Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

Riepilogo

Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.

Abstract

I grassi marroni e beige sono tessuti adipose specializzati che dissipano l'energia per la termogenesi da vie indipendenti e dipendenti da UCP1 (Uncoupling Protein-1). Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici erano considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che ci sono più sottotipi o sottopopolazioni che sono distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso di substrati e nel trascrittoma. Nonostante i progressi nella genomica a singola cellula, la decomposizione imparziale dei tessuti adiposi in sottotipi cellulari è stata difficile a causa della natura fragile degli adipociti pieni di lipidi. Il protocollo presentato è stato sviluppato per aggirare questi ostacoli isolando efficacemente i singoli nuclei dal tessuto adiposo per applicazioni a valle, incluso il sequenziamento dell'RNA. L'eterogeneità cellulare può quindi essere analizzata mediante sequenziamento dell'RNA e analisi bioinformatiche.

Introduzione

Gli studi hanno dimostrato che il tessuto adiposo marrone (BAT) ha una notevole capacità di dissipare energia. Esistono due tipi di adipociti termogenici con caratteristiche dello sviluppo distinte che esistono sia nei roditori che negli esseri umani: adipociti beige e adipociti bruni classici. Mentre gli adipociti bruni classici si trovano per lo più in depositi BAT interscapitolare, gli adipociti beige emergono sporadicamente nel tessuto adiposo bianco (WAT) in risposta ad alcuni segnali fisiologici, come l'esposizione cronica al freddo, un processo chiamato "marrone" o "sbiancamento". Attraverso l'uso di immagini avanzate, è ormai chiaro che gli esseri umani adulti hanno depositi sostanziali di UCP1^- BAT, soprattutto nella regione supraclavicolare^1,2,3.4 La quantità di BAT umano adulto è inversamente correlata all'adiposità e può essere aumentata da segnali esterni, come l'esposizione cronica al freddo^5,6 o z3-adrenergic recettore agonista⁷. Il dispendio energetico mediato da BAT può offrire un approccio praticabile per combattere l'obesità.

Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici sono stati considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi hanno rivelato l'esistenza di più sottotipi o sottopopolazioni distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso del substrato e nel trascrittoma^8,9,10. Per esempio, un tipo di adipocito beige che utilizza preferibilmente glucosio per la termogenesi, l'adipocito g-beige, è stato recentemente descritto¹⁰. La comprensione incompleta dei tipi di cellule nel tessuto adiposo marrone e beige e la mancanza di marcatori specifici costituiscono una barriera critica allo studio delle loro funzioni biologiche.

I metodi tradizionali per isolare le sottopopolazioni di cellule si basano sull'espressione di pochi geni marcatori noti. I recenti progressi nella genomica a singola cellula consentono l'uso di dati di espressione genica globale di singole cellule per fornire una stima imparziale del numero di sottopopolazioni in un tessuto. L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di determinare tutti i sottotipi di tessuto adiposo sotto vari stimoli termogenici ad una risoluzione a cella singola. A differenza di altri tessuti e tipi di cellule, determinare i sottotipi cellulari del tessuto adiposo è difficile a causa della fragilità degli adipociti pieni di lipidi. Questo documento introduce un protocollo robusto per isolare singoli nuclei dal tessuto adiposo per l'applicazione a valle al sequenziamento dello snRNA. È importante sottolineare che la letteratura recente che confronta i set di dati di sequenziamento dell'RNA a nuclei singoli (snRNA-seq) e di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha rivelato che il snRNA-seq è paragonabile allo scRNA-seq nel rilevamento del tipo di cellula e superiore nella copertura cellulare per un tessuto complesso come il cervello¹¹. Questo protocollo combina un metodo di centrifugazione a gradiente di densità ottimizzato per i tessuti adiposi di Rosen et al.¹² con un passo di "pulizia" nuclei con un MoFlo XDP High Speed Sorter. Come si è visto nei risultati rappresentativi, un'analisi di 7.500 nuclei singoli del tessuto adiposo bruno intersbattiare del topo ha identificato più tipi di cellule all'interno di adipociti bruni apparentemente omogenei. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare l'organizzazione a livello tissutale di adipociti e cellule residenti adiposi, l'identificazione di geni marcatori specifici del sottotipo e la fenotipizzazione dello sviluppo di topi adipose-selettivi/transgenici.

Protocollo

La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso presso l'Albert Einstein College of Medicine.

1. Preparazione di digestione tissutale e buffer di lisi

1. Preparare il buffer di digestione dei tessuti.
   1. Preparare 1 mL di tampone di digestione per ogni grammo di tessuto adiposo.
   2. Pesare 1.5 U/mL collagenae D e 2.4 U/mL dispase II e aggiungere fosfato buffersa salina (PBS).
2. Preparare il buffer di preparazione dei nuclei (NPB).
   1. Preparare 10 m HEPES, 1,5 mm di cloruro di magnesio, 10 mM di cloruro di potassio, 250 mM di saccarosio e 0,1% NP-40 in acqua priva di nuclea. Mescolare bene. Il saccarosio può richiedere più tempo per sciogliersi rispetto agli altri componenti.
3. Preparare la soluzione 9A (Bovine Serum albumin) dello 0,5%.
   1. Preparare 0,5% DI BSA in PBS contenente EDTA. Si consiglia di utilizzare PBS di grado di coltura cellulare filtrato sterile (vedere Tabella dei materiali).

2. Digestione enzimatica del tessuto adiposo

1. I topi dissetati per estrarre il tessuto adiposo secondo Aune et al.¹³. Raccogliere il tessuto isolato in un piatto contenente PBS. Trasferire il tessuto in un tovagliolo di carta per asciugare. Quindi mettere il tessuto in un piatto pulito.
2. Aggiungere il cloruro di calcio al tampone di digestione ad una concentrazione finale di 10 mM. Aggiungere un piccolo volume di tampone di digestione al piatto e tritare accuratamente il tessuto adiposo. Il volume del buffer di digestione richiesto sarà basato sulla quantità di tessuto isolato. Di solito viene utilizzato 1 mL o meno.
3. Aggiungere circa la metà della quantità di buffer di digestione preparato (ad es. 10 mL per cinque topi) al tessuto macinato. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire il campione in un tubo di centrifuga conica da 50 mL. Aggiungere la quantità residua di tampone per lavare il piatto e trasferirlo al tubo da 50 mL contenente il campione. Pipette su e giù più volte. Poi incubare con agitazione a 200-210 rpm a 37 gradi centigradi per 12-15 min.

3. Isolamento degli Adipociti

1. Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5% BSA a un rapporto 1:1 al campione. Mescolare bene pipetting su e giù più volte. Centrifugare il campione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) per ruotare verso il basso la frazione vascolare stroposta (SVF). La frazione adipocite rimarrà nello strato superiore del campione.
2. Posizionare un filtro cellulare di 40 m sopra un tubo di centrifuga conica da 50 mL e filtrare il campione, raccogliendo lo strato superiore e lasciando dietro di sé l'SVF nella parte inferiore del tubo. Trasferire lo strato superiore (frazione adipocite) in un nuovo tubo capovolgendo il filtro sopra il tubo e utilizzando 0,5% BSA per invertire il filtro e raccogliere il campione nel tubo.
3. Portare il volume totale dello 0,5% di BSA a 10-15 mL in base alle dimensioni del campione e alla pipetta su e giù con una pipetta sierologica o scuotere brevemente su e giù per mescolare il campione. Centrifugare nuovamente il campione a 300 x g per 5 min a RT.

4. Isolamento dei nuclei

1. Utilizzare una punta di pipetta a foro largo e trasferire con attenzione lo strato superiore del campione su un filtro cellulare di 100 m posto sopra un nuovo tubo prechilled sul ghiaccio, lasciando dietro di sé qualsiasi SVF residua.
2. Risciacquare/lavare il filtro con una quantità sufficiente di NPB e scartare il filtro. Da questo passo in avanti hanno il campione sul ghiaccio il più spesso possibile e lavorare rapidamente per evitare perdite e/o nuclei malsani. È utile prechill microcentrifuga tubi da utilizzare in passi futuri sul ghiaccio.
3. Mettere il campione sul ghiaccio per non più di 2 min con l'inversione delicata intermittente del tubo da mescolare. Il tempo di incubazione sul ghiaccio deve essere ottimizzato per le dimensioni del campione e il tipo di adipociti. Centrifuga a 1.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min.
4. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di NPB. Trasferire il campione in un tubo di microcentrismo pulito. Durante il trasferimento, evitare di toccare le pareti del tubo, che contengono detriti e lipidi. Aggiungete al campione l'inibitore di 0,6 U/L RNase e mescolate. Centrifuga di nuovo a 1.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min.
   NOTA: la velocità e il tempo di centrifugazione devono essere ridotti in questa fase per i campioni più piccoli.
5. Rimuovere il supernatante e risospendere in 1 mL di Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS - 0,6 U/ Sl RNase inibitore).
6. Filtrare due volte in un tubo pulito con filtri impilabili da 30 m. Lavare il filtro con un piccolo volume di Nuclei Wash Buffer. In alternativa, per i campioni più piccoli, utilizzare un filtro di 30 m che si inserisce in un tubo di microcentrifuga e filtrare direttamente in esso.
7. Confermare il successo dell'isolamento dei nuclei sani.
   1. Macchia redigere una piccola aliquota del campione con trypan e usa un contatore cellulare automatizzato per valutare la dimensione media dei morti e la percentuale di cellule morte. La dimensione media dei morti per un campione che contiene per lo più nuclei deve variare tra 7-10 m. La dimensione dei nuclei è di solito di circa 8 m.
   2. Macchiare una piccola aliquota del campione con DAPI ed esaminare al microscopio con un obiettivo 20x o superiore. La membrana nucleare deve essere intatta e i nuclei devono essere rotondi.

5. Pulizia FACS e fase di concentrazione dei nuclei

1. Procedere immediatamente al passo FACS per pulire i nuclei e rimuovere eventuali detriti in eccesso. Il buffer di raccolta deve contenere Nuclei Wash Buffer. Durante FACS il buffer viene diluito. Preparazione di una maggiore concentrazione di BSA e RNase inibitore per tenere conto della diluizione durante lo smistamento è utile. Il blocco di raccolta FACS deve essere in modalità di raffreddamento.
2. Dopo lo smistamento dei nuclei, centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi per concentrare il campione. Ricostituire in un volume appropriato di Nuclei Wash Buffer per ottenere una concentrazione di 500-1.500 nuclei/ . Non tentare di rimuovere tutti i supernatali. In questo modo si tradurrà in perdita di nuclei.
3. Utilizzare un emocitometro e un'aliquota macchiata DAPI per un conteggio finale e per visualizzare i nuclei. Quindi procedere immediatamente con snRNA-seq secondo il protocollo del produttore.

Risultati

I nuclei di adipociti non ordinati contengono detriti e doppietti che creano rumore e un elevato background nel sequenziamento a valle dell'RNA a cellule singole. La strategia rappresentativa del gate FACS è illustrata nella Figura 1. I nuclei sono stati selezionati per la prima volta in base alla dispersione in avanti (FSC) e alla dispersione laterale (SSC)(A),quindi sono stati selezionati solo i singlet in base alla combinazione di larghez...

Discussione

Viene presentato un metodo semplice e robusto per isolare i singoli nuclei e studiare l'eterogeneità del tessuto adiposo. Rispetto al sequenziamento dell'RNA di tessuto intero, questo flusso di lavoro offre una visione imparziale dell'eterogeneità cellulare e dei marcatori specifici della popolazione. Questo è significativo e innovativo per il progresso della biologia adipocite, metabolismo molecolare, e la ricerca sull'obesità.

Questo protocollo è particolarmente ottimizzato per l'applic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA	Sigma	A1595
CaCl2	Sigma	21115
Cell filter 100 μm	Corning	431752
Cell filter 40μm	Corning	431750
CellTrics (30 μm)	Sysmex	04-004-2326
Collagenase D	Roche	11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
DAPI	Sigma	D9542
Dispase II	Roche	4942078001
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Fisher	P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458	Stackable filters
MgCl2	Sigma	M1028
MoFloXDP Cell Sorter	Beckman Coulter	ML99030
NP-40	Sigma	74385
Protector RNase Inhibitor	Roche	3335402001
Sucrose	Fisher	S5-3