Metodo ad alta velocità effettiva per la misurazione del tempo di sedazione alcolica del melanogaster di Drosophila individuale

Riepilogo

Gli attuali metodi per misurare la sensibilità all'alcol nella Drosophila sono progettati per testare gruppi di mosche. Vi presentiamo un semplice, a basso costo, ad alto costo di analisi per valutare la sensibilità di sedazione di alcol in un gran numero di mosche singole. Il metodo non richiede strumenti specializzati e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio utilizzando materiali comuni.

Abstract

La Drosophila melanogaster fornisce un ottimo modello per studiare le basi genetiche della sensibilità alcolica. A differenza degli studi condotti nelle popolazioni umane, il modello della Drosophila consente un rigoroso controllo sul background genetico, e un numero praticamente illimitato di individui dello stesso genotipo può essere allevato rapidamente in condizioni ambientali ben controllate senza restrizioni normative e a costi relativamente bassi. Le mosche esposte all'etanolo subiscono cambiamenti fisiologici e comportamentali che assomigliano all'intossicazione da alcol umano, compresa la perdita di controllo posturale, la sedazione e lo sviluppo della tolleranza. Qui, descriviamo un semplice, basso costo, ad alto costo saggio saggio per valutare la sensibilità di sedazione di alcol in un gran numero di mosche singole. Il saggio si basa sulla registrazione video di mosche singole introdotte senza anestesia in piastre di coltura cellulare a 24 pozzi in un set-up che consente l'avvio sincrono dell'esposizione all'alcol. Il sistema consente a una singola persona di raccogliere dati di sedazione di etanolo individuali su un terreno di lavoro di ben 2.000 mosche. Il saggio può, in linea di principio, essere esteso per valutare gli effetti dell'esposizione a qualsiasi sostanza volatile e applicato per misurare gli effetti della tossicità acuta di sostanze volatili su altri insetti, comprese altre specie di mosca.

Introduzione

Il National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism riferisce che nel 2015 il consumo eccessivo di alcol, designato come "disordine di consumo di alcol", ha colpito circa 16 milioni di persone negli Stati Uniti. L'abuso di alcol provoca una vasta gamma di effetti fisiologici avversi ed è una delle principali cause di morte negli Stati Uniti. Negli esseri umani, diminuzione della sensibilità, o un basso livello di risposta all'alcol, ha¹una forte componente genetica ed è associato a un rischio maggiore di sviluppare disturbi da alcol 1^,2,3.4 Gli studi sul rischio genetico sulle popolazioni umane sono impegnativi a causa dell'incomlsione della popolazione, delle diverse storie di sviluppo e delle esposizioni ambientali e della dipendenza da questionari auto-riportati per quantificare i fenotipi correlati all'alcol, spesso confusi con altre condizioni neuropsichiatriche.

La Drosophila melanogaster fornisce un ottimo modello per studiare le basi genetiche della sensibilità alcolica^5,6,7,8. Il modello della Drosophila consente un rigoroso controllo sul background genetico, e un numero praticamente illimitato di individui dello stesso genotipo può essere allevato rapidamente in condizioni ambientali ben controllate senza restrizioni normative e a costi relativamente bassi. Oltre alle mutazioni pubblicamente disponibili e alle linee RNAi che si rivolgono alla maggior parte dei geni nel genoma, la disponibilità del pannello di riferimento genetico della Drosophila melanogaster (DGRP), una popolazione di 205 linee derivate selvatiche con sequenze complete del genoma, ha permesso studi di associazione a livello di genoma^9,10. Tali studi hanno identificato reti genetiche associate agli effetti sui tempi di sviluppo e sulla fattibilità dopo l'esposizione allo sviluppo all'etanolo^11,12. La conservazione evolutiva dei processi biologici fondamentali consente di trarre deduzioni traslazionali sovrapponendo gli ortologhi umani alle loro controparti di mosca.

Le mosche esposte all'etanolo subiscono cambiamenti fisiologici e comportamentali che assomigliano all'intossicazione da alcol umana, compresa la perdita di controllo posturale⁸, sedazione e sviluppo della tolleranza^13,14,15. La sedazione indotta dall'alcol nella Drosophila può essere quantificata utilizzando inebriometri. Si tratta di colonne di vetro verticali lunghe 122 cm con partizioni a rete inclinate a cui le mosche possono attaccare^16,17,18. Un gruppo di almeno 50 mosche (i sessi possono essere analizzati separatamente) vengono introdotti nella parte superiore della colonna ed esposti a vapori di etanolo. Le mosche che perdono il controllo posturale cadono attraverso la colonna e vengono raccolte a intervalli di 1 min. Il tempo medio di eluizione serve come misura di sensibilità all'intossicazione da alcol. Quando le mosche sono esposte all'alcol una seconda volta dopo il recupero dalla prima esposizione, possono sviluppare tolleranza, come evidente da un cambiamento nel tempo medio di eluizione^13,15^,1919,20. Mentre i saggi inebriometri hanno portato all'identificazione di geni, reti genetiche e vie cellulari associate alla sensibilità alla sedazione di alcol e allo sviluppo della tolleranza^12,13,14,21, il saggio richiede tempo, basso throughput e inefficace per misurare la sensibilità all'alcol nei singoli moscerini.

I saggi alternativi di sedazione di etanolo che non richiedono l'elaborata configurazione dell'inebriometro consentono misurazioni più convenienti ma sono ancora limitati nella produzione e generalmente richiedono analisi di gruppi di mosche piuttosto che di individui^21,22,23^,24,25.²⁵ La valutazione di singole mosche riduce al minimo il potenziale di effetti di confusione dovuti a interazioni di gruppo, come quelle derivanti da comportamenti sociali. Qui, presentiamo un semplice, basso costo, ad alto costo di analisi per valutare la sensibilità di sedazione di alcol in un gran numero di mosche singole.

Protocollo

1. Costruzione dell'apparato di prova

1. Creare un modello di cartone delle dimensioni di una piastra di coltura cellulare 24-well tracciando intorno alla piastra su cartone e tagliando l'area designata.
2. Tagliare un pezzo di piccola maglia dello schermo di insetti delle dimensioni della piastra di coltura cellulare utilizzando il modello di cartone dal passaggio 1.1.
3. Preparare una piastra di coltura cellulare 24-ben mettendo una piccola linea di colla a caldo intorno al perimetro della parte superiore della piastra utilizzando una pistola a colla calda e apponendo la maglia dello schermo sulla parte superiore dei pozzi aperti.
4. Fissare un bastone artigianale di legno a ciascuno dei tre lati della stessa piastra di coltura cellulare dal passo 1.3 utilizzando una pistola a colla calda. La piastra di coltura cellulare modificata dovrebbe ora assomigliare al diagramma della piastra illustrato nella Figura 1A e alla configurazione sperimentale illustrata nella Figura 2.
   NOTA: Preparare almeno il numero di piastre di coltura cellulare che si adattano alle camere di ripresa (vedi sotto).

Figura 1: Diagramma dell'apparato di prova e della camera di ripresa. (A) Diagrammi superiori. Vengono visualizzate rispettivamente le viste superiore, laterale e anteriore dell'apparato di prova. Una rete dello schermo si dispone piatta su una piastra di coltura cellulare di 24 pozze. I bastoncini artigianali in legno, rappresentati dalle punte di freccia, sono attaccati a tre lati adiacenti per la stabilità e l'aiuto di allineamento, due sul lato della piastra del pozzo con sei pozzetti e uno sul lato della piastra con quattro pozzetti. Tutti gli accessori sono incollati a caldo sull'apparecchio. (B) Diagrammi inferiori. Vengono visualizzate rispettivamente le viste superiore, laterale e anteriore del set-up del saggio. Una scivolata viene tagliata nella parte destra della scatola, dall'apertura del coperchio alla parte posteriore dell'apertura, con la parte inferiore del livello di taglio alla superficie interna. Il foro sulla parte superiore della scatola, la superficie parallela al suolo, è centrato per la massima esposizione video. La casella ombreggiata rappresenta la videocamera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fotografia del sistema di assaggio. La videocamera è posizionata sopra la camera di polistirolo, con l'obiettivo inserito nel foro di ritaglio, illustrato nei diagrammi della figura 1B. Due serie di piastre di coltura cellulare 24-well modificate poggiano su un tampone di illuminazione che viene inserito in una screpolatura attraverso il lato della camera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Costruzione della camera di ripresa

1. Creare una camera di ripresa tagliando un foro delle dimensioni dell'obiettivo della videocamera sul lato di una scatola di polistirolo. Tagliare una tagliata di taglio aggiuntiva la larghezza del pad di illuminazione sul lato opposto della scatola di polistirolo. La camera di ripresa dovrebbe assomigliare alla camera di ripresa mostrata in Figura 1B e Figura 2.
2. Preparare la camera di ripresa per l'uso inserendo il pad di illuminazione nella vetrina e posizionando la fotocamera nel foro dell'obiettivo sopra il pad di illuminazione.
3. Posizionare tutti i materiali ed eseguire tutti i test successivi in un ambiente controllato, preferibilmente una camera comportamentale con circa il 30% di umidità, temperatura di 25 gradi centigradi, flusso d'aria uniforme e livelli di rumore inferiori a 65 dB.

3. Preparazione dell'apparato di prova e delle mosche

1. Pipette 1 mL di 100% etanolo attraverso la maglia dello schermo in ogni pozzo.
2. Asciugare la rete dello schermo con un pezzo di garza.
3. Tagliare due pezzi di garza delle dimensioni della piastra di coltura cellulare utilizzando il modello di cartone creato nel passaggio 1.1. Posizionarli sopra la rete dello schermo asciutto della piastra di coltura cellulare modificata contenente etanolo dal punto 3.2.
4. Crea un piccolo pezzo di tagliere in plastica sottile e flessibile tracciando intorno al modello di cartone creato nel passaggio 1.1 come guida generale ed espandendo l'area tracciata di 1-2 cm su uno dei lati corti. Ritaglia l'area tracciata espansa dal tagliere in plastica sottile e flessibile. Dopo il taglio, assicurarsi che la plastica si adatti ancora tra i tre bastoncini di legno sull'apparato di prova, ma si blocca un'estremità di 1-2 cm.
5. (Facoltativo) Se è necessario creare un aspiratore, assemblare un aspiratore come quello illustrato nella Figura 3 tagliando prima una punta di pipetta P1000 a metà. Inserire il pezzo con un diametro maggiore in un'estremità di un pezzo di tubi flessibili da 30 cm da utilizzare come boccaglio.

Figura 3: Un aspiratore a mosca in cui le mosche vengono raccolte con un boccaglio intercambiabile attaccato a tubi flessibili e un'ampia pipetta sierologica di foro con un tappodi garza di cotone . L'operatore può aspirare una singola mosca nella pipetta per il trasferimento senza anestesia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. (Facoltativo) Per completare l'assemblaggio dell'aspiratore, coprire l'estremità larga di un pezzo di pipetta sierologica di 10 cm con garza per evitare che le mosche entrino nel tubo e inseriscano la pipetta, garza prima, nell'estremità aperta del tubo per fungere da camera di volo. L'aspiratore dovrebbe essere simile a quello illustrato nella figura 3.
7. Utilizzando un aspiratore (Figura 3, i passaggi 3.5 e 3.6), aspirare una mosca per bene in una piastra di coltura cellulare 24-well separata. Utilizzare la plastica flessibile per coprire eventuali pozzi contenenti mosche aspirate in precedenza. Registrare la posizione del pozzo e tutte le informazioni rilevanti sul genotipo o sul fenotipo di ogni mosca.
8. Tenere il filo di plastica flessibile con la parte superiore della piastra di coltura cellulare contenente le mosche per evitare la loro fuga e invertire la piastra sulla parte superiore della piastra di coltura cellulare modificata con l'etanolo. Il foglio di plastica flessibile dovrebbe essere appoggiato sui fogli di garza. Allineare la piastra di coltura cellulare invertita contenente mosche utilizzando i bastoncini artigianali per garantire che ogni bene con etanolo si allinei con ogni bene contenente una mosca.
9. L'installazione sperimentale dovrebbe essere simile Figura 2.

4. Test delle mosche

1. Assicurarsi che il pad di illuminazione sia illuminato a piena luminosità per il massimo contrasto visivo. Avviare la registrazione con la videocamera.
2. Per esporre le mosche all'etanolo, rimuovere con cura la plastica tra la piastra del pozzo e l'apparato di prova, facendo attenzione a non spostare la garza.
3. Terminare la registrazione video una volta che tutte le mosche hanno perso il controllo posturale. Una volta che si sospetta che tutte le mosche abbiano perso il controllo posturale, toccare saldamente al centro del piatto per garantire che tutte le mosche abbiano una perdita completa del controllo posturale. Se c'è movimento, continuare a registrare. Continuare a toccare periodicamente (ogni 1–2 min) fino a quando non si verifica alcun movimento.
4. (Facoltativo) Per recuperare rapidamente le mosche, rimuovere solo la piastra superiore dall'apparato di prova, rivelando mosche sedate appoggiate sulla garza. Aspirate individuale vola in contenitori scelti per il recupero.
5. Sostituire l'etanolo nelle piastre di coltura cellulare modificate con 1 mL di etanolo fresco 100% almeno 1 ora per controllare l'evaporazione e l'umidificazione dell'etanolo e mantenere un'esposizione costante all'etanolo in tutto il saggio. Asciugare la rete dello schermo con garza.
6. Ripetere l'operazione per tutti i campioni desiderati.
   NOTA: per la massima velocità effettiva, aspirare il prossimo round di mosche in nuove piastre di coltura cellulare durante la registrazione video. Il protocollo può essere messo in pausa qui, in quanto la registrazione video può essere rivista in un secondo momento.

5. Determinazione del tempo di sedazione a mosca

1. Registrare il tempo di sedazione per ogni singola mosca guardando la registrazione video. Il tempo di sedazione è definito come il momento in cui una mosca perde il controllo posturale completo e l'abilità locomotoria. Si consiglia di guardare il film al contrario e registrare il tempo in cui la mosca inizia a muoversi per garantire la precisione.

Risultati

Due piastre microtiteri di 24 pozzi potrebbero generare dati simultaneamente su 48 mosche individuali all'interno di appena 10 min. La tabella 1 elenca le misurazioni dei tempi di sedazione dell'etanolo per 48 mosche individuali, maschi e femmine separatamente, di due linee DGRP con sensibilità diverse all'esposizione all'alcol in tempi di sviluppo e redditivit๳. Le mosche delle RAL_555 di linea erano meno sensibili della linea RAL_177 (Figura 4, Tabella 2; p < 0.0001, ANOVA). I maschi e le femmine di RAL_177 non hanno mostrato alcun effetto sessualmente dimorfico (Figura 4, Tabella 2; p > 0,1, ANOVA), mentre le femmine di linea RAL_555 erano meno sensibili all'esposizione all'etanolo rispetto ai maschi ( Figura4, Tabella 2; p < 0,006, ANOVA). Il gran numero di mosche che possono essere misurate simultaneamente e la capacità di misurare contemporaneamente sessi e linee diverse possono aumentare la precisione riducendo l'errore a causa della variazione ambientale.

Un.	Tempo di sedazione dell'etanolo (s)						B.	Tempo di sedazione dell'etanolo (s)
	Femmine			Maschi				Femmine			Maschi
	414	365	477	423	568	309		937	742	622	460	331	498
	201	384	498	411	523	626		791	619	197	467	455	562
	228	364	333	440	403	267		504	744	513	570	582	506
	440	416	404	408	422	384		970	540	369	865	533	492
	888	283	285	322	369	287		595	550	606	392	544	345
	1079	519	315	393	376	284		418	709	553	308	477	388
	718	287	432	275	206	411		366	564	558	385	576	377
	598	337	398	279	631	372		437	692	578	460	511	412
	241	398	364	347	374	808		665	729	484	532	425	354
	229	423	534	386	396	628		312	576	305	334	531	506
	388	488	451	523	322	533		682	638	420	560	548	379
	252	529	375	427	330	540		1045	741	708	832	509	472
	674	401	303	401	307	311		394	675	381	477	449	784
	303	453	351	429	525	262		540	690	520	556	495	226
	258	483	302	389	562	319		356	615	336	454	524	590
	346	426	385	416	596	287		626	678	840	634	677	509

Tabella 1: Misurazioni dei tempi di sedazione dell'etanolo (s) delle singole mosche delle linee DGRP (A)RAL_177 e (B) RAL_555 per sessi separati ( n -48). Vedere anche tabella 2, Figura 4.

Figura 4: Tempi di sedazione alcolica delle linee DGRP RAL_177 e RAL_555. Le barre rappresentano i mezzi e le barre di errore SEM (n - 48). I tempi di sedazione per RAL_177 mosche erano inferiori a quelli delle mosche RAL_55 (p < 0.0001, ANOVA). I singoli punti dati sono indicati nella tabella 1. Ulteriori differenze statisticamente significative tra i sessi e le linee sono indicate nel testo e nella tabella 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi	Fonte di variazione	Df	Ss	Valore F	Valore P
Modello completo in pool	Linea	1	769627	34.869	<0.0001
	Sesso	1	105001	4.757	0.0304
	Linea x Sesso	1	86021	3.897	0.0498
	Errore	188	4149491
Femminili modello ridotto	Linea	1	685126	23.58	<0.0001
	Errore	94	2730718
Maschi modello ridotto	Linea	1	170522	11.3	0.0011
	Errore	94	1418774
modello ridotto RAL_177	Sesso	1	473	0.023	0.8800
	Errore	94	1943741
Modello ridotto RAL_555	Sesso	1	190549	8.12	0.0054
	Errore	94	2205751

Tabella 2: Analisi della varianza per il tempo disedazione attraverso il sesso e la linea DGRP. Il modello utilizzato era Y , S , L , S , LxS ,dove è la media generale, L è l'effetto fisso della linea DGRP (RAL_177, RAL_555), S è l'effetto fisso del sesso (maschio, femmina), LxS è il termine di interazione (fisso), e è il termine di errore. Per i modelli ridotti sono stati µ utilizzati i modelli Y , L e Y . S Line, Sex, and the Line x Sex interaction termine erano tutti significativi nel modello completo a < 0.05. I modelli ridotti per sesso e RAL_555 della linea DGRP sono stati significativi anche a z < 0.01. Vedere anche tabella 1, Figura 4. df - gradi di libertà, SS - Tipo I Somma dei quadrati.

Discussione

Qui, presentiamo un metodo semplice, economico e ad alto contenuto di velocità effettiva per valutare il tempo di sedazione a causa dell'esposizione all'etanolo in Drosophila melanogaster. A differenza di molti metodi attuali, che richiedono analisi di gruppo, questo saggio consente a una singola persona di raccogliere dati sul tempo di sedazione individuale per 2.000 dollari volano in un periodo di lavoro di 8 h. Abbiamo scoperto che una singola persona può segnare 48 mosche per il tempo di sedazione in circa 5 min. A questo ritmo, 2.000 mosche possono essere segnate in circa 4 h, anche se il punteggio può essere condotto in un secondo momento. Con il nostro saggio, il tempo di sedazione registrato per la maggior parte delle mosche varia da 5 a 15 min ad un'esposizione a 1 mL di 100% di etanolo. Concentrazioni più basse di etanolo o volumi di consegna più piccoli si tradurranno in tempi di sedazione più lunghi.

Gli attuali metodi per valutare il tempo di sedazione richiedono un test elevato di mosche senza abilitare facilmente le misurazioni su singoli individui^{15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. Molti attuali saggi di sedazione e sensibilità si basano su ST50^22,23,24, il momento in cui il 50% delle mosche sono sedati a causa dell'esposizione all'etanolo. Anche se ottenere la ST50 per gruppi di mosche non era la motivazione principale per lo sviluppo di questo saggio, le registrazioni video dimostrano una maggiore utilità rispetto ai metodi attuali, in quanto le registrazioni possono essere utilizzate per accertare la ST50 per gruppi di mosche testate individualmente e per misurare la percentuale di mosche che soddisfano un determinato criterio (ad esempio, perdita di controllo posturale) in qualsiasi momento. Va notato che tali analisi video richiederebbero più tempo.

A differenza degli attuali saggi inebriometrici, il metodo che descriviamo non richiede strumenti specializzati per l'installazione e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio utilizzando materiali comuni. Utilizzando questo metodo, abbiamo ottenuto tempi di sedazione affidabili e coerenti per le singole mosche. Il saggio può, in linea di principio, essere esteso per valutare gli effetti dell'esposizione a qualsiasi sostanza volatile. Il saggio può anche essere applicato per misurare gli effetti della tossicità acuta delle sostanze volatili su altri insetti, comprese altre specie di mosca. I dati sui singoli tempi di sedazione possono essere utilizzati per valutare l'entità della variazione fenotipica all'interno di una popolazione, come il DGRP.

Abbiamo usato piccole reti a schermo di insetti per impedire il contatto diretto con la soluzione di etanolo, consentendo al contempo quantità adeguate di vapori di etanolo per raggiungere la mosca. Lo strato di garza bianca sulla parte superiore della rete dello schermo fornisce un contrasto visivo tra la mosca e la superficie sottostante e assicura che le mosche non vengano catturate nella mesh dello schermo, il che potrebbe portare a una determinazione ambigua della perdita del controllo posturale. Le membrane disponibili in commercio che sono porose all'acqua e all'aria hanno dato risultati incoerenti e non erano sufficientemente penetrabili ai vapori di etanolo. Abbiamo usato intenzionalmente piccole reti di schermi di insetti perché è un materiale uniformemente poroso che riduce al minimo la variazione nell'esposizione all'etanolo a causa della posizione della mosca all'interno di un pozzo. È possibile apportare modifiche a questo protocollo sulla base di materiali disponibili, anche se si consiglia una camera comportamentale controllata, l'accesso al 90%-100% di etanolo vicino alla mosca e l'esposizione uniforme agli etanoli.

La posizione del volo all'interno delle piastre di coltura cellulare deve essere randomizzata tra le repliche per evitare distorsioni posizionali. Per esperimenti più grandi che richiedono l'uso di questo saggio in più giorni e sono quindi soggetti a variazioni ambientali che potrebbero influenzare i risultati di analisi (ad esempio, i cambiamenti nella pressione barometrica)²⁷, consigliamo vivamente che le mosche siano testate contemporaneamente ogni giorno e randomizzate sia all'interno che all'interno dei giorni, soprattutto se diverse linee e/o sessi devono essere confrontati l'uno con l'altro.

Il metodo che abbiamo sviluppato è più adatto per misurare l'effetto dell'esposizione acuta all'alcol, ma non è adatto per ottenere dati di consumo o modellare la dipendenza. I dati di sensibilità alla sedazione dell'alcol ottenuti da questo saggio possono tuttavia essere integrati con altre misure di fenotipi correlati all'alcol. Una limitazione del sistema è che l'altezza verticale delle piastre di coltura cellulare standard consente il movimento verticale della mosca che non può essere facilmente rintracciato tramite video per una valutazione dettagliata dell'attività complessiva o della locomozione. Tuttavia, questa limitazione non influisce sulla valutazione accurata del tempo di sedazione. Quando si utilizzano mosche di genotipi diversi (ad esempio, nelle popolazioni di razza fuorirazza DGRP²⁸), questo test consente anche il recupero di singole mosche per raccogliere pozze di mosche con fenotipi contrastanti per il sequenziamento del DNA sfuso e la mappatura QTL estrema^29,30. Nel complesso, questo test consente una rapida e poco costosa raccolta di dati di sedazione di alcol su un gran numero di mosche singole.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well Cell Culture Plates	Corning	3526	Flat-bottomed; will house flies throughout assay
Aspirator
Cheesecloth	Genesee Scientific	53-100	Widely available.
Ethanol	Decon Labs	V1001	Widely available.
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover)	Walmart	550098612	Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.
Gauze (for aspirator)	Honeywell North	67622	Widely available.
Illumination Pad	Amazon (AGPtek)	ASIN B00YA9GP0G	Any light pad to provide contrast is suitable.
Jumbo Craft Sticks	Michaels	10334892	Any craft stick at least 7 cm long is suitable.
P1000 Pipette Tip (for aspirator)	Genesee Scientific	24-165RL	Any P1000 pipette tip is suitable.
Serological Pipette (for aspirator)	Genesee Scientific	12-104
Small Insect Screen Mesh	Lowe's (Saint-Gobain ADFORS)	89322	Any small insect screen mesh is suitable.
Testing Chamber			Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.
Tygon Tubing (for aspirator)	Grainger	9CUG7	Widely available.
Video Camera	Canon	1959C001AA	Any video camera is suitable.