Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

Riepilogo

Questo protocollo descrive la produzione di un sistema di 3-dimensionale organoid del mouse dei dotti biliari extrahepatic. Questi organoids biliare può essere mantenute in coltura per studiare biologia dei colangiociti. Organoids biliare esprimono marcatori di cellule progenitrici e cellule biliari e sono composte da cellule epiteliali polarizzate.

Abstract

Cholangiopathies, che interessano i dotti biliari extrahepatic (EHBDs), includono atresia biliare, colangite sclerosante primitiva e colangiocarcinoma. Non hanno nessuna opzione terapeutica efficace. Strumenti per studiare EHBD sono molto limitati. Il nostro scopo era di sviluppare un modello dei colangiociti preclinici, derivati da cellule staminali organo-specifiche, versatile, adulto che può essere facilmente generato da wild type e topi geneticamente modificati. Quindi, segnaliamo sulla nuova tecnica di sviluppare un sistema di coltura EHBD organoid (EHBDO) da EHBDs di topo adulto. Il modello è costo-efficiente, in grado di essere facilmente analizzati, e ha molteplici applicazioni a valle. In particolare, descriviamo la metodologia di isolamento EHBD mouse e dissociazione singola cella, organoid cultura iniziazione, propagazione e mantenimento a lungo termine e deposito. Questo manoscritto descrive anche EHBDO elaborazione per immunoistochimica, microscopia fluorescente e quantificazione di abbondanza del mRNA da reazione a catena della polimerasi in tempo reale di trascrizione d'inversione quantitativa (qRT-PCR). Questo protocollo ha significativi vantaggi oltre a produrre organoids EHBD specifici. L'uso di un medium condizionato dalle cellule L-WRN riduce significativamente il costo di questo modello. L'uso del mouse EHBDs fornisce quasi illimitato del tessuto per la generazione di cultura, a differenza di tessuto umano. EHBDOs del mouse generati contengono una popolazione pura di cellule epiteliali con marcatori del progenitore endodermico e biliare cellule differenziate. Colta organoids mantenere omogenea morfologia attraverso passaggi multipli e possono essere recuperate dopo un lungo periodo di conservazione in azoto liquido. Il modello consente lo studio di proliferazione delle cellule progenitrici biliare, può essere manipolato farmacologicamente e può essere generato da topi geneticamente modificati. Gli studi futuri sono necessari per ottimizzare le condizioni di coltura al fine di aumentare l'efficienza di placcatura, valutare la maturità funzionale delle cellule e differenziazione cellulare diretto. Sviluppo di modelli di co-coltura e una matrice extracellulare più biologicamente neutra sono anche auspicabile.

Introduzione

Cholangiopathies sono incurabili disordini progressivi cronici che colpiscono le cellule biliari situate in intra e dotti biliari extrahepatic (EHBDs)¹. Alcuni cholangiopathies, come colangite sclerotica primaria, colangiocarcinoma, atresia biliare e le cisti del coledoco, interessano principalmente EHBDs. Sviluppo di terapie per cholangiopathies è limitato dalla disponibilità limitata di modelli preclinici. Inoltre, studi precedenti incentrato su cholangiopathies raggruppati: fegato, intra- ed EHBDs. Tuttavia, intra - ed EHBDs hanno un'origine embrionale distinta e, quindi, dovrebbe essere considerata come patologie molecolari distinte. Dotti biliari intraepatici sviluppano dalle piastre ductal intraepatiche e della parte cranica del diverticolo epatico, tutta EHBDs sviluppare da parte caudale del diverticolo epatico². Si affidano anche compartimenti cellulari differenti progenitore per adulto omeostasi, compresi canali di Hering in dotti biliari intraepatici e ghiandole peribiliari in EHBDs^2,3. Uso di modelli animali per studi preclinici è limitata dalla spesa e deve essere ridotto al minimo per motivi etici. Di conseguenza, riduzionista, riproducibile, tempo e costo-efficienti modelli in vitro sono altamente desiderabili.

Maggior parte degli studi precedente di cholangiopathies utilizzato mouse normale o modelli di ratto del cancro o colangiocarcinoma umano linee cellulari derivate da intra - ed EHBDs^4,5,6,7. Tuttavia, questi sono modelli di cellule trasformate e non ripassare biologia dei colangiociti normale omeostasi o in uno stato sano. Recenti progressi nello sviluppo di modelli di coltura organotypic ha permesso lo sviluppo di strutture 3-dimensionale da diversi tipi di tessuto, compresi i tessuti di hepatobiliary, anche se non normale mouse EHBDs^{8,9, 10}. Queste strutture di "organo-come" puntato che imita il tessuto primario e sono cresciute in una nicchia artificiale sostegno auto-rinnovamento delle cellule staminali/progenitrici di organo-specifiche cellule¹¹.

"Organoid" è un vasto termine che più comunemente vengono descritti modelli 3-dimensionale del tessuto derivate da cellule staminali. Organoids può essere generato da riprogrammate pluripotenti le cellule staminali rappresentata da cellule staminali embrionali e cellule staminali pluripotenti indotte. Inoltre possono essere generate da cellule staminali adulte di organo-specific¹². Sono stati proposti alcuni modelli di organoid dei colangiociti in precedenti studi di ricerca. Così, organoids derivato da cellule staminali pluripotenti umane sono stati segnalati^7,9,13 e fornire uno strumento efficiente di prezioso, tempo che consente la generazione simultanea di diversi tipi di cellule. Tuttavia, questi organoids derivati da cellule staminali pluripotenti non riflettono completamente la struttura e la funzionalità del primario adulto EHBD colangiociti.

Organoids derivate da cellule staminali adulte del umano⁹ e felino¹⁰ del fegato sono stati anche proposti. Modelli di felini non sono ampiamente disponibili e hanno limitato armamentario di strumento per motivi di studio. Inoltre, questi fegato-derivate organoids derivati da cellule staminali di adulti non modellare extrahepatic colangiociti ma piuttosto intraepatico colangiociti.

Generazione di organoid EHBD è stato segnalato da umano normale EHBDs¹⁴ e mouse EHBD colangiocarcinoma¹⁵. Tuttavia, accesso ai tessuti umani EHBD è estremamente limitato e organoids derivata da un modello genetico murino di colangiocarcinoma¹⁵ non rappresentano dei colangiociti sano biologia all'omeostasi e sono derivati dalle cellule geneticamente modificate.

Per risolvere le limitazioni di pluripotent derivati da cellule staminali e fegato dei colangiociti organoid modelli e l'accesso limitato ai tessuti umani necessari in modelli preclinici, abbiamo sviluppato un modello murino di organoid EHBD (Figura 1A). Questo manoscritto descrive lo sviluppo di una tecnica per mouse organoids EHBD-derivate da tessuto adulto. Questi organoids EHBD denominato EHBDOs sarà un importante strumento in vitro per lo studio dei meccanismi alla base di EHBDs dei colangiociti omeostasi e processi di malattia, come ad esempio cholangiopathies.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Michigan.

1. preparazione di attrezzature e materiali per l'isolamento EHBD Mouse

1. Preparare mezzo semina e tampone di lavaggio (Tabella materiali) in 50 mL provette coniche e conservare a 4 ° C o su ghiaccio fino all'utilizzo.
2. Istituito un tavolo chirurgico (Figura 1B). Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzati (Figura 1).
3. Posizionare una piastra a 24 pozzetti sterile nell'incubatore 37 ° C coltura tissutale per pre-riscaldarla.
4. Trasferire un'aliquota di matrice seminterrato sul ghiaccio. Matrice di seminterrato uso solo quando esso è completamente liquefatto.

2. EHBD isolamento e coltura di Organoid biliare

1. Isolamento e la preparazione di una sospensione unicellulare del mouse EHBD
   1. Eutanasia di un topo adulto (età superiore a 2 mesi) secondo le linee guida istituzionali. Posizionare il mouse in posizione supina. Aprire la cavità addominale usando un metodo del midline e ritrarre il fegato a riposare sul diaframma.
   2. Identificare il dotto biliare comune situato immediatamente sotto l'ILO del fegato tirando delicatamente il duodeno prossimale con una pinza emostatica. Separare EHBD dai tessuti circostanti usando un bisturi. Tenendo l'estremità prossimale del dotto biliare comune con il forcipe, disseccarla distale appena sopra la giuntura con il duodeno, quindi sezionare l'estremità prossimale del dotto dal fegato (Figura 1). Inserire subito isolato EHBD (Figura 1E) nel tampone di lavaggio.
   3. Togliere il tampone di lavaggio EHBD e tritare in sezioni di 0,5 mm usando un bisturi sterile. Posizionare il tessuto su una lastra di vetro sul ghiaccio durante la procedura (Figura 1B).
   4. Inserire le sezioni EHBD in una provetta contenente 500 µ l di buffer di dissociazione. Incubare per 20 min a 37 ° C. Neutralizzare il buffer di dissociazione aggiungendo 500 µ l di terreno di coltura cellulare ghiacciata.
   5. Triturare la sospensione cellulare su e giù per progredire attraverso aghi 18 G e 20 G, 20 volte ciascuno. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 70 µm e raccogliere il flusso continuo in una provetta da 50 mL.
      Nota: La pre-condizione del filtro con 500 µ l di sterile tampone fosfato salino (PBS) prima del filtraggio per facilitare il passaggio della sospensione delle cellule.
2. Che istituisce EHBD organoids
   1. Centrifugare il flusso continuo dal punto 2.1.5 a 300 x g per 5 min a 4 ° C.
   2. Rimuovere con cautela il supernatante. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS sterile ghiacciata. Trasferire la risospensione in una nuova provetta da 1,5 mL. Ripetere il punto 2.2.1.
   3. Dopo la centrifugazione, rimuovere attentamente il surnatante da cellule lavate raccolte nella parte inferiore del tubo. Risospendere il pellet cellulare in 120 µ l di matrice liquefatto seminterrato ghiacciata pipettando su e giù utilizzando P200 consigli.
      Nota: Risospensione di pellet di cella nella matrice seminterrato deve essere effettuato il bagno di ghiaccio.
   4. Piastra 40 µ l della risospensione delle cellule nella matrice seminterrato nel centro di un pozzo in una piastra a 24 pozzetti pre-riscaldato.
      Nota: Evitare l'aspirazione di aria durante la manipolazione di matrice seminterrato per evitare la formazione di bolle.
   5. Restituire la piastra con le cellule risospese in matrice seminterrato nell'incubatore di coltura del tessuto di 37 ° C per 15 minuti o fino a matrice seminterrato è solidificato. Aggiungere 600 µ l del mezzo semina riscaldato fino a 37 ° C in ogni pozzetto (Tabella materiali). Riporre la piastra nell'incubatore di coltura del tessuto di 37 ° C.
   6. Sostituire il mezzo di semina con 600 µ l di terreno di coltura fresco organoid in 3 giorni e da allora in poi ogni 3 giorni. Monitorare la crescita organoid con un microscopio invertito. Uso organoids per un'applicazione a valle o Spalato ogni 7 a 9 giorni prima accumulazione del collasso di detriti e organoid intraluminal sono osservati (Figura 2A).

3. EHBD Organoid passaggio e deposito

1. Passaggio dei organoids EHBD 1:3 a 1:4 ogni 7-9 giorni
   1. Rimuovere il supporto dal pozzo e aggiungere 400 µ l di PBS ghiacciata. Risospendere il organoids pipettando delicatamente la miscela su e giù 10 volte nel pozzo. Trasferire il composto in una provetta da 1,5 mL.
   2. Passaggio la miscela attraverso un ago 25 G 4 volte per dissociare il organoids. Centrifugare la miscela a 400 x g per 4 min a 4 ° C.
   3. Rimuovere con cautela il supernatante e risospendere le cellule in matrice di seminterrato (1:3 a 1:4) per ulteriore coltura (passaggio 2.2.4.) o lavare le cellule con PBS freddo ghiaccio per un'ulteriore elaborazione.
      Nota: In genere, 250-300 cellule sono placcate nella piastra a 24 pozzetti per applicazioni a valle. Efficienza di placcatura può essere valutata da microscopia luminosa del campo utilizzando un microscopio invertito il giorno 3-5 dopo passaggio contando il numero di organoids e calcolando la percentuale dal numero iniziale delle cellule. mRNA può essere isolato da EHBDOs lavate in PBS utilizzando il protocollo standard mediante estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium.
2. Archiviazione a lungo termine dei organoids EHBD
   1. Rimuovere il supporto dal pozzo e lavare il organoids con temperatura ambiente PBS. Rimuovere PBS dal pozzo senza disturbare la goccia di matrice del seminterrato.
   2. Aggiungere 500 µ l di mezzo al pozzo di congelamento delle cellule ghiacciata. Risospendere il organoids nel seminterrato liquefatto matrix e medie di congelamento delle cellule delicatamente e trasferire il composto in fiale criogeniche.
   3. Conservare i flaconi a-80 ° C per 48 h. trasferimento le fiale ad un serbatoio di azoto per l'archiviazione a lungo termine in una fase di vapore.

4. EHBD Organoid Pprocessing per inclusione in paraffina

1. Risospendere il EHBDOs in 500 µ l di PBS ghiacciata (4 ° C) pipettando su e giù per 5 a 10 volte. Raccogliere il sedimento EHBDO in matrice liquefatto seminterrato in una provetta da 1,5 mL.
   Nota: Per evitare la rottura organoids, tagliare il fondo 2-3 mm di una punta di P1000 e rimuovere il surnatante con molta attenzione.
2. Centrifuga EHBD organoids a 350 x g per 5 min, rimuovere con cautela il supernatante senza disturbare il pellet organoid.
3. Aggiungere 1 mL di gelida paraformaldeide al 4% (PFA) per il organoids e incubare la organoids nel 4% PFA durante la notte a 4° C. Rimuovere i 4% PFA da organoids utilizzando una punta di P1000 dopo incubazione overnight.
4. Aggiungere 1000 µ l di PBS di temperatura per il tubo con la organoids e incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA). Centrifugare la provetta con organoids in PBS a 350 x g per 5 min, ripetere questo processo due volte.
5. Rimuovere PBS e aggiungere 1 mL di etanolo al 30% per il organoids. Incubare per 5 min a RT.
6. Centrifugare la provetta a 350 x g per 5 min a RT. Remove 30% etanolo. Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% e incubare per 5 minuti a TA.
7. Centrifugare a 350 x g per 5 min. Remove etanolo al 70%. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% e incubare per 5 minuti a TA.
   Nota: Organoids può essere mantenuto in etanolo al 100% a temperatura ambiente fino a 48 h prima della trasformazione ulteriore.
8. Gel di trattamento campione in un forno a microonde per 20 di calore s o fino a quando liquefatto. Aggiungere 50 µ l di campione gel nel tubo con organoids di elaborazione. Posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando il trattamento gel dei campioni sono solidificato.
9. Rimuovere la goccia di gel con organoids dal tubo di trattamento dei campioni e tra le pastiglie di spugna blu in una cassetta per l'ulteriore elaborazione nel processore del tessuto. Utilizzare 15 min per ogni passaggio in embedder la paraffina durante un'ulteriore elaborazione...
10. Sezione organoids paraffina-incastonato nel trattamento dei campioni gel a 4 µm. procedere come descritto in precedenza¹⁶di macchiatura immunohistochemical.

Risultati

Il nostro protocollo descrive la generazione di mouse EHBD organoids che sono tessuto-specifici e adulto derivati da cellule staminali. Dopo il organoids sono coltivate, una formazione di struttura cistica può essere osservata più presto 1 giorno dopo l'isolamento EHBD. Contaminazione con i fibroblasti non è osservata tipicamente durante la generazione di cultura. EHBDO efficienza di placcatura è di circa il 2% quando isolato da neonatale o adulto (età superiore a 2 mesi) topi (

Discussione

Questo lavoro descrive la generazione di un modello 3-dimensionale organotipiche del mouse EHBD colangiociti. Passi importanti nella generazione di cultura EHBDO includono dissezione meticolosa EHBD per evitare la contaminazione delle cellule di pancreas, mantenimento di condizioni di sterilità per evitare contaminazioni batteriche e fungine e un'attenta manipolazione dopo la centrifugazione per evitare il perdita di materiale cellulare. Una stretta aderenza alle condizioni di temperatura descritto è necessaria. Ci son...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12		Life Technologies	12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS)	1%	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS)	50 mL	Life Technologies	10010-023
Penicillin-Streptomycin	125 U/mL	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	6.25 µg/mL	Life Technologies	15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium	1:1	ATCC	CRL-3276
Advanced DMEM/F12	1:1	Life Technologies	12634-010
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
N-Glutamine	10 µl/mL	Life Technologies	35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES	10 mM	Life Technologies	15630-080
B27	10 µl/mL	Gibco	17504-044
N2	10 µl/mL	Gibco	17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium
Epidermal growth factor (EGF)	50 ng/mL	Invitrogen	PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10)	100 ng/mL	PeproTech	100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit	1:250	Abcam	ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit	1:200	Santa Cruz	sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit	1:2000	DSRB	F109-D12
E-cadherin antibody, Goat	1:500	Santa Cruz	sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse	1:500	Sigma-Aldrich	T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b	1:500	Invitrogen	A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line		ATCC	CRL-1573
Luciferase Assay Kit		Biotium	30003-2
0.05% Trypsin-EDTA		Life Technologies	25300054
0.4% Trypan Blue Solution		Life Technologies	15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel		CORNING	356237
Dissociation buffer, Accutase		Gibco	A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery		Life Technologies	12648010
Cell strainer (70 µm, steriled)		Fisherbrand	22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol		Invitrogen	15596026
Specimen processing gel, HistoGel		Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit		ATCC	30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube		Fisherbrand	05-408-129
24 well plate		USA Scientific	CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube		Fisher scientific	14-432-22
Fluorescence microscope		Nikon	Eclipse E800
Inverted microscope		Biotium	30003-2
Necropsy tray		Fisherbrand	13-814-61