Utilizzando Ustilago maydis come un Trojan Horse per In Situ consegna di mais proteine

Riepilogo

Questo lavoro descrive la clonazione di un ceppo di Trojan horse Ustilago maydis per la consegna in loco delle proteine secrete mais in tre diversi tipi di tessuti mais.

Abstract

Ispirato a Homer´s Trojan horse mito, abbiamo progettato il patogeno mais Ustilago maydis per trasportare proteine secrete nel mais apoplasto permettendo l'analisi fenotipica in vivo. Questo metodo non si basa sulla trasformazione mais ma sfrutta genetica microbica e capacità secretiva di agenti patogeni. Nel presente documento, esso permette di ispezione di in vivo consegnato proteine secrete con alta risoluzione spazio-temporale a diversi tipi di siti d'infezione e tessuti. La strategia di Trojan horse possa essere utilizzata per integrare transitoriamente mais fenotipi di perdita-de-funzione, per caratterizzare funzionalmente domini proteici, per analizzare gli effetti della proteina fuori bersaglio, o per studiare l'iperdosaggio proteina-gioco, che lo rende un potente strumento per studi della proteina nel sistema raccolto del mais. Quest'opera contiene un protocollo preciso su come generare un ceppo di Trojan horse seguito da protocolli standardizzati infezione per applicare questo metodo a tre tipi di mais differenti del tessuto.

Introduzione

L'agente patogeno biotrophic Ustilago maydis è l'agente causativo del mais smut malattia¹. Essa colpisce tutte le parti aeree di mais con conseguente grandi tumori che contengono spore melanized, nero. A livello globale, U. maydis è stimata per causare una perdita annua di circa il 2% di rendimento di mais, mentre i tumori sono apprezzati come una prelibatezza gastronomica in Messico. Infezione di pianta è iniziata da un appressorium che secerne enzimi lisante parete cellulare per penetrare il primo strato di cellule epidermiche mais. Da un sito di infezione primaria, U. maydis cresce intracellulare e intercellularmente, invadendo la cella di uno o due strati ogni giorno^1,2. Risultati di successo infezione nell'ipertrofia di pianta che si trasforma in tumori visibili su cinque giorni post infezione^1,3,4. Durante tutte le fasi di infezione, i hyphae fungosi invaginano la membrana di citoplasma pianta senza alcun contatto diretto con l'host citoplasma^1,2. Lo spazio di apoplasmic stretto tra le ife d'infezione e la membrana del plasma di pianta è considerato il sito interattivo di ospite/patogeno, chiamato la zona di interazione biotrophic. Al fine di superare il sistema immunitario innato di pianta, U. maydis secerne una matrice di proteine effettrici nel biotrophic interazione zona¹. Alcuni effettori sono presi dalle cellule vegetali, mentre altri rimangono nel biotrophic interazione fuso^5,6,7,8. Uno apoplastico effector è UmPit2, che interagisce con le proteasi apoplastico mais per impedire il rilascio del peptide ZmZIP1 da ZmPROZIP da apoplastico proteasi attività^9,segnalazione¹⁰.

Negli ultimi decenni, U. maydis è diventato non solo un modello per la genetica fungina nell'interazione pianta-patogeno, ma anche uno strumento prezioso in biotecnologie a causa di un ciclo di vita ben compresa, facile accessibilità genetica e l'espressione eterologa di secreto proteine^11,12,13. Segnali per entrambi secrezione di proteine convenzionali e non convenzionali sono stati determinati che consente il controllo delle modifiche di posttranslational¹⁴. Recentemente, U. maydis è stato usato come uno strumento di Trojan horse per studiare piccole, secreto mais proteine in situ¹⁵. L'approccio di Trojan horse è stato usato con successo per analizzare la funzione della proteina secreta, piccola ZmMAC1 che si occupa dello sviluppo dell'antera. ZmMAC1 induce la divisione periclinal di cellule pluripotenti e specifica di destino delle cellule delle cellule neonata¹⁵. Con lo stesso metodo, la funzione biologica del mais danni-associated peptide ZmZIP1 è stata rivelata. U. maydis che secerne il mais che zmzip1 ha provocato alterato tumore formazione¹⁰. Così, il Trojan horse approccio rappresenta un prezioso itinerario alternativo alla proteina in situ studi ad alta risoluzione spazio-temporale che non richiedono la generazione di linee di trasformazione mais stabile né infiltrazione del tessuto con heterologously proteine espresse e purificate. In particolare, la strategia di Trojan horse permette la secrezione di tutta la proteina eterologa in mais apoplasto e confronto diretto di infetti contro cellule vegetali non infetti all'interno del tessuto stesso.

Questo protocollo illustra i passaggi principali per la generazione di un ceppo di Trojan horse U. maydis per studiare una proteina di interesse. Comprende ulteriori informazioni precise sulle procedure di infezione di tre tipi differenti del tessuto mais (foglie adulte, nappe e orecchie) con U. maydis, che è un prerequisito per studiare la funzione della proteina e progressione di spatiotemporal infezione in questi tessuti bersaglio. Ulteriori specificazioni non sono determinato su mais l'amplificazione del gene e microscopiche imaging tecniche, dal momento che questi passaggi sono specifici per la destinazione e strumento-dipendente. Così, questo protocollo è rivolto a utenti esperti di tecniche di biologia molecolare standard.

Protocollo

1. costruzione di un U. maydis Trojan Horse

Nota: Vedere la Figura 1.

1. Amplificare un gene di interesse da mais cDNA usando gli iniettori di gene-specific e una rilettura della polimerasi del DNA. Clonare il principale prodotto di PCR e trasformare il costrutto in e. coli seguendo le istruzioni del fornitore del plasmide. Verificare il gene corretto della sequenza di interesse dal Priore di sequenziamento Sanger da utilizzare per i prossimi passi di clonazione.
   Nota: PCR specifiche devono essere ottimizzati a causa delle specificità di sequenza primer e condizioni di reazione ottimale della polimerasi del DNA.
2. Disegnare primers per amplificare il gene mais di interesse senza la sequenza che codifica un peptide segnale (SP).
3. Estendere l'estremità a 5 minuti del reverse primer con il motivo RSIATA e un Ncoio taglio sito (tabella 1).
4. Amplificare il mais gene di interesse con una correzione di bozze polimerasi del DNA utilizzando il costrutto PCR generato in 1.1 come il modello PCR.
5. Matrimoniale-digerire il prodotto PCR e il plasmide trasformazione U. maydis , p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- Zmmac1-mCherry-Ha¹⁵, con XbaI e Nco I. purificare il digestato prodotto di PCR e plasmide.
6. Legare il prodotto PCR digerito nel p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- Zmmac1-mCherry-Ha modello utilizzando T4 DNA ligasi seguendo le istruzioni del produttore. Trasformare il prodotto di legatura in e. coli e verificare il gene corretto della sequenza di interesse di Sanger sequenziamento.
7. Linearizzare il p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- Zmgene di interesse-mCherry-Ha con l'enzima di restrizione Sspio e trasformazione del DNA in u solopathogenic . maydis ceppo SG200¹⁶. Isolare U. maydis trasformanti Carbossina selezione e confermare trasformanti isolati da Southern blot analisi¹⁶.
   Nota: Per ogni proteina d'interesse, almeno tre indipendenti U. maydis trasformanti dovrebbero essere isolato e analizzati per valutare eventuali effetti di fenotipo di sfondo casuale mutazioni.

2. terreni di coltura

1. Preparare YEPSlight liquido medio¹⁶: Estratto di lievito 1,0% (p/v), 0,4% (p/v) Bacto-Peptone e saccarosio 0,4% (p/v). Sciogliere tutti i componenti in ddH₂O e sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.
2. Preparare le patate-destrosio-agar (PD-agar)²⁰: 3,9% (p/v) patata destrosio agar e 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Mescolare tutti i componenti direttamente in bottiglia per sterilizzazione in autoclave e aggiungere ddH₂O più un ancoretta magnetica. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.
3. Preparare il PD-Charcoal agar²⁰: 3,9% (p/v) patata destrosio agar, carbone 1% (p/v) e 1.0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Mescolare tutti i componenti direttamente in bottiglia per sterilizzazione in autoclave e aggiungere ddH₂O più un ancoretta magnetica. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.

3. pianta infezione

1. Eseguire analisi di mais divisione cellulare in risposta a Trojan horse consegnato proteine (ad es., conta di base di microscopia cellulare) in anticipo. U. maydis-ha indotto la proliferazione delle cellule di mais e formazione successiva del tumore inizia intorno a 4-5 giorni post infezione. Valutazione quantitativa malattia dipendono dal tessuto e devono essere eseguite da 6 a 14 giorni post infezione.
   Nota: Cultivar di mais distinte mostrano diversi livelli di suscettibilità all'infezione U. maydis . Mais cvs W23, A188, flint Gaspe, Early Golden Bantam o Va35 mostrano suscettibilità nei confronti di questo agente patogeno e così sono cultivar adatto per studi di Trojan horse.
2. Preparazione dell'inoculo U. maydis
   1. Includono il ceppo progenitore SG200 come controllo negativo in tutti gli esperimenti di Trojan horse al fine di stimare gli effetti collaterali sull'infezione dal ceppo transgenico. Qui, usare un ceppo di U. maydis esprimendo una versione non-secreto della proteina di interesse come controllo negativo. Tuttavia, per ragioni di praticabilità (ad es., grandi proiezioni), il ceppo progenitore può essere la scelta più facile del controllo.
   2. Prima di iniziare l'esperimento, stimare quali importi della cultura di infezione sono necessari. Tenete a mente che l'infezione di ogni pianta richiede 1-1.5 mL di sospensione U. maydis dipendono dal tipo di tessuto mais.
      Nota: Circa 1 mL di una coltura durante la notte è sufficiente per la diluizione di un OD₆₀₀ di 0,2 in 20 mL di mezzo YEPS_luce e 25 mL di una cultura di U. maydis con un OD₆₀₀ di 0.8-1.0 sono sufficienti per l'infezione di piante di 13-16.
   3. Gratta e Vinci U. maydis da un agar PD piastra utilizzando una pipetta Pasteur sterile, inoculare in 5 mL di terreno YEPS_luce e lasciare che la cultura crescere a 28 ° C con agitazione costante a 200 giri/min per 16 h.
   4. Prima dell'infezione, è necessario esaminare la cultura di inoculazione U. maydis da microscopia chiara standard per la corretta crescita e contaminazione batterica a 400 ingrandimenti.
      Nota: In una cultura adatta, solo il fungo a forma di sigaro è visibile (Figura 2).
   5. Mescolare 900 µ l di YEPS fresca_luce con 100 µ l della coltura durante la notte e misurare il OD₆₀₀ YEPS_luce mezzo come un vuoto nell'analisi spettrofotometro.
   6. Diluire la cultura pernottamento con mezzo di_luce YEPS fresco a un OD₆₀₀ di 0.2 e lasciare che la cultura crescere a 28 ° C con agitazione costante a 200 giri/min fino a raggiungere la fase di crescita del Mid-log indicato da un OD_{600 nm} di 0.8-1.0.
      Nota: U. maydis cellule duplicare ogni 2 h in queste condizioni, così il desiderato OD₆₀₀ è raggiunta dopo 4-5 h di coltivazione.
   7. Raccogliere le cellule OD₆₀₀ di 0.8-1.0 di filatura a 3.000 x g per 10 min e scartare il surnatante.
   8. Lavare il pellet cellulare una volta con ddH₂O. A tale scopo, aggiungere un volume di cultura di ddH₂O, spin con 3000 x g per 10 min e scartare il surnatante.
   9. Risospendere il pellet cellulare attentamente in ddH₂O utilizzando una pipetta di vetro da 20 mL, aggiustando in questo modo il finale OD₆₀₀ a 3.0 (per l'analisi di un Trojan horse) o 1.0 (per voto di malattia).
3. Verifica del Trojan horse: planta secrezione della proteina di fusione mais
   1. Infettare piantine di mais con un Trojan horse ceppo¹⁷.
   2. Eseguire formazione immagine microscopica delle piantine infette alle 2-3 giorni post infezione utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. A tal fine, asportare un pezzo rettangolare di foglia 1 cm di sotto del punto di iniezione, posizionare il campione su un vetrino da microscopio e aggiungere una goccia di ddH₂O. Per visualizzare la proteina di fusione mCherry, eccitare esemplare a λ = 561 nm ed emissione record a λ = 580-630 nm.
4. Infezione di foglie di mais adulti
   1. Coltivare piante di mais alla fase di foglie adulte (quando almeno foglia 7 cresce all'interno del gambo).
      Nota: Questa fase viene raggiunta dopo quattro settimane dopo la semina in serra di 14 h, 28 ° C giorno/10 h, ritmo di notte di 22 ° C utilizzando CV W23. Durata può variare con le condizioni di cultivar e serra di mais.
   2. Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.
   3. Premere il gambo con attenzione per localizzare il tessuto di meristema nel gambo. La base del meristema può essere distinto da una transizione dal gambo più difficile al tessuto più morbido.
   4. Contrassegnare il meristema sul gambo con una penna.
   5. Iniettare 1,5 mL di U. maydis cultura 1 cm sopra il tiro meristem o di un meristema infiorescenza.
   6. Valuta i sintomi della malattia a 6 e 12 giorni post infezione.
5. Infezione di nappe
   1. Coltivare piante di mais fino a raggiungere la fase di nappa.
      Nota: Una cronologia temporale dettagliata sullo sviluppo dell'antera e nappa in mais CV W23 era precedentemente descritti¹⁸¹⁹. Nappe contenenti pre-meiotic antere sono altamente suscettibili all'infezione U. maydis ; nel mais CV W23 nappe sono le dimensioni di 4-7 cm.
   2. Premere il gambo con attenzione per localizzare la nappa nel gambo.
   3. Contrassegnare la punta e la base della nappa sul fusto mediante una penna.
   4. Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.
   5. Iniettare 1,5 mL di inoculo intorno la nappa. Per garantire un'equa distribuzione dell'inoculo, posizionare lentamente 0,5 mL ciascuno presso la punta, la parte centrale e la base della nappa segnata con la penna.
   6. Valuta i sintomi della malattia a 10 giorni post infezione.
6. Infezione delle orecchie
   Nota: lo sviluppo di tessuto orecchio differisce in distinte cultivar di mais e condizioni di serra e devono essere attentamente osservato prima dell'inoculazione. Orecchie a partire da superare sete sono altamente suscettibili all'infezione U. maydis .
   1. Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.
   2. Iniettare l'ago di inoculazione nello spazio tra le foglie di buccia più profondamente possibile senza danneggiare l'orecchio.
   3. Versione 1,5 mL di inoculo intorno all'orecchio.
   4. Rimuovere la siringa plus ago e massaggiare accuratamente pannocchia per distribuire la soluzione U. maydis ugualmente.
   5. Valuta i sintomi della malattia alle 14 giorni post infezione.
7. Confermare la vitalità dell'inoculo U. maydis
   1. Goccia di 10 µ l di inoculo su una piastra di agar carbone PD e incubare a temperatura ambiente per 2 giorni.
      Nota: Se la rispettiva cultura U. maydis è in grado di filamenti di forma, micelio bianco, lanuginoso diventa visibile (Figura 5)

Risultati

Costrutti per U. maydis Trojan horse esperimenti sono clonati nel plasmide p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2-gene di interesse-mCherry-Ha. Il mais gene di interesse è fusa ad un reporter di fluorescenza mCherry e un epitopo HA-tag. L'espressione della proteina di fusione è sotto il controllo del promotorepit2 U. maydis Um che specificamente si attiva durante l'infezi...

Discussione

Ricerca di coltura moderna richiede protocolli per l'analisi molecolare sulla genetica e i livelli della proteina. Accessibilità genetica tramite trasformazione non è disponibile o inefficiente e richiede molto tempo per la maggior parte delle specie coltivate come il mais. Inoltre, affidabili strumenti genetici quali sistemi reporter promotore sono scarse, che rende difficile studiare la funzione della proteina in situ con alta risoluzione spazio-temporale a siti di tessuto distinti. Apoplastico proteine poss...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle	B. Braun	4657640
Bacto Peptone	BD	211677
cDNA from maize			from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal	Sigma-Aldrich	05105
Confocal laser scanning microscope			use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm			use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification			use locally available equipment
Nco I	NEB	R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha			please contact the corresponding author
Pasteur pipet (glass, long tip)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar	VWR	90000-745
Sharpie pen			use locally available equipment
Spectrophotometer			use locally available equipment
Ssp I	NEB	R0132
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
T4 DNA ligase	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Xba I	NEB	R0145
Yeast extract	BD	212750