Registrazioni elettrofisiologiche di correnti ioniche a cella singola sotto stress di taglio ben definito

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere una camera di flusso a piastre parallela modificata da utilizzare per studiare l'attivazione in tempo reale dei canali ionici meccanosensibili da sollecitazioni di taglio.

Abstract

Lo stress da taglio fluido è ben noto per svolgere un ruolo importante nella funzione endoteliale. Nella maggior parte dei letti vascolari, lo stress da taglio elevato da aumenti acuti del flusso sanguigno innesca una cascata di segnalazione con conseguente vasodilazione alleviando così lo stress meccanico sulla parete vascolare. Il modello di stress da taglio è anche ben noto per essere un fattore critico nello sviluppo di aterosclerosi con stress di taglio lamiarese essendo ateroprotettivo e disturbato stress di taglio essere aterogenico. Mentre abbiamo una comprensione dettagliata dei vari percorsi di segnalazione delle cellule intermedie, i recettori che prima traducono lo stimolo meccanico in mediatori chimici non sono completamente compresi. I canali ionici meccanosensibili sono fondamentali per la risposta alla cesoia e regolano la segnalazione delle cellule indotta da taglio controllando così la produzione di mediatori vasoattivi. Questi canali sono tra i primi componenti di segnalazione attivati per taglio e sono stati collegati alla vasodialazione indotta da taglio attraverso la promozione della produzione di ossido nitrico (ad esempio, rettificando interiormente K^e il potenziale del recettore transitorio [TRP] canali) e iperpolarizzante dell'endotelio (ad esempio, Kir e canali K^ad attivazione di calcio [KCa]) e vasoconstriction indotta da taglio attraverso un meccanismo indeterminato che coinvolge canali piezo. Comprendere il meccanismo biofisico con cui questi canali vengono attivati dalle forze di taglio (cioè direttamente o attraverso un meccano-recettore primario) potrebbe fornire potenziali nuovi obiettivi per risolvere la fisiofisiologia associata alla disfunzione endoteliale e l'aterogenesi. È ancora una grande sfida registrare l'attivazione indotta dal flusso dei canali ionici in tempo reale utilizzando l'elettrofisiologia. I metodi standard per esporre le cellule a sollecitazioni di taglio ben definite, come il reometro a cono e piastra e la camera di flusso della piastra parallela chiusa non consentono lo studio in tempo reale dell'attivazione del canale ionico. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere una camera di flusso a piastre parallele modificata che consente la registrazione elettrofisiologica in tempo reale dei canali ionici meccanosensibili sotto una sollecitazione di taglio ben definita.

Introduzione

Le forze emodinamiche generate dal flusso sanguigno sono ben note per svolgere ruoli importanti nella funzione endoteliale e vascolare^1,2. È anche noto che diversi tipi di canali ionici rispondono acutamente ai cambiamenti nello stress di taglio^3,4,5 portando all'ipotesi che i canali ionici possono essere sensori di stress da taglio primari. Più di recente, noi e altri abbiamo dimostrato che i canali ionici meccanosensitive svolgono ruoli critici in diverse funzioni vascolari sensibili allo stress di taglio, tra cui la risposta vasoattiva allo stress di taglio^6,7,8 e angiogenesi dello sviluppo⁹. I meccanismi della sensibilità di taglio-stress dei canali ionici, tuttavia, sono quasi totalmente sconosciuti. Questa lacuna di conoscenza è probabilmente dovuta alla difficoltà tecnica di eseguire registrazioni elettrofisiologiche sotto stress di taglio ben definito. In questo articolo, quindi, forniamo un protocollo dettagliato passo dopo passo regolarmente eseguito nel nostro laboratorio per raggiungere questo obiettivo^6,7,10,11.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di consentire l'indagine in tempo reale della meccanoattivazione del canale ionico sotto stress di taglio ben definito nella gamma fisiologica. Ciò si ottiene modificando una camera di flusso a piastre parallela standard per consentire la calatta elettrofisiologica nella camera e l'accesso alle cellule coltivate sulla piastra inferiore durante l'esposizione in tempo reale al flusso, fornendo un approccio unico per raggiungere questo obiettivo Obiettivo^6,7,11. Al contrario, le camere standard a flusso di lamiere parallele, descritte nelle pubblicazioni precedenti, possono essere utilizzate per l'analisi dell'imaging in tempo reale delle cellule esposte alle forze di taglio¹² o altri approcci non invasivi^13,14 ma non per Elettrofisiologia. Allo stesso modo, l'apparato cono e piastra, un altro potente approccio per esporre le cellule allo stress di taglio^15,16 non è adatto per registrazioni elettrofisiologiche. Pertanto, questi dispositivi di flusso non consentono l'indagine della sensibilità allo stress da taglio dei canali ionici. La difficoltà nell'eseguire registrazioni elettrofisiologiche in flusso è la ragione principale per la scarsità di informazioni sui meccanismi responsabili di questi effetti cruciali.

In termini di approcci alternativi per raggiungere lo stesso obiettivo, non ce ne sono così accurati o controllati. Alcuni studi precedenti hanno tentato di registrare l'attività del canale ionico sotto flusso esponendo le cellule a un flusso di liquido proveniente da un'altra pipetta portata in prossimità di una cella da oltre^17,18. Questo è altamente non fisiologico, in quanto le forze meccaniche generate in queste condizioni hanno poco in comune con i profili fisiologici dello stress da taglio nei vasi sanguigni. Simili preoccupazioni si applicano ai tentativi di simulare lo stress fisiologico di taglio per perfusione di camere aperte. Come discusso in dettaglio nel nostro studio precedente¹⁰, un'interfaccia ad aria liquida aperta crea più disturbi e ricircolo, che sono non fisiologici. Per affrontare tutte queste preoccupazioni, abbiamo progettato una camera di flusso a piastre parallele modificata (MPP), chiamata anche "dispositivo di flusso minimamente invasivo" nei nostri studi precedenti^6,7,10,11, dall'acrilico e ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio. Tuttavia, nonostante il fatto che la descrizione originale del progetto sia stata pubblicata quasi 20 anni fa ed è l'unico dispositivo di flusso che consente di eseguire registrazioni elettrofisiologiche sotto stress di taglio ben definito, questa metodologia non è stata adottato da altri laboratori e ci sono solo pochissimi studi che tentano di registrare le correnti in flusso. Crediamo, quindi, che fornire una descrizione dettagliata per l'utilizzo della camera di flusso MPP sarà di grande aiuto per le ricerche che sono interessate acanali ionici meccanosensibili e biologia vascolare.

Protocollo

L'uso di animali nei nostri studi è approvato dall'Università dell'Illinois al Chicago Animal Care Committee (#16-183).

1. Montaggio della camera a flusso di piastra parallela modificata

NOT: Fare riferimento alla tabella 1 e Figura 1 per gli ID della camera di flusso MPP. Si prega di fare riferimento alla Figura 1 per uno schema che descrive l'orientamento dei pezzi della camera per l'assemblaggio.

1. Per aderire al vetro di copertura rettangolare, pezzo D, sul fondo del pezzo C, fare prima la soluzione di elastomer in silicone mescolando accuratamente 500 l'agente di polimero in silicone elastomer osomero in 5 mL di base elastomer in silicone.
2. Applicare uno strato sottile della soluzione elastomer in silicone intorno ai bordi dello spazio rettangolare del pezzo C e posizionare delicatamente il pezzo rettangolare di vetro di copertura D direttamente sulla soluzione elastomer in modo tale che il pezzo D copre completamente lo spazio rettangolare aperto del pezzo C. Pulire con cura la soluzione di elastomeri in silicone in eccesso.
3. Ripetere il passaggio 1.2 per aderire al vetro di copertura rettangolare, pezzo F, sul fondo del pezzo E e consentire alla soluzione di elastomeri in silicone di curare durante la notte a temperatura ambiente.
   NOT: Una volta curato, il vetro di copertura rettangolare rimarrà aderito fino a sei mesi prima di dover essere sostituito.
4. A partire dal pezzo della camera inferiore, pezzo E, assemblare la camera di flusso MPP posizionando in sequenza ogni pezzo sopra il precedente nel seguente ordine: pezzo E (in basso), pezzo C, pezzo B, pezzo A (superiore).
5. Allineare i fori di vite di ogni pezzo agli angoli e avvitare saldamente i pezzi insieme per evitare che si verifichino perdite durante la somministrazione del flusso alla camera di flusso MPP.

2. Preparazione cellulare e semina nella camera di flusso MPP

NOT: Seguite i passaggi 2.1.2.7 per le cellule endoteliali coltivate. Seguite il metodo descritto nei passaggi 2.8.2.14 per isolare le cellule endoteliali dalla galleria arteriosa mesenteica del topo e la preparazione di cellule endoteliali appena isolate.

1. In una piastra a 6 pozzetti, mettere da quattro a cinque cerchi di vetro di copertura da 12 mm e cellule di semi tra il 10% e il 30% di confluenza in modo che sia possibile accedere a singole celle per le registrazioni elettrofisiologiche.
2. Incubare le cellule in condizioni di coltura standard (5% CO₂, 37 ) per non meno di 2 h per consentire alle cellule di aderire e non più di 24 h come cellule endoteliali nell'esperienza degli autori diventano molto piatte e difficili da correggere quando semina a sub-confluenza per più di 24 H.
3. Rimuovere un vetro di copertura contenente le cellule aderte da un pozzo della piastra a 6 pozzetti, risciacquare rapidamente in salina con tamponamento di fosfato (PBS) e trasferirlo in una teglia Petri da 35 mm contenente 2 mL di soluzione da bagno elettrofisiologico (tabella 2) prima del trasferimento al flusso MPP studio.
4. Trasferire il cerchio di vetro di copertura al vetro di copertura rettangolare, pezzo D, che viene aderito al pezzo C della camera di flusso MPP assicurandosi che una soluzione adeguata rimanga sul vetro di copertura in modo che le cellule non vengano esposte all'aria. Aggiungete la soluzione per il bagno desiderata (250 dollari l) alle celle in modo che il cerchio di vetro di copertura e le celle siano completamente sommersi in soluzione.
5. Posizionare il cerchio di vetro di copertura in modo che si appoggia nella metà più vicina al lato del serbatoio del vuoto in modo che le celle siano in linea con le aperture a vela del pezzo B. Assicurarsi che il cerchio di copertura in vetro aderisca al pezzo D attraverso l'adesione al vetro della soluzione in modo che l'applicazione flusso alla camera non interrompe la posizione del cerchio di vetro di copertura.
6. Assemblare la camera di flusso MPP avvitando i pezzi nell'ordine appropriato, come descritto nei passaggi 1.4 e 1.5 e come illustrato nella Figura 1. Trasferire la camera allo stadio del microscopio e perfondere immediatamente la camera con soluzione bagno in modo che la soluzione raggiunga il serbatoio sottovuoto per l'aspirazione (10 mL).
7. Identificare una cellula sana per l'esperimento identificando una cellula con un bordo scuro e un nucleo evidente. Evitare le celle che sembrano sbiancare o le celle che sono in contatto con altre celle.
   NOT: Nel laboratorio degli autori, vengono utilizzate cellule endoteliali aortiche umane e cellule endoteliali meusteriche primarie in coltura. Tuttavia, qualsiasi altro tipo di cellula aderente che è di interesse per esigenze di ricerca specifiche può essere utilizzato allo stesso modo.
8. Lavare il porticato dell'arteria isolata in soluzione di dissociazione (Tabella 2). Trasferire la sala giochi su un tubo di centrifugazione da 2 mL contenente 2 mL di soluzione di dissociazione preriscaldata (ricetta per la soluzione di dissociazione mostrata nella tabella 2) contenente proteasi neutra (0,5 mg/mL) ed elastasi (0,5 mg/mL). Incubare per 1 h a 37 gradi centigradi con agitazione delicata ogni 10 min.
9. Rimuovere 1 mL della soluzione di dissociazione proteasi/elastasi neutra e aggiungere 1 mg/mL di collagenae di tipo 1. Restituire la soluzione di collagenasi alla soluzione contenente le arterie per una concentrazione finale di tipo 1 di collagenee di 0,5 mg/mL. Incubare per 2/3 min a 37 gradi centigradi.
10. Utilizzando una pinze di grado 5, spostare rapidamente la sala giochi su una teglia Petri di 35 mm di diametro contenente una goccia di soluzione di dissociazione fresca e refrigerata di 750 gradi. Dissociare ulteriormente il tessuto utilizzando due aghi siringhe da 20 G per liberare meccanicamente le cellule endoteliali dalle arterie enzimaticamente digerite.
11. Utilizzando un tubo di vetro Pasteur usa e getta da 9", triturare la soluzione cellulare 10x prima di trasferire le cellule in un nuovo tubo di centrifuga di 1,5 ml utilizzando il tubo di vetro.
12. Lavare la piastra Petri con altri 750 gradi di soluzione di dissociazione e trasferirla nello stesso tubo. Utilizzando la pipetta di vetro, disperdere ulteriormente meccanicamente le cellule pipetting almeno 10x per creare una sospensione a singola cella facendo attenzione a non introdurre bolle che possono danneggiare l'integrità delle cellule endoteli.
13. Aggiungete 750 l della sospensione delle cellule endoteliali (500-1.000 celle) direttamente al pezzo D della camera di flusso MPP sulla metà più vicina al lato del vuoto del serbatoio. Lasciare che le cellule endoteliali aderiscano tra 45 min e 1 h a temperatura ambiente.
14. Assemblare la camera di flusso MPP avvitando i pezzi nell'ordine appropriato, come descritto nei passaggi 1.4 e 1.5 e come illustrato nella Figura 1. Trasferire la camera allo stadio del microscopio e perfondere immediatamente la camera con soluzione bagno in modo che la soluzione raggiunga l'aspirazione del vuoto (10 mL). Identificare le cellule endoteliali accessibili dal loro fenotipo ruvido e rotondo^19,20.
    NOT: Una varietà di metodi di digestione e cocktail enzimatici sono stati utilizzati per isolare le cellule endoteliali da diversi letti arteriosi. Vedere la tabella 3 per le descrizioni dettagliate dei protocolli che sono stati utilizzati da una varietà di ricercatori per isolare le cellule endoteliali per l'elettrofisiologia dei morsetti dei canali ionici meccanosensitive. Questi metodi sono probabilmente adatti per l'uso in combinazione con la camera di flusso MPP.

3. Controllo dello stress da taglio nella camera di flusso MPP per le registrazioni elettrofisiologiche dei canali Ion Ichanosensitive attivati dalla cesoia

1. Impostare un sistema di perfusione gravitazionale collegando un cilindro di siringa da 30 mL a un lucchetto a 3 vie dotato di tubi microbore (diametro interno: 0,05 pollici, diametro esterno: 0,09 pollici) adatto per l'inserimento nel foro di ingresso di 3 mm di diametro del pezzo A del MPP studio.
2. Attaccare il cilindro graduato alla faccia esterna della gabbia di Faraday che circonda il rig di elettrofisiologia (Figura 2) utilizzando nastro adesivo a due lati. Prima di inserire il tubo nella camera MPP, pre-riempire la siringa e i tubi con la soluzione del bagno (vedere la tabella 2 per la soluzione di bagno utilizzata per studiare la rettifica interiormente k^- canali nelle cellule endoteliali). Inserire il tubo nel foro di ingresso della camera di flusso MPP del pezzo A.
3. Pre-riempire la camera di flusso MPP con soluzione in modo tale che la soluzione viene rimossa nel serbatoio del vuoto. Interrompere il flusso verso la camera e riempire il cilindro graduato al marchio superiore. Calcolare manualmente le portate consentendo alla soluzione di fluire attraverso la camera e utilizzando un orologio di arresto per calcolare mL/s a una determinata altezza del cilindro di siringa.
4. Sollevare o abbassare la siringa per alterare il flusso, e quindi tagliare nella camera, e continuare questo processo fino a trovare un livello desiderato di stress di taglio.
5. Calcolare la sollecitazione di taglio in una camera parallela utilizzando la seguente equazione²¹:
   6/Q/h²w
   dove : viscosità del fluido (g/cm, Q, velocità di flusso (mL/s) e larghezza della camera a piastre parallele (w : 2,2 cm) e altezza (h - 0,1 cm).
   NOT: Nell'attuale sistema di perfusione gravitazionale, ad un'altezza del cilindro di siringa (misurata dalla parte superiore del cilindro) di 57 cm sopra lo stadio del microscopio, la portata è di 0,3 ml/s. La cesoia calcolata nella camera a questa altezza del cilindro di siringa e la portata è di 0,7 dyn/cm². Va anche notato che altri sistemi di perfusione, come una pompa peristaltica, possono essere utilizzati per controllare il flusso alla camera di flusso MPP. Tuttavia, questi dispositivi possono aggiungere turbolenza indesiderata e influenzare la stabilità delle misurazioni elettrofisiologiche in flusso, quindi, utilizzando il sistema di perfusione gravitazionale descritto qui è raccomandato.
6. Trasferire una camera assemblata contenente cellule aderenti allo stadio microscopio del rig di elettrofisiologia e inserire il tubo pre-riempito con soluzione vasca ripieno nel foro del pezzo A. Riempire contemporaneamente la camera e lavare le cellule con 10 mL di soluzione vasca da bagno girando la serratura a 3 vie in modo che la soluzione fluisca verso la camera.
7. Una volta ottenuta la configurazione di patch desiderata, consentire alle correnti del canale di stabilizzarsi in un bagno statico a temperatura ambiente. Una volta che le correnti si sono stabilizzate, applicare la cesoia in modo graduale permettendo agli aumenti di corrente di stabilizzarsi prima del successivo aumento dello stress da taglio.
   NOT: Gli autori trovano il maggior successo con la configurazione delle patch perforate durante lo studio dei canali ionici meccanoattivati nelle cellule endoteliali. Per eseguire configurazioni di patch intercellulari perforate, aggiungere 5 l of un'amphotericina di 60 mg/mL nel solfuro dimetilo (DMSO) a 1 mL di 0,2 m sterile soluzione di pipetta filtrata. Dopo aver generato un sigillo giga-ohm nella configurazione collegata alle cellule, le patch intere delle celle perforate si formano entro 2-5 min.
8. Rimuovere l'esposizione di taglio alle cellule fermando il flusso alla camera permettendo alle correnti di canale meccanosensitive di tornare alle correnti di base osservate nel bagno statico.
9. Isolare le correnti meccanosensibili del canale ionico di interesse alterando la valenza della soluzione (ad esempio, 60 mM K in soluzione di bagno con 0 Ca^{2 in} soluzione pipetta per studiare internamente la rettifica dei canali K. La tabella 2 mostra esempi di ricette di soluzioni) e/o l'inibizione farmacologica di fonti attuali potenzialmente contaminanti.

Risultati

Più fotografie che mostrano diverse viste della camera di flusso MPP sullo stadio del microscopio (pannello superiore) e una rappresentazione schematica della camera di flusso MPP (pannello inferiore) sono mostrati nella Figura 1. Lo schema descrive in dettaglio le dimensioni dell'intero dispositivo e della camera di flusso. La figura 2 mostra una fotografia del sistema di perfusione gravitazionale alla camera di flusso MPP nel ...

Discussione

Il sistema vascolare è costantemente esposto a forze emodinamiche attive, che attivano canali ionici meccanosensitive^3,22 ma i ruoli fisiologici di questi canali nella mechanotransduzione indotta da stress di taglio sono solo cominciando ad emergere^4,6,8. I meccanismi responsabili della meccanosensibilità dei canali attivati dallo stress di taglio rimangono sconosciuti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm sterile syringe filters	VWR	28145-501	Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution
5 grade forceps	Fine Scientific Tools	1252-30	Used for transferring digested arteries to fresh solution
9" Pasteur Pipet	Fisher Scientifc	13-678-20D	Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells
12 mm diameter Cover glass circles	Fisher Scientifc	12-545-80	For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses
24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass	Sigma-Aldrich	CLS2975224	Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)
24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass	Sigma-Aldrich	CLS2975245	Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)
20 G syringe needles	Becton Dickinson and Co	305175	For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries
35 mm Petri dish	Genesee Scientific	32-103	For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528-50MG	Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.
Collagenase, type I	Worthington Biochemical	100 mg - LS004194	Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientifc	67-68-5	Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp
Elastase, lyophilized	Worthington Biochemical	25 mg - LS002290	Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Corning	353046	For use with studies involving cultured cells and multiple treatments
Neutral protease/dispase	Worthington Biochemical	10 mg- LS02100 50 mg - LS02104	Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation
SylGard	World Precision Instruments	SYLG184	Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)
Tygon ND 10-80 tubing	Microbore Tubing	AAQ04133	ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber