Uso di saggi di ingresso virale e analisi di docking molecolare per l'identificazione di candidati antivirali contro il coxsackievirus A16

Riepilogo

L'obiettivo del protocollo è quello di illustrare i diversi saggi relativi all'ingresso virale che possono essere utilizzati per identificare gli inibitori di ingresso virale candidati.

Abstract

I test antivirali che esaminano meccanicamente l'ingresso virale sono pertinenti a discernere a quale passo gli agenti valutati sono più efficaci e consentono l'identificazione degli inibitori di ingresso virale candidati. Qui presentiamo gli approcci sperimentali per l'identificazione di piccole molecole in grado di bloccare l'infezione da parte del coxsackievirus non avvolto A16 (CVA16) attraverso il targeting delle particelle di virus o passaggi specifici nell'inserimento virale precoce. I saggi includono l'analisi del tempo di aggiunta della droga, il saggio di legame virale basato sulla citometria del flusso e l'analisi dell'inattivazione virale. Presentiamo anche un protocollo di attracco molecolare che utilizza proteine di capside virus per prevedere i potenziali residui presi di mira dai composti antivirali. Questi saggi dovrebbero aiutare nell'identificazione degli agenti antivirali candidati che agiscono sull'ingresso virale. Le direzioni future possono esplorare questi possibili inibitori per un ulteriore sviluppo di farmaci.

Introduzione

La malattia della mano, dell'afta epizootica e della bocca (HFMD) è una malattia più comunemente causata dal coxsackievirus A16 (CVA16) e dall'enterovirus 71 (EV71) nei bambini piccoli. Recentemente in tutta la regione Asia-Pacifico, c'è stato un significativo aumento dell'HFMD indotto da CVA16. Mentre i sintomi possono essere lievi, possono verificarsi gravi complicazioni che colpiscono il cervello e il cuore, con potenziale fatalità^1,2. Attualmente non sono disponibili terapie antivirali o vaccinazioni autorizzate per CVA16, per cui è urgente sviluppare strategie antivirali per frenare i futuri focolai e le relative complicanze.

CVA16 è un virus non inviluppo che ha un capside icosaedrio assemblato da pentamers che contengono ciascuno 4 proteine strutturali vale a dire VP1, VP2, VP3 e VP4. Intorno ad ogni asse di cinque volte nel pentamer è una regione 'canyon' che mostra come una depressione ed è nota per il suo ruolo nel legame recettore³. In fondo a questo canyon si trova una tasca idrofobica nella regione VP1 che contiene un ligando grasso naturale chiamato sphingosine (SPH). I recettori cellulari, come il ligando umano P selectin glicoprotein a 1 (PSGL-1) e il membro di classe B (SCARB2) del recettore scaventro, sono stati suggeriti per svolgere un ruolo nell'associazione virale spostando questo ligando che si traduce in cambiamenti conformazionali al successiva espulsione del genoma virale nella cellula ospite^4,5,6. L'identificazione di possibili inibitori che bloccano gli eventi successivi nel processo di ingresso virale potrebbe fornire potenziali strategie terapeutiche contro l'infezione da CVA16.

Le fasi del ciclo di vita del virus possono essere sezionate attraverso approcci sperimentali come obiettivi per aiutare a identificare agenti antivirali specifici della modalità. Un'analisi del tempo di aggiunta di droga esamina l'effetto del trattamento farmacologico in momenti diversi durante l'infezione virale, tra cui l'ingresso preliminare (aggiunto prima dell'infezione da virus), l'ingresso (aggiunto in concomitanza all'infezione da virus) e il post-ingresso (aggiunto a seguito della infezione da virus)⁷. L'impatto può essere valutato utilizzando un saggio standard della placca quantificando il numero di placche virali formate in ciascuna delle condizioni di trattamento. L'andetto di legame virale basato sulla citometria del flusso determina se il farmaco impedisce l'attaccamento virale alle cellule ospiti. Ciò si ottiene spostando la temperatura da 37 gradi centigradi, alla quale si verifica la maggior parte delle infezioni da virus umani, a 4 gradi centigradi, dove i virioni sono in grado di legarsi alla superficie della cellula ospite ma non sono in grado di entrare nelle cellule⁷. Le particelle di virus legate alla membrana cellulare vengono quindi quantificate attraverso l'immunostaining contro gli antigeni virali e valutate in base alla citometria di flusso. L'analisi dell'inattivazione virale, d'altra parte, aiuta a valutare le potenziali interazioni fisiche del farmaco con particelle di virus libere, schermaturando o neutralizzando i virioni, o causando aggregazioni o cambiamenti conformazionali che li rendono inattivi per successive interazioni con la superficie della cellula ospite durante l'infezione^8,9. In questo esperimento, l'inoculo virale è permesso di incubare prima con il farmaco prima di essere diluito per titolare il farmaco prima di infettare il monostrato della cellula ospite ed eseguire un saggio di placca standard⁸. Infine, l'aggancio molecolare è un potente strumento per prevedere potenziali siti di interazione farmacologica sulla superficie del virione, tra cui le glicoproteine virali dei virus avvolti e le proteine capside virali da virus non avvolti, utilizzando il computazionale Algoritmi. Questo aiuta a individuare meccanicamente meccanicamente i bersagli della modalità di azione del farmaco e fornire informazioni utili che possono essere ulteriormente convalidate dai saggi a valle.

Recentemente abbiamo impiegato i metodi sopra descritti per identificare i composti antivirali che bloccavano in modo efficiente l'infezione da CVA16^{9 non}invilita. Qui di seguito, i protocolli dettagliati che sono stati utilizzati sono descritti e discussi.

Protocollo

NOT: Tutte le colture cellulari e le infezioni da virus devono essere condotte in cappe di biosicurezza certificate appropriate per il livello di biosicurezza dei campioni trattati. I due tannini-classe di piccole molecole di acido chebulagico (CHLA) e punicalagin (PUG), che sono stati osservati per bloccare in modo efficiente l'infezione CVA16⁹, sono utilizzati come esempi di agenti inibitori candidati. Per i principi di base nelle tecniche di virologia, propagazione del virus, determinazione del tibieto del virus, e concetti di unità formanti placca (PFU) o molteplicità di infezione (MOI), il lettore è indicato al riferimento¹⁰.

1. Coltura cellulare, preparazione dei virus, preparazione composta e citotossicità composta

1. Le cellule umane di rhabdomyosarcoma (RD) sono cellule ospiti permesse all'infezione da CVA16¹¹. Far crescere le cellule RD in 10 mL del mezzo aquila (DMEM) modificato di Dulbecco integrato con siero bovino fetale 10% (FBS), 200 U/mL penicillinA G, 200 streptomici e 0,5 g/mL amphotericin B in flaconi T-75 a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5%.
2. Preparare il CVA16 propagando il virus nelle cellule RD e determinare il titro virale in PFU/mL. Per il protocollo ottimizzato, fare riferimento al riferimento¹¹.
3. Preparare i composti e i controlli di prova utilizzando i rispettivi solventi: ad esempio, sciogliere CHLA e PUG nel solfuro dimetilo (DMSO). Per tutte le fasi di infezione, il mezzo basale consisteva di DMEM più 2% FBS e antibiotici.
   NOT: La concentrazione finale di DMSO nei trattamenti composti di prova è uguale o inferiore allo 0,25% negli esperimenti; 0,25% DMSO è incluso come trattamento di controllo negativo nei saggi per il confronto.
4. Eseguire la citotossicilità dei composti di prova sulle cellule RD utilizzando un reagente determinante per la vitalità cellulare come XTT ((2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide). Per il protocollo dettagliato, fare riferimento al riferimento¹². Determinare le concentrazioni di citotossicità dei composti di prova utilizzando un software analitico come GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore. Concentrazioni di droga che non influenzano in modo significativo la vitalità cellulare ( cellule vitali del 95%) sono utilizzate per il resto dello studio.

2. Tempo di -farmaco-aggiunta di assaggio

1. Valutare l'influenza dei farmaci sulle cellule ospiti prima dell'infezione virale (pretrattamento)
   1. Semina cellule RD in piastre 12-well ad una densità di semina di 2 x 10⁵ cellule / bene. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5% per ottenere un monostrato.
   2. Trattare le cellule RD con composti di prova a concentrazioni non citossiche (determinate dal passaggio 1,4) in 1 mL di volume del supporto basale per 1 h o 4 h.
   3. Lavare le cellule con 1-2 mL di PBS prima di aggiungere 50 PFU/pozze di virus in mezzo basale (il volume finale dell'inoculum è di 300 gradi) per 1 h. Rocciare la piastra ogni 15 min.
   4. Dopo l'infezione, lavare nuovamente i monostrati utilizzando PBS, quindi sovrapporsi a 1 mL di supporti basali contenenti 0,8% di metilcellulosa per un'ulteriore incubazione a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5%.
   5. Dopo 72 h di incubazione, rimuovere il supporto di sovrapposizione e lavare i pozze utilizzando 2 mL di PBS.
   6. Fissare i pozzi utilizzando 0,5 mL di 37% formaldeide per 15 min.
   7. Rimuovere il supernatante e lavare di nuovo con PBS.
   8. Macchiare i pozzi utilizzando 0,5 mL di 0,5% soluzione viola cristallo. Quindi rimuovere la soluzione di macchia entro 2 min e lavare i pozzi con un flusso delicato di acqua prima dell'essiccazione dell'aria.
   9. Contare le placche virali mettendo la piastra su una scatola di luce bianca. Calcolare la percentuale (%) Infezione CVA16 come segue: (Mean n. di _{virus placca/Droga} media ' di virus placca _{-controllo DMSO}) - 100%.
2. Per valutare l'effetto dell'aggiunta dei farmaci e del virus contemporaneamente (co-aggiunta)
   1. Semina cellule RD in piastre 12-well ad una densità di semina di 2 x 10⁵ cellule / bene. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5% per ottenere un monostrato.
   2. Trattare le cellule RD con i composti di prova alle concentrazioni appropriate e 50 PFU/po di CVA16 (il volume finale dell'inoculum è di 300 gradi) contemporaneamente per 1 h. Rocciare la piastra ogni 15 min.
   3. Lavare le cellule con 1 mL di PBS e poi sovrapporsi a 1-2 mL di supporti basali contenenti 0,8% di metilcellulosa per un'ulteriore incubazione a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5%.
   4. Macchie virali con cristallo viola dopo 72 h dopo l'infezione e determinare l'% CVA16 infezione come descritto sopra.
3. Valutare l'effetto del trattamento farmacologico dopo l'ingresso virale (post-infezione)
   1. Semina cellule RD in piastre 12-well ad una densità di semina di 2 x 10⁵ cellule / bene. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5% per ottenere un monostrato.
   2. Inoculare le celle RD con 50 PFU/pozzetto di CVA16 (il volume finale dell'inoculum è di 300 gradi) per 1 h. Rocciare la piastra ogni 15 min.
   3. Lavare i pozze con 1-2 mL di PBS e sovrapporre le cellule con supporti basali contenenti 0,8% di metilcellulosa e le concentrazioni appropriate di composti di prova.
   4. Macchie virali con cristallo viola e contare dopo 72 h dopo l'infezione e determinare la% incubazioni di infezione CVA16 descritte sopra.
      NOT: Eseguire delicatamente tutti i lavatori PBS per evitare di sollevare le cellule.

3. Ansaggio di rilegatura basato su citometria di flusso

1. Semina cellule RD in piastre 12-well ad una densità di semina di 2 x 10⁵ cellule / bene. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO₂ del 5% per ottenere un monostrato.
2. Pre-raffreddare il monostrato di cellule a 4 gradi centigradi per 1 h.
3. Infettare le cellule RD con CVA16 (MOI - 100) in presenza e assenza dei composti di prova per 3 h a 4 gradi centigradi.
   NOT: Eseguire l'inoculazione virale sul ghiaccio e la conseguente incubazione in un frigorifero a 4 gradi centigradi per mantenere la temperatura a 4 gradi centigradi, che consente la legame virale ma non l'ingresso.
4. Rimuovere l'inoculum del virus e lavare una volta con 1-2 mL di PBS ghiacciato.
5. Sollevare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone di dissociazione ghiacciata ai pozzi di ghiaccio per 3 minuti, prima di raccogliere le cellule e risalirle nel buffer di citometria del flusso a freddo ghiaccio (1x PBS più 2% FBS).
6. Lavare le cellule due volte usando il buffer di citometria del flusso di ghiaccio e fissare le cellule con 0,5 mL del 4% di paraformaldeide per 20 min sul ghiaccio.
7. Lavare le cellule utilizzando PBS per rimuovere eventuali virus non legati o debolmente legati, quindi macchiare le cellule con 1 mL di anticorpo anti-VP1 (1:2,000; diluito in PBS contenente 3% BSA) sul ghiaccio per 1 h, seguito da incubazione con un anti-topo igG con rilegare Alexa 488 (1:250; diluito in PBS contenente il 3% di BSA) sul ghiaccio per 1 h. Eseguire lavamenti PBS (3 volte) a seguito di ogni trattamento anticorpale.
8. Risospendere le cellule in 0,5 mL del buffer di citometria a flusso freddo ghiaccio ed eseguire l'analisi della citometria di flusso su un citometro di flusso utilizzando procedure standard. Presentare i dati negli istogrammi utilizzando il software associato e quantizzare per la rappresentazione del grafico a barre.

4. Assay di inattivazione virale

1. Eseguire il test di inattivazione virale come descritto in precedenza¹² utilizzando le seguenti condizioni:
   - Una concentrazione iniziale di 10⁶ PFU/mL di CVA16.
   - monostrati a cellule RD in piastre 12 pozze da una densità di semina di 2 x 10⁵ cellule / bene.
   - Diluizione 50 volte per esitare i composti farmacologici con conseguente concentrazione finale di virus di 50 PFU/pozzo.
   - Lavare i passaggi utilizzando 1-2 mL di PBS.
   - Supporti sovrapposti contenenti lo 0,8% di metilcellulosa.
2. Eseguire la lettura finale dell'infezione virale utilizzando la colorazione viola cristallina della procedura di placche virali come descritto sopra.

5. Analisi dell'attracco molecolare

1. Scarica molecole 3D di composti di prova da PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Se le molecole non hanno una struttura 3D caricata, scaricare le strutture 2D o utilizzare la sequenza di stringhe SMILES e trasformarsi in molecole 3D tramite un programma molecolare (ad esempio CORINA).
2. Scarica l'unità di assemblaggio biologico virale da RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) e prepara il modello di struttura virale utilizzando un programma di biocomputing (ad esempio UCSF Chimera). Ad esempio, nel caso della struttura cristallina virione matura CVA16 (PDB: 5C4W)³, eliminare i solventi dal file PDB, sostituire le catene laterali incomplete utilizzando i dati della libreria Rotamer di Dunbrach 2010 e aggiungere idrogeno e cariche alla struttura come precedentemente riportato¹³. Gli obiettivi di attracco possono essere qualsiasi proteina virale rilevante per l'analisi prevista con un'informazione biologica sull'assemblaggio (Protein Data Bank).
3. Dock composti di prova sull'unità antivirus preparata utilizzando ad esempio UCSF Chimera, e analizzare i file di output con un software di visualizzazione (ad esempio, Autodock Vina, PyMol):
   1. Caricare il file composto di prova in UCSF Chimera come 'ligando' ed eseguire l'attracco cieco selezionando l'intera proteina virale preparata come il 'recettore'. Utilizzare il mouse del computer o trackpad per ridimensionare il volume di ricerca per l'intero 'recettore'. In "Opzioni avanzate", consentire al numero massimo di modalità di rilegatura. I fotogrammi di ancoraggio verranno automaticamente classificati dall'energia di rilegatura più alta a quella più bassa.
   2. (Facoltativo) Oltre all'attracco cieco, confina il sito di attracco sulla proteina virale nelle regioni di interesse derivate dai risultati dell'attracco cieco utilizzando nuovamente il mouse o il trackpad per ridurre il volume di ricerca (ad es., 100 x 100 x 100). Questo passaggio consente di confermare i risultati dell'attracco cieco e aumenta la specificità.
   3. Utilizzare un sistema grafico molecolare (ad esempio PyMol) per analizzare le posizioni delle modalità di rilegatura caricando il file di ancoraggio. Trovare contatti polari dal composto alla proteina virale selezionando il "ligando" e identificando i contatti polari con l'opzione "a qualsiasi atomo"; esaminare i risultati.

Risultati

Il saggio di aggiunta del tempo della droga è indicato nella Figura 1 e mostra l'influenza del trattamento utilizzando le piccole molecole CHLA e PUG sull'infezione CVA16 sia all'ingresso pre-virale (pretrattamento), durante l'ingresso virale (co-aggiunta), o l'ingresso post-virale ( post-infezione). Entrambe le molecole piccole hanno prodotto solo un impatto marginale contro l'infettività del CVA16 sia nel pretrattamento delle cellule ospiti prima dell'inf...

Discussione

In questo rapporto, abbiamo descritto i protocolli che sono utili per l'identificazione di candidati antivirali che prendono di mira l'ingresso virale, in particolare contro il CVA16 non inviluppo. I test sono progettati in modo da sezionare i primi eventi durante l'ingresso virale, il che è utile per chiarire i meccanismi di azione e i potenziali obiettivi dell'attività antivirale degli agenti di prova. Il "saggio del tempo di aggiunta del farmaco" consente di determinare ampiamente il potenziale bersaglio dei compost...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG	Invitrogen	A11029
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Anti-VP1 antibody	Merck-Millipore	MAB979	Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer	Beckman Coulter	FC500
Corina	Molecular Networks GmbH
Crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
Formaldehyde	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
Methylcellulose	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
PyMol	Schrödinger
UCSF Chimera	University of California, San Francisco