse con lo sfondo minimo se confrontato con altri metodi¹³.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per l'etica di animale esperimenti di CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) e la Comunidad Autónoma de Madrid per garantire la minimo sofferenza degli animali.

1. raccolta di embrioni da topi incinto (da E8.5 a 12.5)

1. Sacrificare incinto topi da dislocazione cervicale o inalazione di CO₂ . Il giorno del primo osservato plug vaginale è stato considerato embrionali giorno 0.5 (0.5).
2. Posare l'animale in posizione supina il tampone assorbente e pulire la pelle dell'addome del mouse con etanolo al 70%.
   Nota: La sterilità non è necessaria nei passaggi seguenti.
3. Stringere e sollevare la pelle addominale usando il forcipe del mouse-dente.
4. Fare un'incisione attraverso la pelle e la parete addominale, 2-4 cm in verticale attraverso la linea mediana dell'addome utilizzando forbici chirurgiche.
5. Esporre l'addome e rimuovere i corni uterini dalla madre con forcipe taglio vasi sanguigni lungo la curvatura interna dell'utero con forbici chirurgiche.
6. Rimuovere la stringa di embrioni e trasferirlo in una capsula Petri su ghiaccio contenente 10 mL ghiacciata 0,01 M tampone fosfato salino pH 7,4 (PBS).
7. Accuratamente sezionare gli embrioni fuori dall'utero sotto un microscopio stereoscopico in una capsula di Petri con 10 mL di PBS freddo fresco. Afferrare la parete muscolare con la pinzetta orologiai per esporre il sacco amniotico e poi strappare la membrana amniotic per rimuovere l'embrione recintato e il sacco vitellino con le punte della pinza.
8. Raccogliere gli embrioni littermate dai topi incinto nelle fasi iniziali (da E8.5 a 12.5) (Figura 2).
9. Trasferire gli embrioni per un piatto fresco con 10 mL di PBS 1X freddo usando il forcipe curvo o, per molto piccoli embrioni (E8.5-E9.5), utilizzare pipette di plastica per raccogliere i campioni senza danni di embrione.
10. Prima di iniziare la fissazione, prelevare un campione embrionale in una microcentrifuga per la genotipizzazione di tagliare un piccolo pezzo dell'embrione o prendendo la membrana amniotic negli embrioni più piccoli (da E8.5 a E9.5) con il forcipe di orologiai.
    Nota: LacZ genotipizzazione è determinata da iniettori di reazione a catena (PCR) della polimerasi: in avanti, a 5 minuti-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3 ´; invertire, a 5 minuti-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3 ´.

2. fissazione degli embrioni del Mouse

1. Trasferire ogni embrione in un tubo del microcentrifuge da 2 mL con una base arrotondata, contenente 1 mL di PBS 1X.
   Nota: Eseguire tutti i passaggi nel protocollo in questi tubi con agitazione utilizzando un agitatore per rotolamento.
2. Lavare gli embrioni in PBS 1X per 1 min a temperatura ambiente per eliminare il sangue rimanente. Pipette di trasferimento in plastica di uso per cambiare liquidi nei tubi.
3. Difficoltà l'embrione in 1 mL di 0,125% glutaraldeide sul ghiaccio.
   Nota: Al momento della fissazione dipende dalla dimensione dell'embrione: 20 min per embrioni E8.5-E9.5, 30 min per gli embrioni e 10.5 e 1h per gli embrioni 12.5.
4. Rimuovere il fissativo e lavare gli embrioni in PBS 1X due volte per 10 min a temperatura ambiente prima di elaborare il campione per il X-gal macchiatura.

3. l'intero Monte β-galattosidasi istochimica degli embrioni del Mouse

1. Preparare il X-Gal risciacquo buffer e il X-Gal macchiatura soluzione prima di iniziare la procedura (Vedi tabella 1 e Tabella materiali). Utilizzare un embrioni di littermate wild type (WT) come controllo negativo per la reazione enzimatica.
2. Incubare gli embrioni nel buffer di X-Gal risciacquo per 10 min a temperatura ambiente (Figura 2).
3. Incubare gli embrioni in soluzione di macchiatura di X-Gal da 2 h a tutta la notte a 37 ° C al riparo dalla luce. Monitorare la reazione al colore periodicamente tramite un microscopio per dissezione fino a sufficiente intensità di colorazione blu è osservata senza lo sfondo nell'embrione. Mantenere il pH della soluzione tra 8 e 9 per ridurre di fondo durante l'intera colorazione. Se la soluzione colorante comincia a girare a luce, è possibile sostituirlo con soluzione di substrato fresco per estendere la reazione enzimatica.
4. Fermare la reazione quando il segnale desiderato è ottenuto lavando gli embrioni in un tubo del microcentrifuge con 1 mL di PBS 1X due volte per 10 minuti ciascuno, a temperatura ambiente.
5. Trasferire gli embrioni macchiati in paraformaldeide al 4% a 1 mL (PFA) ri-risolverli, per 1 h a tutta la notte a 4 ° C.
   Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati nel 4% PFA/PBS per tempi più lunghi a 4 ° C o possono essere trattati immediatamente per il sezionamento. Questa fase di fissazione finale è fondamentale per la conservazione a lungo termine di pattern di colorazione.
6. Lavare gli embrioni in 1 mL di PBS 1X due volte per 10 min a temperatura ambiente.
7. Opzione 1: Cancellare gli embrioni mediante immersione in una serie di soluzioni con aumento delle concentrazioni di glicerolo (glicerolo 20%, 40%, 60% e 80% in PBS 1X) per 1 h a temperatura ambiente in ogni soluzione.
   Nota: Lavare gli embrioni in 80% glicerolo per tempi più lunghi, anche giorni, finché vengono cancellati e poi salvarli in 80% glicerolo a 4 ° C in questa fase (Figura 2). Aggiungendo una piccola quantità di cristallo ora azoturo di sodio del timolo agli embrioni conservati a 4 ° C in glicerolo o 1X PBS è raccomandato per prevenire la crescita di muffe. Dopo schiarimento, interi embrioni del supporto possono essere utilizzati per fotografare (passaggio 4).
8. Opzione 2: Processo di embrioni per paraffina incorporamento e sezionamento mediante un microtomo (Figura 2). Documentare il modello di espressione in tutto macchiati embrioni prima di sezionamento (passaggi 4 e 5).

4. fotografia di intero Monte embrioni

1. A fotografare l'intero supporto macchiato gli embrioni prima del sezionamento, trasferiscili su una piastra Petri preparate con una base di solidificato dell'agarosi di 1-2% in PBS 1X.
2. Coprire l'embrione completamente con 10 mL di PBS 1X nei piatti dell'agarosi-rivestito per prevenire la disidratazione e riflessione mentre fotografare attraverso il liquido.
3. Orientare l'embrione immerso in 1X PBS usando il forcipe. Per vecchi embrioni (e 10.5-12.5), fare un piccolo buco in agarosio con il forcipe per inserire e posizionare il preparato all'interno di esso le inclinazioni e per evitare il libero di fluttuare durante la fotografia.
4. Mettere la teglia sul palco stereomicroscopio, utilizzando la luce trasmessa (sotto-fase). Cambiare tra le regolazioni di 'luminoso-campo' per impostare l'illuminazione desiderata durante la fotografia e per ottimizzare la traslucenza del campione e 'scuro-campo'.
   Nota: Utilizzare illuminazione a fibra ottica per la fase successiva embrioni per evitare la riflessione sulla superficie dell'embrione. Quando si fotografa gli embrioni deselezionati, seguire la stessa procedura ma trasferirli in una piastra Petri contenente glicerolo al 100% e completamente immergerli.

5. paraffina incorporamento e sezionamento del X-gal macchiato embrioni

1. Incorporamento di cera di paraffina
   1. Rimuovere il X-gal macchiato embrioni da 4 ° C (punto 3.5) e lavarli con 1 mL di PBS 1X tre volte per eliminare l'eccesso di fissativo.
   2. Trasferire ogni embrione su una videocassetta di istologia usando il forcipe.
   3. Posizionare le cassette contenenti gli embrioni in un becher e poi disidratare passandoli attraverso una serie di graduali etanolo a temperatura ambiente: etanolo al 70%, una volta per 30 min; etanolo 96%, due volte per 30 minuti ciascuno; etanolo al 100%, due volte per 30 minuti ciascuno.
      Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati in etanolo al 70% per un tempo indeterminato a 4 ° C fino a partire il processo di disidratazione.
   4. Incubare la cassetta tutta in isopropanolo a temperatura ambiente per 30 minuti.
   5. Usando il forcipe, trasferire le cassette a un vetro colorazione recipiente contenente isopropanolo pre-riscaldato e lasciare in forno a 60 ° C per 30 min.
   6. Posizionare le cassette in un nuovo vetro colorazione recipiente contenente una miscela di isopropanolo 50% / 50% paraffina cera fusa e lasciare per 4 ore in forno a 60 ° C.
   7. Incubare le cassette con gli embrioni con due cambi di paraffina fusa, 30 min a 60 ° C.
   8. Alla fine del lavaggio finale paraffina, aprire la cassetta e trasferire ogni embrione ad un tessuto separato l'incorporamento di stampo per visualizzare l'esempio sotto un microscopio stereoscopico.
   9. Riempire il pozzetto con cera di paraffina fusa a 60 ° C. Utilizzare pinze riscaldate per mantenere la cera fusa e orientare attentamente l'embrione nello stampo.
      Nota: Il corretto orientamento del campione è un passo fondamentale per il sezionamento dell'embrione nel piano desiderato.
   10. Prima paraffina si solidifica nello stampo, inserire un nastro senza il coperchio sulla parte superiore del blocco e riempirlo con cera di paraffina fusa. Lasciare raffreddare la cera rimanente fino solidificato durante la notte a temperatura ambiente.
   11. Una volta che la paraffina è completamente solidificata, rimuovere il blocco solido dallo stampo e memorizzare i blocchi di paraffina o a temperatura ambiente o a 4 ° C fino a¹⁴di sezionamento.
2. Sezionamento di paraffina
   1. Orientare la lama del microtomo e impostare 5-7 µm di spessore. 5.2.2. raffreddare il blocco di paraffina sul ghiaccio e trim per produrre un cubo o una piramide.
   2. Collegare il blocco al titolare del microtomo utilizzando una piccola quantità di cera fusa.
   3. Orientare il blocco per il taglio ottima. Sezione i blocchi di paraffina a fette spesse di 5-7 µm a temperatura ambiente mediante microtomo standard.
   4. Usando un pennello fine, inserire le sezioni in un bagno di acqua a temperatura ambiente per manipolare e selezionando fette.
   5. Pick up sezioni dal bagno di acqua con un vetrino da microscopio e trasferirli in un bagno di acqua a 42 ° C, per lo stretching.
   6. Rimuovere le sezioni dal bagno di acqua e metterli delicatamente sui vetrini microscopio adesione.
   7. Asciugare i vetrini bene in un forno a 37 ° C durante la notte per consentire le sezioni di aderire completamente, in caso contrario, essi possono perdersi durante la colorazione.
      Nota: Conservare i vetrini a 4 ° C fino a partire le procedure di colorazione.
3. Sparaffinatura e colorazione di contrasto delle sezioni di paraffina X-Gal-macchiato
   1. Mettere le diapositive su un vassoio di vetrini per microscopio in un forno a 60 ° C per almeno 45 min rendere più fluida la cera di paraffina.
   2. Trasferire i vetrini in un rack e utilizzare vetro colorazione piatti per effettuare le seguenti operazioni: immergere il rack in vaschette per la colorazione contengono alcoli di diminuire le concentrazioni per la rimozione completa di paraffina e idratazione dei tessuti: isopropanolo per 5 min a 60 ° C; isopropanolo per 3 min; etanolo al 100% per 2 min; etanolo al 96% per 1 min; etanolo al 70% per 1 min a temperatura ambiente.
   3. Risciacquare le sezioni in acqua distillata due volte per assicurarsi che non vi siano residui di alcol.
   4. Colorante di contrasto sezioni con una macchia (ad es. soluzione nucleare-Fast Red) per 5 min (di solito tra 3-8 min) a temperatura ambiente (Figura 2).
      Nota: Questa colorazione aiuta a svelare la struttura complessiva del tessuto nelle sezioni.
   5. Dopo la colorazione, lavare i vetrini in acqua distillata per 1 min e controllare sezione colorazione nel microscopio.
      Nota: Se la colorazione desiderata è troppo debole, controcolorazione sezioni nuovamente per un tempo più lungo.
   6. Disidratare sezioni nelle seguenti serie con aumento delle concentrazioni di etanolo: due lavaggi in etanolo al 95% per 2 minuti ciascuno, due lavaggi in etanolo al 100% per 2 minuti ciascuno, e, per evitare di sciogliere il blu colore precipita, solo un rapido lavaggio in xilene.
   7. Rimuovere le diapositive dal rack uno ad uno e metterli su un pezzo di carta. Quindi Monte e coprioggetto ogni slide utilizzando un mezzo di montaggio sintetico, permanente.
      Nota: Xilene è un prodotto infiammabile cui vapori sono irritanti e dannosi per la salute umana e per gli organismi acquatici. Ha bisogno di essere manipolato all'interno di un cappuccio e richiede l'uso di dispositivi di protezione appropriati.

Risultati

Qui vi mostriamo i risultati di applicare il protocollo standard per la reazione istochimica di β-galattosidasi usando X-gal come il substrato in embrioni di topo intero (Figura 1 e Figura 2). Utilizzando questo protocollo, esaminiamo l'espressione di membrana tipo 4-metalloproteinasi (mmp-Mt4) a diversi stadi di sviluppo embrionale (E9.5, E11.5 e 12.5) utilizzando topi mutanti Mt4-mmp che esprimono il reporter LacZ sotto il con...

Discussione

Il gene LacZ di e. coli è stato ampiamente usato come un reporter in studi di espressione genica a causa della sua alta sensibilità e la facilità di rilevazione. Il presente protocollo descrive un metodo classico per la rilevazione di β-gallone espressione basata su una reazione enzimatica che è facile e veloce da eseguire e poco costoso. Questo metodo può essere applicato anche senza grosse modifiche nell'intero supporto embrioni, organi intatti, sezioni di tessuto criostato o cellule coltivate.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	24137-1L-R
Agarose	SCHARLAU	50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium	VECTOR LABS	H-5501
Synthetic mounting media	MERCK	100579
96% Ethanol	PROLABO	20824365
99.9% Ethanol absolute	SCHARLAU	ET00021000
50% Glutaraldehyde solution	SIGMA-ALDRICH	G6403-100ml
85% Glycerol	MERCK	104094
99.9% Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5516
Magnesium chloride hexahydrate	SIGMA-ALDRICH	63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40)	SIGMA-ALDRICH	542334
Nuclear Fast Red counterstain	SIGMA-ALDRICH	N3020
Paraffin pastilles	MERCK	111609
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets)	SIGMA-ALDRICH	P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate	MERCK	1049840500
Potassium ferrocyanide	MERCK	1049731000
Sodium azide	SIGMA-ALDRICH	S8032
Sodium deoxycholate	SIGMA-ALDRICH	30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	SIGMA-ALDRICH	106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate	SIGMA-ALDRICH	71638
Thymol	SIGMA-ALDRICH	T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl)	SIGMA-ALDRICH	10812846001 (Roche)
X-GAL	VENN NOVA	R-0004-1000
Xylene	VWR CHEMICALS	VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm	SAKURA	4566
Rotatory Microtome	Leica	RM2235
Cassettes	Oxford Trade	OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm	VWR	ECN631-1575
Microscope slides	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER	J1820AMNZ
Flotation Water bath	Leica	HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades	Feather	UDM-R35
Paraffin oven	J.R. SELECTA	2000205
Wax Paraffin dispenser	J.R. SELECTA	4000490
Stereomicroscope	Leica	DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL	SIGMA-ALDRICH	T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	SIGMA-ALDRICH	T9661
Orbital shaker	IKA Labortechnik	HS250 BASIC
Stirring Hot Plate	Bibby	HB502
Vortex Shaker	IKA Labortechnik	MS1
Laboratory scale	GRAM	FH-2000
Precision scale	Sartorius	ISO9001
pHmeter	Crison	Basic 20
Optic fiber	Optech	PL2000