Incentivo e la valutazione di un modello murino di miopia sperimentale

Riepilogo

In questo protocollo, si descrive il processo completo di occhiali di incentivo in topi facendo uso di nuova concepito sperimentale miopia e la tecnica necessaria per il raggiungimento di risultati stabili e riproducibili in misure di parametri oculari.

Abstract

Modello murino della miopia può essere un potente strumento per la ricerca di miopia a causa della manipolazione genetica relativamente facile. Un modo per indurre la miopia negli animali è di mettere chiaro meno lenti davanti gli occhi per settimane (miopia indotta da lente, LIM). Tuttavia, ancora esistenti protocolli di incitamento e di valutazione variano da laboratorio a laboratorio. Qui, abbiamo descritto un metodo altamente pratico e riproducibile per indurre gli occhiali LIM in topi facendo uso di nuova concepito. Le correzioni di metodo la lente stabilmente davanti all'occhio del mouse mentre consente l'obiettivo di essere tolto per la pulizia o d'attualità droga amministrazione. Il fenotipo è robusto ed efficiente, e la varianza è piccola. Il metodo qui descritto può essere applicato ai topi subito dopo lo svezzamento che estende la durata possibile per esperimenti. Abbiamo anche dato tecnico fornisce consulenza per il raggiungimento di risultati riproducibili in rifrazione e misurazioni di lunghezza assiale. Ci auguriamo che il protocollo passo dopo passo descritto qui e l'articolo dettagliato può aiutare i ricercatori a eseguire esperimenti di miopia con miopia più scorrevole e rendere i dati comparabili attraverso laboratori.

Introduzione

La prevalenza della miopia è aumentato drammaticamente recentemente, mentre il meccanismo di insorgenza e progressione sono ancora in gran parte sconosciuto¹. Il fenotipo più caratteristico della miopia è l'allungamento della lunghezza assiale (AL), che aumenta il rischio per le complicazioni retiniche o persino cecità². Per meglio comprendere la patogenesi della miopia e sviluppare trattamenti efficaci, modelli animali miope robusti e stabile fenotipo valutazione sono necessari.

In breve, esistono due metodi per indurre stati miopi negli animali: miopia forma-privazione (FDM) e miopia indotta da lente (LIM)³. L'ex posti diffusori davanti all'occhio o la palpebra per oscurare l'immagine, che influenza lo sviluppo normale del bulbo oculare, risultante in un fenotipo di miopia di suture. I posti quest'ultimi meno lenti davanti all'occhio per spostare il punto focale dietro la retina. La retina rileva lo spostamento della messa a fuoco e si allunga il bulbo oculare per riallineare la retina ed il punto focale. Per FDM, dopo che la palpebra è chiusa o il diffusore è stato fissato davanti all'occhio, quasi alcuna manutenzione non è necessaria. Per LIM, la lente deve essere tolto per la pulizia al fine di mantenerlo trasparente. Così, FDM è relativamente facile da essere indotto tecnicamente. Tuttavia, i meccanismi della FDM e LIM sono diversi, e quale metodo imita la miopia in umani meglio è ancora in discussione³. Uno dei punti di forza della LIM è il fenotipo più forte rispetto a FDM, almeno nel caso di topi⁴.

Gli animali che sono stati utilizzati per l'induzione della miopia includono pulcini⁵scimmie⁶, toporagni albero⁷, cavie⁸e topi⁴. Considerando la possibilità di manipolazione genetica, anticorpi disponibili abbondanti e low cost per allevamento, topi avrebbe potuto essere la prima scelta come modello animale di miopia. Tuttavia, rispetto agli altri animali più grandi, fissaggio lenti o diffusori davanti all'occhio del mouse è relativamente difficile soprattutto per giovani topi come diritto dopo lo svezzamento. Per gli esperimenti che hanno bisogno di farmaci topici o misurazioni multiple occhio ad interim, è anche necessario per il telaio di essere removibile. Un'altra sfida è il piccolo cambiamento morfologico del bulbo oculare del mouse, che ha bisogno di sofisticate tecniche e dispositivi per valutare. Ad oggi, diversi che inducono e protocolli utilizzati in vari gruppi di ricerca di misura lo rendono difficile da confrontare e ripetere i risultati attraverso laboratori. È necessario un protocollo standard con dettagli.

Precedenti lavori descrivono più metodi per correggere le lenti o diffusori davanti all'occhio del mouse, ad esempio di incollaggio⁹, impunture¹⁰ e goggle testa-montata telaio^11,12. Abbiamo combinato le exist testa-montata goggle technics^11,12,13 con il nostro telaio di nuova concezione per sviluppare un protocollo migliorato per l'induzione robusto ed efficiente miopia sperimentale nei topi. Il protocollo può essere applicato ai giovani topi presto dopo lo svezzamento al giorno postnatale 21 (p21). Abbiamo inoltre ottimizzato i processi per stabile e precisa valutazione dei fenotipi compreso la rifrazione e AL. Speriamo che questo protocollo standardizzato può contribuire a rendere miopi topi un modello più facilmente accessibile per la ricerca di miopia.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico sulla ricerca animale della scuola di medicina dell'Università di Keio aderito all'ARVO istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research, le linee guida istituzionali sulla sperimentazione animale presso Keio Università e la ricerca di animale: Reporting di In Vivo esperimenti (arrivo) linee guida per l'uso di animali nella ricerca.

1. montaggio degli occhiali per topi

1. Preparare le parti necessarie per il montaggio degli occhiali (Figura 1a). Per ogni mouse, preparare tutti i followings: bastone un nylon testa-montata, uno superiore e uno inferiore titanio telaio, due lenti con poteri corretto secondo lo scopo dell'esperimento, una vite di dimensione m 1.4 con la lunghezza di 10 mm, un dado per vite di dimensione m 1.4, una pianura Rondella per vite di dimensione m 1.4 con lo spessore di 0,3 mm e due punte di unghie artificiali (Tabella materiali).
   Nota: Esistono di due tipi di fotogrammi con altezze diverse. Per un mouse, una cornice superiore e inferiore di un fotogramma vengono utilizzate come un insieme. Frame superiore dovrebbero essere messo sopra quelle inferiori al fine di rendere i campi di visione simmetrica. Montature e lenti sono appositamente progettati e realizzati dal gruppo di ricerca degli autori. Questi sono disponibili contattando gli autori corrispondenti di questo articolo. Altre parti possono essere trovati nei negozi al dettaglio strumento.
2. Montare il telaio per l'occhio destro e sinistro separatamente.
   1. Organizzare la punta dell'unghia per affrontare il senso esterno per raggiungere il migliore effetto protettivo. Regolare l'angolo tra la punta dell'unghia e al telaio di essere circa 130° per evitare di mascherare il campo di visione del mouse (Figura 1b). Rispettare le punte di unghie artificiali al telaio mediante adesivo cianoacrilato.
      Nota: Suggerimenti di unghia possono aiutare a proteggere l'obiettivo da essere graffiato dal mouse. La direzione delle punte dell'unghia deve essere opposta perché il fotogramma superiore e quello inferiore sono utilizzati per l'occhio destro e l'occhio di sinistra, rispettivamente.
   2. Attendere almeno 12 ore lasciare l'adesivo asciugare completamente, quindi utilizzare un tagliaunghie per regolare la forma dell'unghia suggerimenti per essere circa 1 cm × 1 cm di taglio e rifilatura.
   3. Rispettare la lente al telaio mediante adesivo cianoacrilato. Mettere la lente sul telaio a mano e tenere il telaio in posizione orizzontale. Iniettare l'adesivo cianoacrilato dal bordo della lente e lasciare che la diffusione di adesivo dalla tensione superficiale.
      Nota: L'adesivo sarà erodere la lente e influenzare la sua trasparenza, quindi assicurarsi che l'adesivo tocchi solo la parte periferica della lente. Usa la lente di plano 0 diottrie (D) come controllo e meno lente per indurre la miopia. L'effetto di diverse potenze di meno lenti (–10 D a –50 D) è stato descritto altrove⁴. Per massimizzare l'incentivo di miopia, lente D – 30 è raccomandato per l'induzione della miopia. FDM può anche essere indotto con lo stesso dispositivo semplicemente cambiando la lente nella PAC di microprovetta 1,5 mL come il diffusore.
3. Serrare la vite in nylon bastone insieme con la rondella dal lato piatto del bastone. Preparare i vetri dell'occhio e bastoni prima dell'esperimento rispettivamente e stock per un ulteriore uso (Figura 1C).
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. misurazioni della rifrazione e AL basale.

1. Applicare una goccia di agente mydriatic contenente 5 mg/mL tropicamide e fenilefrina cloridrato di 5mg/mL su ciascun lato del bulbo oculare per dilatare la pupilla. Attendere almeno 5 minuti prima di anestesia generale.
   Nota: Dilatare la pupilla in generale anestesia causerà reversibile della cataratta che influenza la misurazione in seguito. Sempre dilatare la pupilla prima l'anestesia generale e attendere per almeno 5 min. Una goccia (0,05 mL circa) dell'agente mydriatic è abbastanza per dilatare la pupilla dell'occhio del mouse, mentre l'agente più non farà male ai passaggi seguenti.
2. Mettere il mouse in anestesia generale. Afferrare la pelle posteriore del mouse morbidamente per tenere il mouse da urtare il suo occhio fino a quando esso è completamente anestetizzata. Giudicare la profondità dell'anestesia generale per essere sufficiente se il mouse non si muove quando viene messo sul tavolo liberamente.
   Nota: Una combinazione di midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e butorfanolo tartrato (50 μg/100 μL) è usata qui per l'anestesia generale per topi con un volume di iniezione intraperitoneale 0,01 mL/g. Generalmente, sono necessari meno di 5 min per topi ad addormentarsi. Lungo tempo di anestesia generale provoca bassa temperatura corporea e rallentamento del battito cardiaco. Per evitare la potenziale influenza di anestesia generale per la misurazione, finendo tutte le misurazioni entro 10 min dopo l'iniezione di anestetico è raccomandato. Il butorfanolo fornito nel cocktail anestetico forniscono circa 4 ore di analgesia. Ricetta corretta per l'anestesia generale può diversi dalle istituzioni.
3. Misurare la rifrazione dell'occhio del mouse utilizzando un photorefractor a raggi infrarossi^4,9,14. Regolare la direzione di uno degli occhi per mantenere la prima immagine di Purkinje al centro della pupilla e misurare la rifrazione lungo l'asse ottico del mouse. Dopo la misurazione, misurare l'occhio opposto con le stesse procedure (Figura 2a).
   Nota: Il valore misurato per la rifrazione è fortemente influenzato dalla posizione dell'occhio del mouse lungo l'asse ottico. Garantire che la prima immagine di Purkinje è allineata all'interno di ± 3 gradi dal centro della pupilla. Il banco di lavoro del sistema (SD-OCT) la tomografia ottica di coerenza dominio spettrale può essere utilizzato per una regolazione precisa della direzione della pupilla nella rifrazione misure⁴.
4. Misurare il dell'occhio del mouse utilizzando un sistema di SD-OCT^4,15,16. Definire AL come la distanza dal vertice cornea al confine più brillante nei pressi del nervo ottico (Figura 2b).
   Nota: Simile con la misurazione della rifrazione, AL è fortemente influenzato dalla direzione dell'occhio del mouse. Il vertice cornea può essere confermato dal punto-come riflesso sulla superficie della cornea. Il limite del lato retina saranno molto vago sul punto del nervo ottico. Regolare la direzione un po ' per lasciare che il limite di essere sufficientemente chiaro per la misurazione, ma non troppo lontano dal nervo ottico.

3. fissazione del telaio sul cranio del Mouse.

1. Applicare una goccia di collirio di 0,1% purificato sodio ialuronato per prevenire la secchezza su ogni occhio.
   Nota: Goccia dell'occhio sulla superficie dell'occhio influenzerà i valori di rifrazione e misurazioni di lunghezza assiale. Non usi il collirio dopo l'anestesia fino a fare tutte le misurazioni.
2. Mettere il mento del mouse anestetizzato su un pendio di argilla o qualsiasi cosa può essere utilizzato come un cuscino per rendere l'aereo in anticipo del cranio essere orizzontale.
3. Sterilizzare i capelli e il cuoio capelluto tra le orecchie e gli occhi con un batuffolo di cotone con etanolo al 70%.
4. Tagliare la pelle tra le orecchie e gli occhi per esporre il cranio per circa 0,8 cm² utilizzando pinzette e forbici chirurgiche. Rimuovere il periostio con tampone di cotone e liquido acquaforte dentale. Sterilizzare le forbici chirurgiche e pinzette con etanolo al 70% prima dell'intervento di ogni mouse.
   Nota: Ritaglio i capelli e indossare guanti sterili possono essere richiesti.  Verifica le disposizioni del Comitato di cura degli animali pertinenti prima di questa procedura. Nella maggior parte dei casi, il liquido acquaforte dentale può essere trovato come uno degli allegati nel sistema adesivo dentale autocura. Se il liquido acquaforte dentale non è disponibile, utilizzare etanolo al 70%.
5. Montare un set di fotogrammi senza lente per aiutare a fissare il bastone nella giusta posizione. Mettere i fotogrammi sulla testa del mouse. Regolare con cura la posizione dei fotogrammi per assicurarsi che entrambi gli occhi sono al centro della cornice vuota.
6. Utilizzare un sistema adesivo dentale autocura per fissare il bastone sulla testa del mouse. Fare attenzione a non lasciare che il liquido del flusso del sistema di aderire nell'occhio del mouse.
   Nota: Il metodo per usare il sistema adesivo dentale autocura è diverso tra i prodotti. Riferimento alle istruzioni attentamente.
   Attenzione: Alcuni dei reagenti del sistema adesivo dentale può essere tossico.
7. Attendere circa 5 minuti e togliere il telaio e il dado con attenzione senza modificare la posizione del bastone (Figura 3a).
8. Iniettare 0,75 mg/kg atipamezolo cloridrato per via intraperitoneale per aiutare il topo a ripresa dall'anestesia più rapidamente. Mettere il mouse in una gabbia individuale fino a completamente recuperato. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. l'inizio della miopia induzione e il mantenimento in seguito

1. Attendere almeno 24 ore dopo l'intervento chirurgico per lasciare che il mouse recuperare completamente dall'anestesia. Afferrare il bastone e mettere su montature con lenti. L'incentivo inizia a questo punto del tempo (Figura 3b).
   Nota: Per ridurre il disagio durante il recupero dall'anestesia e dare il tempo sufficiente per il sistema adesivo dentale coagulare, si consiglia di mettere sul telaio dopo i topi completamente recupero dall'anestesia. Il cemento resina del sistema adesivo coprirà completamente il taglio del cuoio capelluto. Di conseguenza, nessun trattamento specifico post-chirurgico è necessaria per prevenire l'infezione e di miglioramento di dolore post-operatorio. Subito dopo la prima volta di mettere sul telaio, topi saranno più consapevole dell'esistenza della lente e graffiare molto. Il comportamento lordo tornerà alla normalità dopo un paio d'ore. I topi con le lenti possono essere tenuti con la stessa densità ai topi normali.
2. Rimuovere il telaio e pulire le lenti e le punte di unghia con tamponi di cotone almeno due volte alla settimana per mantenere la trasparenza della lente.
   Nota: Non è necessario mettere il mouse in anestesia per rimuovere e mettere sul telaio. Fornire un supporto per i topi per sedersi, piuttosto che avere li appendere mentre lavorando con loro potrebbe ridurre il disagio.
   1. Se non è necessaria una misurazione ad interim, mettere il mouse sotto anestesia e misurare il mouse come descritto in precedenza. L'incentivo può essere continuata dopo il mouse recupero dall'anestesia.
3. Pulire la gabbia almeno due volte a settimana.
   Nota: Questa guida per mantenere la chiarezza della lente. Mettere una rete tra il mouse e il fondo della gabbia a filtrare gli scarti di cibo può anche essere utile.
4. Monitorare il peso corporeo e comportamento lordo. Confronta con la stessa età incontaminati topi durante il processo di intero sperimentale.
   Nota: Ad eccezione di alcuni comportamenti graffianti, nessun cambiamento significativo, compreso il peso del corpo si trova tra topi di esperimento con i topi non trattati.

Risultati

Al momento del check in primo luogo, se tutte le parti necessarie sono preparate (Figura 1a). Un esempio di un pezzo di eyeglasses assemblato è mostrato in Figura 1b. Fatta eccezione per il corpo principale dei telai e il dado, tutte le altre parti sono USA e gettare per ogni mouse. Un insieme degli occhiali completati è illustrato nella Figura 1 c. Modificare l'angolo tra i due telai per adattare ...

Discussione

Per assicurarsi che gli occhiali per essere fissato stabilmente sulla testa del mouse, alcuni passaggi in questo protocollo devono essere prestato grande attenzione. Il periostio deve essere rimosso completamente prima di utilizzare il sistema adesivo dentale. Il sangue sul cranio anche bisogno di essere ripulito con cura. Mentre una regolazione fine poco è accettabile subito dopo l'applicazione dell'adesivo, non muovere lo stick frequentemente prima che il sistema adesivo asciugare. Seguire le istruzioni del sistema ad...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan