Un metodo rivisto per indurre il linfomal secondario nell'Hindlimb dei topi

Riepilogo

Questo modello animale consente ai ricercatori di indurre linfedema secondario statisticamente significativo nell'arto posteriore dei topi, della durata di almeno 8 settimane. Il modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia del linfedema e per studiare nuove opzioni di trattamento.

Abstract

I modelli animali sono di fondamentale importanza nella ricerca del linfedema per comprendere la fisiopatologia della malattia, ma anche per esplorare le potenziali opzioni di trattamento. Questo modello murino consente ai ricercatori di indurre linfedema significativo della durata di almeno 8 settimane. Il linfodatama viene indotto utilizzando una combinazione di radioterapia frazionata e ablazione chirurgica dei linfatici. Questo modello richiede che i topi ottono una dose di radiazioni da 10 Gray (Gy) prima e dopo l'intervento chirurgico. La parte chirurgica del modello prevede la legatura di tre linfatici e l'estrazione di due linfonodi dall'arto posteriore del topo. Avere accesso a strumenti microchirurgici e un microscopio è essenziale, a causa delle piccole strutture anatomiche dei topi. Il vantaggio di questo modello è che si traduce in linfedema statisticamente significativo, che fornisce una buona base per valutare diverse opzioni di trattamento. È anche una grande e facilmente disponibile opzione per l'allenamento microchirurgico. La limitazione di questo modello è che la procedura può richiedere molto tempo, soprattutto se non praticata in anticipo. Il modello si traduce in linfedema oggettivamente quantificabile nei topi, senza causare grave morbilità ed è stato testato in tre progetti separati.

Introduzione

Il linfedema è caratterizzato da un accumulo di fluido linfatico che porta al gonfiore del tessuto localizzato, che si verifica principalmente a causa di un flusso alterato o interrotto del fluido linfatico nei vasi linfatici¹. Il flusso linfatico può essere alterato o interrotto da infezione, ostruzione, lesioni o difetti congeniti nel sistema linfatico². Queste eziologie provocano l'accumulo di liquido linfatico, che porta ad uno stato cronico di infiammazione, con conseguente successiva fibrosi, così come la deposizione del tessuto adiposo³. Il linfedema può essere classificato come linfedema primario o secondario. Il linfedema primario è causato da anomalie dello sviluppo o^mutazionegenetica 2^,4. Linfedema secondario si verifica a causa della malattia sistemica sottostante, chirurgia o trauma^2,4. Il linfedema secondario è la forma più comune di linfedema nel mondo². Nei paesi sviluppati, la causa più comune del linfedema secondario è la terapia oncologica come la radioterapia adiuvante e la dissezione dei linfonodi⁵. Il linfedema è più frequente tra i pazienti affetti da cancro al seno, ma può anche svilupparsi in pazienti con ginecologia, melanoma, cancro genitourinario o al collo⁶. È stato suggerito che su tutte le donne diagnosticate con cancro al seno, il 21% svilupperà il linfedema⁷.

Il linfodema può essere stressante per il paziente sia fisicamente che psicologicamente. I pazienti con linfedema hanno un aumentato rischio di infezione^5,8,9, scarsa qualità della vita e possono sviluppare ansia sociale e sintomi di depressione¹⁰. Le complicazioni del linfedema cronico portano ad un alto costo delle cure e ad un aumento del carico di malattia^9,11. I risultati hanno anche suggerito che il linfedema potrebbe essere associato ad un aumento del rischio di morte dopo il trattamento del cancro al seno¹². La gestione conservativa come la compressione dell'area interessata, il drenaggio manuale della linfa e la cura generale della pelle rimangono il primo approccio di linea. Attualmente non esiste un trattamento curativo⁶. Anche se sono stati fatti progressi nel campo della terapia chirurgica e medica, c'è ancora spazio per migliorare. Sono necessarie ulteriori ricerche, che forniscono informazioni sulla fisiopatologia e la progressione della malattia, per consentire ai medici di fornire migliori opzioni di trattamento per i pazienti⁵.

I modelli animali vengono utilizzati nella ricerca preclinica per comprendere la fisiopatologia delle malattie e sviluppare potenziali opzioni di trattamento. Diversi modelli animali di linfedema sono stati stabiliti in canini^13,14, conigli¹⁵, pecore¹⁶, maiali^17,18 e roditori^{19,20, 21,22,23,24}. Il modello dei roditori sembra essere il modello più conveniente, quando si studia la ricostruzione della funzione linfatica, a causa della facilità accessibili dei roditori e relativamente a basso prezzo²⁵. La maggior parte dei modelli di topi si sono concentrati sull'indurre linfedema nella coda dei topi^21,22,23. Il modello di coda è molto affidabile, ma l'esatta tecnica chirurgica per indurre il linfedema varia in modo significativo nel materiale pubblicato in precedenza. Ciò si traduce in fluttuazioni di durata e robustezza del linfedema sviluppato presentato in litterature noto²⁵. Diverse tecniche vengono utilizzate anche per indurre linfedema nel modello dell'arto posteriore e producono anche risultati variabili, ma il modello dell'arto posteriore potrebbe essere più facile da capire da una prospettiva traslazionale. Precedenti modelli di linfedema sono stati ostacolati dalla risoluzione spontanea del linfedema e quindi è necessario un modello di linfedema riproducibile e permanente²⁵. I ricercatori hanno già cercato di aumentare la dose di radiazioni, per prevenire la risoluzione spontanea del linfedema, ma questo ha spesso portato a successiva grave morbilità²⁵.

Questo modello si traduce in linfedema statisticamente significativo, senza causare grave morbilità, combinando microchirurgia con radiazioni. Il modello è stato rivisto da un precedente modello chirurgico aggiungendo una dose di irradiazione che induce il linfedema, senza causare grave morbilità²⁶. Offre anche una grande opportunità per l'allenamento microchirurgico. Avere accesso a apparecchiature microchirurgiche e un microscopio è necessario, a causa delle piccole strutture anatomiche dei topi. La procedura chirurgica può essere eseguita quando all'utente sono state insegnate tecniche microchirurgiche di base, come la sutura con strumenti microchirurgici. Gli operatori che hanno eseguito questa procedura tutti guardato video tutorial da Acland sui presupposti di abilità microchirurgiche (1981) e tecnica di microsutura di base (1985). Si consiglia di praticare la procedura chirurgica 8-10 volte prima di utilizzarlo nella ricerca. La pratica della procedura garantisce che vengano commessi meno errori e che la procedura possa essere eseguita in modo più efficiente. Quando masterizzato, la procedura chirurgica può essere eseguita in 45 minuti.

Protocollo

Gli animali erano ospitati presso l'University of Southern Denmark Animal Care Facility secondo le linee guida istituzionali. Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Ispettorato per gli esperimenti sugli animali, dal Ministero dell'Ambiente e degli alimenti della Danimarca.

1. Irradiazione pre-operatoria

NOTA: L'irradiazione pre-chirurgica avviene 7 giorni prima dell'intervento chirurgico.

1. Indurre l'anestesia.
   1. Posizionare il topo in una scatola di induzione e impostare il vaporizzatore al 3% isoflurane con una portata di ossigeno di 0,8-1,2 L/min per indurre l'anestesia di inalazione.
      NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare anestetici iniettabili, ma per la breve durata dell'irradiazione dell'irradiazione di anestesia era sufficiente. Per ottenere i risultati presentati in questo articolo, 9 settimane vecchia femmina C57BL6 topi sono stati utilizzati.
   2. Assicurarsi che il mouse sia completamente aerato dal test di pizzico della coda o della zampa.
2. Posizionare il mouse per l'irradiazione.
   1. Se completamente sedato, spostare il mouse dalla scatola di induzione e posizionarlo sotto la fonte di radiazione in posizione supina e fissare delicatamente gli arti posteriori con nastro adesivo.
      NOTA: Il mouse rimarrà sedato per la breve durata della radiazione.
   2. Posizionare un cuscinetto di piombo spesso 1,5 mm per garantire che venga irradiata solo l'area che subisce un intervento chirurgico (ad esempio, l'area circolare con un diametro di 25 mm intorno al ginocchio).
3. Somministrare una dose di 10 Gy radiazioni ad un tasso di dose di 5.11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
   AVVISO: le precauzioni di sicurezza devono essere prese quando si lavora con le radiazioni. Durante questo esperimento, tutta l'irradiazione è stata eseguita in una stanza isolata dalle radiazioni, e la fonte di radiazioni è stata accesa solo quando tutto il personale aveva lasciato e sigillato la stanza.
4. Posizionare il mouse nella sua gabbia.

2. Configurazione dell'attrezzatura

NOTA: La chirurgia deve essere eseguita in una stanza dedicata alle procedure chirurgiche. La superficie operativa deve essere sterile.

1. Pulire accuratamente tutte le superfici operative con il 70% di etanolo. Indossare rete per capelli e coperture. Utilizzare strumenti chirurgici sterili e guanti sterili.
2. Preparare l'anestesia.
   1. Redigere 1 mL di fentanil (0,315 mg/mL), 1 mL di midazolam (5 mg/mL) e 2 mL di acqua sterile. Utilizzare siringhe e aghi diversi per i diversi componenti.
   2. Mescolare il fentanil e l'acqua sterile svuotando lentamente le siringhe in un tubo di vetro sterile. Se miscelato, aggiungere midazolam per completare la soluzione di lavoro.
3. Preparare l'analgesia.
   1. Disegnare 0,2 mL di buprenorfina (0,3 mg/mL) e 2 mL di salina.
   2. Mescolare i volumi svuotando lentamente le siringhe in un tubo di vetro sterile per completare la soluzione di lavoro.
4. Accendere il microscopio e assicurarsi che l'illuminazione sia sufficiente e che il microscopio sia ben regolato per gli occhi dell'operatore.
   NOTA: Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite al microscopio operativo. È sufficiente un intervallo di ingrandimento che va da 4x-25x.

3. Preparazione

1. Pesare il mouse prima dell'intervento posizionando il mouse in un contenitore vuoto su una scala cancellata.
2. Amministrare l'anestetico.
   1. Disegnare 0,1 mL di anestetico per 10 g di peso corporeo del topo. Iniettare l'anestetico sottocutaneo come iniezione di bolus.
   2. Lasciate riposare il topo in una gabbia con abbondante biancheria da letto e riparo per circa 10 min fino a quando completamente sedato. Esaminare la profondità anestetica valutando il rilassamento muscolare ed eseguire il test del pizzico della zampa o della coda.
3. Quando è completamente sedato, radere l'arto posteriore scelto per la procedura utilizzando clipper elettrici. Assicurarsi di pulire i capelli in eccesso.
4. Accendere il dispositivo di riscaldamento, ad esempio una piastra di riscaldamento e coprirlo con un panno chirurgico.
5. Impostare il flusso di ossigeno a 0,8 L/min e collegarlo con un nosecone. Utilizzare ossigeno al 100%.
   NOTA: Il nosecone è solo per la consegna di ossigeno e non l'anestesia.
6. Applicare unguento oftalmico e iniettare 0,5 mL di sottocutanea salina, preferibilmente nella mischia del topo, per prevenire l'ipovolemia durante l'intervento chirurgico.
7. Posizionare il mouse per l'intervento chirurgico.
   1. Posizionare il mouse sul panno chirurgico in posizione supina. Posizionare il naso sul muso.
   2. Fissare delicatamente l'estremità degli arti posteriori con del nastro adesivo per evitare che il mouse si sposti durante l'intervento chirurgico.
   3. Sterilizzare la pelle con alcool / clorhexidine o alcol / iodio povidone.

4. Chirurgia

NOTA: In questo esempio, l'arto posteriore sinistro (quando il mouse è visualizzato in posizione supina), è stato scelto per la procedura.

1. Fare un'incisione circolare.
   1. Sollevare la pelle con pinze lisce e tagliare una piccola apertura di circa 5 mm proximal alla fossa popliteal.
   2. Far scorrere le forbici affilate nell'apertura e tagliare verso il ginocchio in modo che l'incisione termina appena sopra il ginocchio. Assicurarsi di non forare i vasi sottostanti sollevando la pelle con pinze durante il clipping.
   3. Spostare il mouse in posizione prona e continuare a tagliare dal ginocchio verso la fossa popliteale fino a quando l'incisione circonferenziale è completa.
2. Dissezionare la pelle sotto il ginocchio.
   1. Sezionate delicatamente l'area sotto il ginocchio a un paio di millimetri sopra la caviglia, aprendo e chiudendo lentamente i microscistori sollevando la pelle con pinze.
   2. Tagliare con attenzione le restanti aderesi visibili utilizzando microscissors. Utilizzare regolarmente salina sterile per mantenere il tessuto umido durante l'intera procedura.
3. Dissezionare la pelle sul bordo prossimale dell'incisione cirferenziale in modo che possa essere ritratta con un retrattore elastico.
   NOTA: Il retrattore consente all'operatore una migliore visione del recipiente linfoentico prossimale e impedisce al bordo prossimale di spostarsi durante l'intervento chirurgico.
4. Mentre è ancora in posizione prona, ruotare delicatamente l'arto posteriore e fissarlo con del nastro adesivo, in modo che la vena ischiatica sia visibile dal punto più prossimale dell'area esposta al punto più distale.
5. Iniettare circa 0,01 mL di Brevetto Blu V sottocutaneamente tra il secondo e il terzo dito utilizzando una siringa da 0,5 mL con un ago da 30 G. Premere delicatamente la zampa un paio di volte per distribuire il Brevetto Blu V. Visualizzare i vasi linfatici e il linfonodo al microscopio mentre il Brevetto Blu V riempie i vasi linfatici.
   NOTA: Se il colore blu dei vasi linfatici svanisce durante la procedura, massaggiare delicatamente la zampa per promuovere l'assorbimento, anziché iniettare più Brevetto Blu V. L'uso in eccesso di Brevetto Blu V può causare perdite e colorazione del tessuto che circonda i compromettere la procedura.
6. Individuare le strutture importanti: il linfonodo popliteale (PLN), i due vasi linfatici dissitale al linfonodo (DLV1 e DLV2), e l'unico vaso lincido proscisiale al linfonodo (PLV).
   NOTA: Tutti i vasi linfatici si trovano adiacente alla vena ischiatica. Il recipiente lincido prossimale si trova di solito mediale alla vena, i due vasi linfatici distali si trovano mediali e laterali alla vena. Le abbreviazioni delle strutture sono utilizzate nel video di accompagnamento.
7. Ingrandisci per visualizzare chiaramente il PLV e legialo con una sutura in nylon 10-0 utilizzando il supporto micro-ago e le microforza. Premere la zampa un paio di volte per assicurarsi che nessun Brevetto Blu V passi prossimaalla alla sutura.
   NOTA: Potrebbe essere necessario tagliare il grasso che circonda il vaso linfatico.
8. Ripetere il passo 4.7 per legarsi i due vasi linfatici distale. Premere più volte la zampa per assicurarsi che nessun Brevetto Blu V passi prossima alla legatura. Se i vasi linfatici si trovano vicino alla vena ischiatica, prova a sezionare ancora distally.
   NOTA: In questo esempio, si può vedere che uno dei vasi linfatici scoppia a causa della legatura che ostacola il flusso linfatico. I vasi linfatici spesso si dividono dalla vena più in basso.
9. Rimuovere il linfonodo popliteale.
   1. Individuare il linfonodo popliteale e ritagliare un piccolo foro con microscissors per accedervi e rimuoverlo con microforcep e microscisors.
      NOTA: Il linfonodo ha una superficie liscia simile a una perla in contrasto con il tessuto adiposo circostante.
   2. Per verificare se il tessuto rimosso è un linfonodo, metterlo in una provetta piena d'acqua.
      NOTA: Se il tessuto è costituito da grasso, il tessuto galleggia. Se il tessuto è un linfonodo, affonderà sul fondo.
10. Rimuovere il cuscinetto inguinale e il linfonodo.
    1. Prima di rimuovere il cuscinetto inguinale, utilizzare un coagulatore bipolare per cauterizzare i vasi che attraversano il grasso.
    2. Riseguitare il cuscinetto di grasso inguinale utilizzando microforcep e microscissors. Agganciare delicatamente i vasi cauterizzati che attraversano il grasso. Quindi resect delicatamente il tessuto adiposo nella zona inguinale.
       NOTA: Il linfonodo situato nel grasso è raramente colorato da Brevetto Blu V e può essere difficile da distinguere dal grasso. Rimuovere il cuscinetto di grasso in un unico pezzo è il modo migliore per garantire che il linfonodo sia stato rimosso.
11. Sciacquare accuratamente la gamba con una salina sterile e confermare attraverso il microscopio che eventuali piccoli peli e particelle sono stati accuratamente rimossi dall'area chirurgica per evitare la contaminazione e l'infezione della ferita. Assicurarsi che non vi sia alcunsanguinamento attivo.
12. Suturare i bordi della pelle fino alla facia muscolare con una sutura di nylon 6-0 utilizzando pinze e porta aghi, lasciando uno spazio di 2/3 mm per vincolare il flusso linfatico superficiale.
    NOTA: Il video di accompagnamento mostra un esempio di suture finite.
13. Amministrare l'analgesia. Disegnare 0,1 mL di analgesia per 30 g di peso corporeo del topo. Iniettare l'analgesia sottocutaneamente come iniezione di bolus.
14. Pesare il mouse per post-chirurgia per il confronto.
15. Posizionare il mouse in una gabbia in un armadio riscaldato per il recupero.

5. Assistenza postoperatoria

1. Dare ai topi singole gabbie per recuperare dopo l'intervento chirurgico con acqua e cibo ad libitum.
2. Somministrare una dose sottocutanea bolus di 0,02 mL di buprenorphine 3x al giorno per 3 giorni per l'analgesia.
3. Monitorare l'animale ogni giorno per un'adeguata guarigione delle ferite, segni di dolore e infezione. Se sono presenti segni di infezione, utilizzare unguento antibiotico.

6. Irradiazione post-operatoria

1. Tre giorni dopo l'intervento chirurgico, ripetere la procedura per l'irradiazione pre-chirurgia (passaggi 1.1.4.4).

Risultati

Questa procedura è stata precedentemente utilizzata in tre esperimenti separati. Tutti gli esperimenti sono stati fatti da diversi ricercatori principali che sono tutti co-autori di questo articolo. In tutti e tre gli esperimenti, è stata prestata molta attenzione ad aderire alla stessa procedura descritta in questo protocollo. In tutti e tre gli esperimenti, il linfedema secondario è stato indotto in un arto posteriore, mentre l'altro limbh posteriore fungeva da controllo. I volumi de...

Discussione

Ci sono alcuni passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, è importante che i ricercatori prendano precauzioni di sicurezza quando lavorano con la radioattività. In secondo luogo, durante la parte chirurgica di questo protocollo, è importante iniziare la procedura una volta che il mouse è stato anetizzato e finirlo senza interruzioni inutili. Questo è importante per evitare un periodo chirurgico eccessivamente lungo per l'animale e per evitare che l'anestesia perda effetto durante l'intervento chirurgico....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture - Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator - ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer - PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder - Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V - 25 mg/ml	Guerbet
Scissors - Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation - D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment - viscotears	Bausch & Lomb