Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Riepilogo

Questo articolo descrive un metodo per montare fragili embrioni di pesce zebra per la microscopia confocale time-lapse estesa. Questo metodo a basso costo è facile da eseguire utilizzando normali piatti di microscopia con fondo di vetro per l'imaging su qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni.

Abstract

Le dinamiche di sviluppo possono essere seguite da microscopia confocale time-lapse di embrioni di pesce zebra transgenici vivi che esprimono fluorescenza in tessuti o cellule specifici. Una difficoltà con l'imaging dello sviluppo di embrioni interi è che gli embrioni di pesce zebra crescono notevolmente in lunghezza. Quando montato come regolarmente fatto in 0.3-1% agarose a bassa fusione, l'agarose impone restrizione di crescita, portando a distorsioni nel corpo embrionale morbido. Tuttavia, per eseguire la microscopia confocale time-lapse, l'embrione deve essere immobilizzato. Questo articolo descrive un metodo di montaggio stratificato per gli embrioni di pesce zebra che limitano la motilità degli embrioni, consentendo al contempo la crescita illimitata. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni. Per dimostrare l'usabilità di questo metodo, lo sviluppo vascolare, neuronale e muscolare dell'intero embrione è stato immagine nei pesci transgenici per 55 ore consecutive. Questo metodo di montaggio può essere utilizzato per l'imaging facile e a basso costo di embrioni di pesci zebra interi utilizzando microscopi invertiti senza requisiti di stampi o attrezzature speciali.

Introduzione

Il pesce zebra è stato a lungo un organismo modello per la biologia dello sviluppo, e la microscopia è il metodo principale per visualizzare lo sviluppo embrionale. I vantaggi dell'utilizzo di embrioni di pesce zebra per gli studi sullo sviluppo includono piccole dimensioni, chiarezza ottica, rapido sviluppo e alta fecondità del pesce adulto. La generazione di linee di pesci zebra transgenici che esprimono fluorescenza in alcuni tessuti o cellule ha permesso una visualizzazione diretta dello sviluppo dei tessuti in modi non possibili con animali vertebrati più grandi. In combinazione con la microscopia time-lapse, i dettagli e le dinamiche dello sviluppo dei tessuti possono essere facilmente studiati.

Una difficoltà con lo sviluppo di pesci zebra imaging è che gli embrioni crescono notevolmente in lunghezza; l'embrione estende la sua lunghezza quattro volte entro i primi 3 giorni di vita¹. Inoltre, il corpo dell'embrione precoce è morbido e diventa facilmente distorto se la crescita è limitata. Tuttavia, per eseguire la microscopia confocale, l'embrione deve essere immobilizzato. Per mantenere gli embrioni in posizione fissa per l'imaging confocale time-lapse, sono regolarmente anestesizzati e montati in agarose a bassa fusione dello 0,3-1%. Questo ha il vantaggio di consentire una certa crescita durante l'imaging per un certo periodo di tempo, limitando al contempo i movimenti dell'embrione. Parti dell'embrione possono essere efficacemente immagini come questa. Tuttavia, quando si utilizza questo metodo per l'imaging dell'intero embrione per periodi di tempo prolungati, si osservano distorsioni a causa della crescita limitata causata dall'agarose. Pertanto, sono necessari altri metodi di montaggio. Kaufmann e colleghi hanno descritto un montaggio alternativo di embrioni di pesce zebra per la microscopia a fogli opaci, come la microscopia selettiva dell'illuminazione piana (SPIM), montando gli embrioni in tubi fluorurati di propilene di etilene (FEP) contenenti basse concentrazioni di agarose o metilcellulosa². Questa tecnica produce una superba visualizzazione dell'embriogenesi nel tempo. Schmid e t al. descrivono il montaggio di fino a sei embrioni in agarose in tubi FEB per la microscopia light-sheet³ che fornisce la visualizzazione di diversi embrioni in una sessione di imaging. Le muffe sono state utilizzate per creare array di embrioni per un montaggio efficiente di un numero maggiore di embrioni⁴. Masselkink et al. hanno costruito stampi in plastica stampati in 3D che possono essere utilizzati per fare calchi di silicio in cui possono essere collocati embrioni di pesce zebra in diverse fasi, consentendo il montaggio in una posizione costante per l'imaging, compresa l'imaging confocale⁵. La stampa 3D è stata utilizzata anche per realizzare stampi per un posizionamento coerente degli embrioni di pesce zebra in formato 96-well⁶. Alcuni stampi sono personalizzati per alcune fasi e non possono consentire una crescita illimitata per lunghi periodi di tempo, mentre altri stampi sono più flessibili. Recentemente, Weijts ealtri ha pubblicato la progettazione e la fabbricazione di un piatto di quattro pozzi per l'imaging dal vivo di embrioni di pesce zebra⁷. In questo piatto, la coda e il tronco degli embrioni di pesce anestesizzati sono posizionati manualmente sotto un tetto in silicone trasparente attaccato appena sopra un vetro di copertura per formare una tasca. L'embrione viene quindi fissato in questa posizione con l'aggiunta dello 0,4% di agarose. Questo montaggio consente l'imaging della parte posteriore lunga circa 2 mm (tronco e coda) dell'embrione, e poiché fino a 12 embrioni possono essere montati per pozzo, il metodo consente l'imaging di più campioni. Allo stesso modo, Hirsinger e Steventon hanno recentemente presentato un metodo in cui la testa del pesce è montata in agarose, mentre la coda può crescere liberamente, e questo metodo facilita anche in modo efficiente l'imaging della regione del tronco e della coda dell'embrione⁸.

Questo articolo descrive un metodo di montaggio stratificato per gli embrioni di pesce zebra che limitano i movimenti degli embrioni, consentendo al contempo una crescita illimitata. I vantaggi di questo metodo di montaggio sono che si tratta di un metodo a basso costo, veloce e facile per montare embrioni di varie fasi per l'imaging utilizzando qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio consente l'imaging a lungo termine di tutto il corpo (testa, tronco e coda) durante lo sviluppo dell'embrione. Per mostrare l'usabilità di questo metodo, lo sviluppo vascolare, neuronale e muscolare dell'intero embrione è stato immaginato nei pesci transgenici. Due embrioni per sessione, a due lunghezze d'onda in 3D sono stati immagini per microscopia time-lapse per 55 ore consecutive per rendere i filmati dello sviluppo dei tessuti.

Protocollo

Il lavoro sugli animali qui presentato è stato approvato dai Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Houston e dell'Università dell'Indiana.

1. Allevamento di pesce

NOTA: il lavoro con i modelli vertebrati richiede un protocollo approvato IACUC. Dovrebbe essere condotta secondo le pertinenti linee guida nazionali e internazionali.

1. Mantenere il pesce zebra adulto come descritto nella letteratura pubblicata in precedenza⁹.
2. Nel pomeriggio, mettere il pesce zebra adulto in serbatoi di allevamento. Allevare i maschi alle femmine con un rapporto di 1:2.

2. Preparazione delle soluzioni

1. Fare una soluzione di stock di 1% agarose bassa fusione nei supporti embrionali (E3: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, regolato a pH 7.0). Aliquota la soluzione di magazzino in tubi da 1,5 mL e conservarli a 4 gradi centigradi.
2. Fare una soluzione di magazzino del 4% (w/v) Tricaine (MS-222) in acqua distillata. Conservare a 4 gradi centigradi in una bottiglia scura.
   AVVISO: La tricaina è tossica e deve essere pesata e disciolta in una cappa di fumi.
3. Fare una soluzione di riserva di 20 mM N-fenylthiourea (PTU) in acqua distillata. Conservare a -20 gradi centigradi.

3. Preparazione degli embrioni

1. Dopo l'accoppiamento, raccogliere gli embrioni in E3 in una parabola di Petri e incubarli a 26,5 gradi centigradi per circa 28 ore prima del montaggio.
   NOTA: Questo rallenta lo sviluppo degli embrioni in modo che gli embrioni siano approssimativamente a 30 periodo di somite all'inizio dell'imaging.
2. Anestesizza gli embrioni in 0.016-0.020% tricaina in E3. Per inibire la pigmentazione, aggiungere il PTU a una concentrazione di 200 M.
3. Dechorionate gli embrioni usando pinze al microscopio sezionante. Utilizzando due pinze, afferrare e tirare delicatamente il chorion a parte per rilasciare l'embrione.

4. Montaggio in agarose

NOTA: Il metodo di montaggio sviluppato richiede due diverse concentrazioni di agarose a bassa fusione in E3 con 0.02% Tricaine e PTU in base alle esigenze. La prima soluzione agarose contiene una concentrazione ottimale di agarose alla quale la distorsione e la motilità sono al minimo. L'ottimizzazione è descritta nel passaggio 5 riportato di seguito.

1. Riscaldare le soluzioni agarose per i due strati (concentrazione definita al punto 5 sotto e 1%) a 65 gradi centigradi. Lasciare raffreddare l'agarose fino a circa 30 gradi centigradi appena prima del montaggio in modo che l'embrione non sia danneggiato dal calore. Per il montaggio, utilizzare piatti in vetro inferiore da 35 mm con fondo in vetro di copertura N. 0. Il vetro di copertura attaccato alla parte inferiore della parabola crea un pozzo di 10 mm poco profondo (circa 1,2 mm di profondità), in cui l'embrione deve essere posizionato.
   NOTA: In questo caso, la concentrazione con la minor motilità e distorsioni è stata compresa tra 0,025 e 0,040%.
2. Posizionare delicatamente un embrione dechorionato con uno dei suoi lati laterali verso il fondo del piatto utilizzando una pipetta di vetro o micropipetta. Se si utilizza una micropipetta, tagliare la parte esterna della punta per aumentare le dimensioni dell'apertura per adattarla all'embrione (Figura 1A). Rimuovere con cautela l'E3 rimanente con una micropipetta.
3. Aggiungere la prima soluzione agarose al piccolo pozzo creato dal vetro di copertura attaccato alla parte inferiore del piatto per coprire l'embrione (Layer 1) (Figura 1B). Assicurarsi che l'agarose copra il piccolo pozzo, ma non lo trabocca.
4. Coprire il piccolo pozzo con un vetro di copertura (22 mm x 22 mm) (Figura 1C) per creare uno spazio stretto riempito agarose con l'embrione tra i due bicchieri di copertura.
5. Posizionare uno strato di 1% soluzione agarose sopra il vetro di copertura su tutto il fondo del piatto (Strato 2) (Figura 1D). Come questo strato si solidifica, tiene il vetro di copertura in posizione.
6. Riempire la porzione rimanente del piatto con E3 contenente 0.02% Tricaine per mantenere il sistema idratato (Layer 3) (Figura 1E).
   NOTA: In questa configurazione, il vetro di copertura e l'1% di agarose proteggono lo strato inferiore da essere diluito.

5. Ottimizzazione della soluzione agarose per il livello 1

1. Per identificare la concentrazione ottimale di agarose per il livello 1, utilizzare un approccio di ricerca della griglia multiscala. Montare embrioni in concentrazioni crescenti di agarose che vanno dallo 0,01% all'1%, seguiti dall'imaging time-lapse della restrizione della crescita dell'embrione e della motilità nel campo visivo. Identificare le concentrazioni in cui sia la distorsione che la motilità sono al minimo.
2. Per ottimizzare ulteriormente la concentrazione di agarose, montare ulteriormente gli embrioni utilizzando una gamma più fine di concentrazioni di agarose (ad esempio, tra 0,025 e 0,040% agarose) a seconda della concentrazione che si trova al meglio nel passaggio 5.1 (ad esempio, 0,025%, 0,028%, 0,031%, ecc.).
   NOTA: Nel nostro laboratorio, la concentrazione ottimale di agarose era di circa lo 0,03%.

6. Immagini time-lapse

NOTA: Questo metodo di montaggio funziona per qualsiasi microscopio invertito con funzionalità time-lapse per la fluorescenza e l'imaging sul campo luminoso.

1. Eseguire l'imaging time-lapse per l'intero embrione o parti di esso fino a 55 h. Per l'imaging di diversi embrioni, utilizzare un adattatore di fase che contiene diversi piatti con un embrione montato per piatto. Ruotare i piatti uno per uno in modo che gli embrioni siano posizionati approssimativamente orizzontalmente come determinato dall'occhio. Per una crescita e uno sviluppo ottimali dell'embrione, utilizzare uno stadio al microscopio con un'incubatrice fissata a 28,5 gradi centigradi.
2. Selezionare un obiettivo di ingrandimento basso nel software del microscopio. Sotto il pezzo dell'occhio, individuare e allineare finemente gli embrioni orizzontalmente ruotando i piatti utilizzando l'illuminazione del campo luminoso e registrare le loro posizioni nel software. Creare un nome file per il salvataggio automatico dei dati.
   NOTA: In questo esperimento, per registrare le posizioni degli embrioni sono stati utilizzati un piano apolmente 4x 0,2 NA obiettivo e la scheda XY all'interno della finestra di acquisizione ND. I dati sono stati salvati in formato .nd2. L'obiettivo è stato selezionato facendo clic sulle sue icone nella scheda Ti Pad.
3. Impostare le dimensioni del foro stenopeico, la velocità di scansione, le dimensioni dell'immagine e lo zoom. Selezionare quindi un obiettivo di ingrandimento superiore per l'acquisizione delle immagini.
   NOTA: In questo esperimento, è stato utilizzato un obiettivo plan-apo 10x 0.45 NA per l'imaging di embrioni interi, e un obiettivo super-fluor 20x 0,75 NA è stato utilizzato per la successiva creazione di ingrandimento di parti dell'embrione. Il foro stenopeico è stato impostato su 1,2 UA (19,2 m per l'obiettivo 10x), la velocità di scansione è stata impostata per un tempo di permane in pixel di 2,4 s e la dimensione dell'immagine è stata impostata su 1024 x 1024 pixel con uno zoom di scansione di uno, dando una dimensione in pixel di 1,24 m per l'obiettivo 10x e l'obiettivo 10x e l'obiettivo 10x e l'obiettivo 10x e l'obiettivo 10x e l'obiettivo 10x e l'obiettivo 10x 0,62 m per la lente 20x.
4. Selezionare i canali per la fluorescenza da immagine. Regolare le impostazioni di acquisizione dell'immagine un canale alla volta. Per ogni canale di fluorescenza regolare la potenza del laser e il rivelatore ad alta tensione, assicurandosi di raccogliere la migliore gamma dinamica possibile, evitando la saturazione e limitando il fotosbiancamento.
   NOTA: in questo esperimento, GFP è stato immaginato con il canale verde 488 (488 nm laser ed emissione tra 500 e 550 nm) e RFP con il canale rosso 561 (561 nm lasered emissione tra 570 e 600 nm) e l'immagine di trasmissione è stata raccolta utilizzando il laser 561 nm e il rilevatore di luce trasmesso ( canaleTD ).
5. Per immaginare l'intero embrione con l'obiettivo 10x, immagini diversi campi visivi sovrapposti e cucinoli insieme utilizzando il software al microscopio.
   NOTA: Poiché gli embrioni cresceranno notevolmente durante l'imaging, assicurarsi che ci sia spazio nel campo visivo anteriore e posteriore all'embrione. Utilizzare la scheda Scansione immagine grande della finestra di acquisizione ND e selezionare un motivo 4 x 1 con sovrapposizione del 10% per acquisire quattro campi di visualizzazione adiacenti.
6. Configurare le impostazioni per l'acquisizione degli stack z utilizzando il software del microscopio.
   NOTA: Poiché l'embrione è montato vicino al fondo della teglia di vetro, il suo centro si allontanerà dal fondo man mano che cresce. Utilizzare la scheda , della finestra di acquisizione ND e selezionare l'intervallo relativo asimmetrico. Con questo metodo, il piano di messa a fuoco corrente viene utilizzato come piano di riferimento e il resto dei piani sono distribuiti in modo asimmetrico sopra e sotto per includere l'intero embrione all'interno del volume di stack z, con spazio sufficiente per tenere conto della crescita del campione. In tutti gli esperimenti, l'intervallo è stato impostato su 11 m e l'intervallo totale a circa 45 piani.
7. Al fine di mantenere l'attenzione di più embrioni durante l'imaging time-lapse a lungo termine, utilizzare un focus automatizzato. Se si immaginano più embrioni, regolare i singoli livelli di offset per ogni embrione in modo che si concentri sul piano di riferimento.
   NOTA: In questo esperimento, è stato utilizzato un sistema di stabilizzazione dello stato attivo basato su laser.
8. Impostare i parametri time-lapse nel software e nell'immagine del microscopio per una durata di 55 h a intervalli di circa 1 h. Ad ogni ciclo, acquisire due set di dati embrionali in sequenza e salvare automaticamente i dati dopo ogni ciclo.
9. Elaborare le immagini utilizzando una versione on-line o off-line del software al microscopio. Se è stato immaginato più di un embrione, creare file indipendenti per ogni embrione dividendo il set di dati in base alla posizione dell'imaging. Utilizzare proiezioni di intensità massima o uno strumento simile per convertire i set di dati temporali 3D in set di dati temporali 2D. Creare file di filmato utilizzando l'opzione di menu Salva con nome, selezionando .avi come formato di file. Selezionare l'opzione Nessuna compressione con intervalli di 200 ms per una velocità di riproduzione di 5 fotogrammi /s.
   NOTA: Il set di dati originale di due embrioni in questo esperimento è stato suddiviso utilizzando la funzione Split locations nel software (File Metodo di importazione/esportazione Dividere Multipunti). I set di dati temporali 3D sono stati convertiti in set di dati temporali 2D utilizzando la funzione di proiezione Intensità massima (Immagine Elaborazione ND Creazione di un'immagine di proiezione di intensità massima in .

Risultati

Sviluppo del metodo di montaggio
L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di sviluppare una tecnica di montaggio a basso costo per l'imaging time-lapse dello sviluppo del pesce zebra per lunghi periodi di tempo. Il metodo di montaggio a strati è stato sviluppato per consentire la piena crescita del fragile corpo embrionale di pesce zebra, limitando al contempo i suoi movimenti. Se la concentrazione di agarose dello strato 1 è troppo alta, gli embrioni diventeranno distorti e curvi (

Discussione

Un metodo di montaggio per la microscopia confocale time-lapse estesa di embrioni interi di pesci zebra è descritto qui. Il passo più critico per il metodo di montaggio è quello di identificare la concentrazione ottimale di agarose che permetterà la crescita senza restrizioni dell'embrione di pesce zebra e allo stesso tempo mantenere gli embrioni in una posizione completamente fissa per l'imaging confocale. Poiché la concentrazione ottimale di agarose è molto stretta, questo valore è molto sensibile agli errori di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software