Auto-assemblaggio di acidi nucleici peptidici modificati gamma in nanostrutture complesse in miscele di solventi organici

Riepilogo

Questo articolo fornisce protocolli per la progettazione e l'auto-assemblaggio di nanostrutture da oligomeri di acido nucleico peptidico modificati gamma in miscele di solventi organici.

Abstract

Le attuali strategie nella nanotecnologia del DNA e dell'RNA consentono l'auto-assemblaggio di una varietà di nanostrutture di acido nucleico in mezzi acquosi o sostanzialmente idratati. In questo articolo, descriviamo protocolli dettagliati che consentono la costruzione di architetture in nanofibra in miscele di solventi organici attraverso l'auto-assemblaggio di piastrelle di acido nucleico peptidico (γPNA) univocamente adattabili, a singolo filamento e modificate gamma. Ogni piastrella a singolo filamento (SST) è un oligomero γPNA a 12 basi composto da due domini modulari concatenati di 6 basi ciascuno. Ogni dominio può legarsi a un dominio reciprocamente gratuito presente sui filamenti vicini utilizzando la complementarità programmata per formare nanofibre che possono crescere fino a micron in lunghezza. Il motivo SST è composto da 9 oligomeri totali per consentire la formazione di nanofibre a 3 eliche. In contrasto con le analoge nanostrutture del DNA, che formano strutture monodisperse di diametro, questi sistemi γPNA formano nanofibre che si raggruppano lungo le loro larghezze durante l'auto-assemblaggio in miscele di solventi organici. I protocolli di auto-assemblaggio qui descritti includono quindi anche un tensioattiva convenzionale, sodio dodecil solfato (SDS), per ridurre gli effetti di raggruppamento.

Introduzione

Costruzione di successo di numerose nanostrutturecomplesse^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} in mezzi acquosi o sostanzialmente idratati realizzati utilizzando naturalmente in opere precedenti sono stati mostrati acidi nucleici presenti come DNA^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10} e RNA^11,12. Tuttavia, gli acidi nucleici presenti in natura subiscono cambiamenti conformazionali elicoidali duplex o hanno ridotto le condizioni termiche nelle miscele di solventi^{organici 13,14}.

In precedenza, il nostro laboratorio ha segnalato un metodo per la costruzione di nanofibre a 3 eliche utilizzando imitazioni dell'acido nucleico sintetico modificato in posizione gamma chiamate acidi nucleici gamma-peptidici (γPNA)¹⁵ (Figura 1A). La necessità di tale sviluppo e le potenziali applicazioni dell'acido nucleico sintetico imitano la PNA è stata discussa^{nel campo 16,17}. Abbiamo dimostrato, attraverso un adattamento della strategia di piastrella mono-filamento (SST) presentata per le nanostrutture di DNA^18,19,20, che 9 oligomeri γPNA sequenzialmente distinti possono essere progettati per formare nanofibre a 3 eliche in miscele di solventi organici aprotici polari selezionati come DMSO e DMF. Gli oligomeri γPNA sono stati ordinati commercialmente con modifiche del glicole (R)-dietilenico (mini-PEG) in tre posizioni γ (1, 4 e 8 posizioni di base) lungo ogni oligomero a 12 basi sulla base di metodi pubblicati da Sahu et al. ²¹ Queste modifiche gamma causano la pre-organizzazione elicoidica associata alla maggiore affinità di legame e stabilità termica di γPNA rispetto alla PNA non modificata.

Questo articolo è un adattamento del nostro lavoro riportato in cui studiamo gli effetti della soluzione solvente e della sostituzione con il DNA sulla formazione di nanostrutture a base di γPNA¹⁵. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire descrizioni dettagliate del progetto e protocolli dettagliati per metodi adattati ai solventi che sono stati sviluppati per l'auto-assemblaggio e la caratterizzazione della nanofibra γPNA. Così, introduciamo prima la strategia modulare SST, una piattaforma generale per la progettazione di nanostrutture utilizzando l'acido nucleico sintetico che imita la PNA.

Il passo elicoiale per i duplex PNA è stato segnalato per essere di 18 basi per turno rispetto ai duplex del DNA, che subiscono un turno ogni 10,5 basi(Figura 1B). Pertanto, la lunghezza del dominio degli SST γPNA dimostrati è stata impostata su 6 basi per ospitare un terzo di un giro completo o 120 ° di rotazione per consentire l'interazione tra tre eliche triangolamente.e. Inoltre, a differenza dei precedenti motivi SST, ogni SST contiene solo 2 domini, creando efficacemente una struttura a nastro 1-dimensionale che avvolge per formare un fascio a tre eliche (Figura 1C). Ogni oligomero γPNA a 12 basi viene modificato in gamma nelle posizioni 1, 4 e 8 per garantire una distribuzione uniforme dei gruppi mini-PEG attraverso il motivo SST complessivo. Inoltre, all'interno del motivo, ci sono due tipi di oligomeri: fili "contigui" che esistono su una singola elica e fili "crossover" che si estendono sull'elica (Figura 1D). Inoltre, gli oligomeri P8 e P6 sono etichettati rispettivamente con Cy3 fluorescente (stella verde) e biotina (ovalegiallo), (Figura 1D),per consentire il rilevamento della formazione della struttura utilizzando la microscopia a fluorescenza. Complessivamente, il motivo SST è composto da 9 oligomeri totali per consentire la formazione di nanofibre a 3 eliche attraverso la complementarità programmata di ogni singolo dominio al dominio corrispondente su un oligomero vicino (Figura 1E).

Protocollo

1. Progettazione della sequenza γPNA

1. Scarica la DNA Design Toolbox²² sviluppata dal Winfree Lab al Caltech²³ nella cartella contenente script di programmazione per la progettazione di sequenze.
2. All'interno di tale cartella di progettazione della sequenza, aprire un linguaggio di programmazione di quarta generazione compatibile con l'estensione di file ".m", quindi aggiungere la cartella "DNAdesign" scaricata in precedenza al percorso utilizzando il comando seguente:
   >> addpath DNAdesign
3. Successivamente eseguire il seguente script denominato "PNA3nanofiber.m" (vedere la figura complementare 1) utilizzando il seguente comando:
   >> PNA3nanofiber
4. Eseguire questo script per creare variabili denominate "thisSeqs" e "thisScore". La variabile "thisSeqs" contiene le sequenze degli oligomeri progettati e "thisScore" è il punteggio di penalità.
5. Eseguire lo script più volte per ottenere il punteggio più minimo. Un campione di 20 esecuzioni di questo tipo è riportato nella tabella 1.
6. Confermare manualmente la complementarità Watson-Crick desiderata di ogni dominio delle sequenze generate per il motivo strutturale SST specificato. Le specifiche di sequenza per la struttura in nanofibra a 3 eliche sono mostrate nella tabella 2.
7. Verificare quanto segue per le sequenze generate.
   1. Evitare di utilizzare quattro basi C e G consecutive.
   2. Selezionare manualmente sequenze specifiche per la funzionalizzazione N-terminale con molecole di colorante fluorescente e biotina per consentire studi di microscopia fluorescente.
   3. Includere un minimo di 3 mini-modifiche gamma PEG sulla spina dorsale per consentire la conformazione elicoilica pre-organizzata negli oligomeri a singolo filamento come descritto da Sahu et al. ^{21 della commissione per la}

2. Preparazione di trefoli di serie γPNA

1. Ottenere filamenti di componenti γPNA di sequenze specificate a 50 nmol scala di sintesi con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) purificazione da un produttore commerciale.
2. Rimospendare ogni filamento in acqua deionizzata a concentrazioni di 300 μM. Conservare i fili rimorsi in congelatore a -20 °C fino a diversi mesi fino a quando necessario per la sperimentazione.

3. Studi della curva di fusione dei sottoinsiemi di oligomeri γPNA

1. Ottenere intervalli di temperatura di fusione per diverse combinazioni di sottoinsiemi complementari a 2 oligomeri e 3 oligomeri eseguendo uno studio della curva di fusione in tamponi acquosi come 1x soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) o solvente organico polare preferito come dimetilformamide (DMF) o solfossido di dimetile (DMSO) (vedi figura 2).
   NOTA: Le curve di fusione termica a >50% del DMF iniziano a perdere la linea di base superiore e mostrano gravi disturbi in parte a causa dell'elevata assorbanza di DMF alla lunghezza d'onda richiesta per gli esperimenti. Questo è un fenomeno noto nella letteratura²⁴. È tuttavia possibile ottenere le curve di fusione a 5 μM per trefoli in queste condizioni di solvente.
   1. Aliquota 16,7 μL dallo stock di 300 μM di ciascun oligomero e fare il volume finale a 1000 μL in 1x PBS o 100% (v/v) DMSO o 100% (v/v) DMF ottenendo effettivamente 5 μM di concentrazione finale per oligomero. Trasferire questa miscela di sottoinsiemi oligomeri in un percorso ottico di 1 cm, cuvetta al quarzo.
   2. Eseguire esperimenti UV-Vis a temperatura variabile in uno spettrofotometro dotato di un blocco di temperatura programmabile.
   3. Raccogliere punti dati per le curve di fusione su un intervallo di temperatura di 15\u201290 °C sia per i cicli di raffreddamento (ricottura) che di riscaldamento (fusione) a una velocità di 0,5\u20121 °C/min. Conservare i campioni per 10 minuti a 90 °C prima del raffreddamento e a 15 °C prima del riscaldamento. Determinare la temperatura di fusione (T_m) dal picco della prima derivata della curva di riscaldamento.
   4. Verificare che gli intervalli di temperatura di fusione per sottoinsiemi a 2 oligomeri siano superiori a 35 °C in tutti i casi di solvente. Inoltre, verificate che i corrispondenti sottoinsiemi a 3 oligomeri che contengono un filamento aggiuntivo al loro sottoinsieme equivalente a 2 oligomeri mostrino un notevole aumento di T_m a causa di una maggiore co-operatività.
      NOTA: Ciò verificherebbe che un singolo auto-assemblaggio in vaso di più oligomeri possa ripiegarsi in modo cooperativo nella nanostruttura desiderata con una ragionevole stabilità termica.

4. Protocollo di auto-assemblaggio per più oligomeri γPNA distinti

NOTA: Per ideare un protocollo di rampa termica ad auto-assemblaggio per nanostrutture γPNA, è auspicabile la ricottura a rampa lenta.

1. Nel caso di sequenze di oligomeri generate, ricotturare i campioni per 22,5 ore in un raffreddamento a ciclo termico da 90 a 20 °C. Tipicamente, la temperatura di fusione ottenuta per i sottoinsiemi γPNA a 2 oligomeri e 3 oligomeri si trova in intervalli di 40\u201270 °C per diverse condizioni del solvente.
2. Programmare il ciclore termico come segue: tenere a 90 °C per 5 min, scendere da 90 a 70 °C ad una velocità costante di 0,1 °C/min, scendere da 70 a 40 °C ad una velocità di 0,1 °C/3 min, scendere da 40 a 20 °C ad una velocità di 0,1 °C/min e tenere a 4 °C (cfr. tabella 3). I campioni possono essere conservati in 4 °C per 12\u201224 h prima della caratterizzazione.
   NOTA: Mentre i sottoinsiemi di 2 e 3 oligomeri del nostro sistema di nanofibra possono formarsi in 1x PBS, le nanofibre su scala micron completa si aggregano in 1 pbs. Pertanto, le condizioni del solvente dovrebbero essere ottimizzate in base alla scala e alle dimensioni della struttura in formazione, nonché al tipo e alla densità delle modifiche gamma.
3. Per nanofibre a 3 eliche lunghe su scala micron, preparare campioni di lotti ricotti in DMSO al 75%: H₂O (v/v), 75% DMF: H₂O (v/v), 40% 1,4-diossano: H₂O (v/v) sulla base di studi di ottimizzazione dei solventi¹⁵.
4. Preparare i lotti di ricottura come segue (cfr. tabella 4). In primo luogo, preparare 10 sotto stock μL a concentrazioni di 20 μM dalle scorte principali di 300 μM per ogni oligomero aliquotando 0,67 μL dallo stock principale e facendo il volume a 10 μl utilizzando acqua deionizzata.
5. Aliquota 1 μL dalle scorte di 20 μM per ogni oligomero e aggiungerla a un tubo PCR da 200 μL. Ciò rappresenta un volume totale di 9 μL per 9 oligomeri.
6. Aggiungere 30 μL di DMSO/DMF anidro per le casse 75% DMSO e 75% DMF con ulteriori 1 μL di acqua deionizzata per fare un volume finale di 40 μL con ogni oligomero a concentrazioni finali di 500 nM. Aggiungere 16 μL di 1,4-diossano e rendere il volume con acqua deionizzata a 40 μL per lo stato del 40% di solvente di diossano.
7. Caricare i lotti ricottori sul ciclore termico e sul ricottura utilizzando il protocollo menzionato al passaggio 4.2.

5. Imaging della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

1. Preparare una camera di umidità da una scatola di punte di pipetta vuota. Riempire la scatola con circa 5 mL di acqua per evitare l'essiccazione dei canali di flusso del campione descritti come segue (vedere figura 3).
2. Preparare la camera di flusso con uno scivolo al microscopio, 2 strisce a nastro a doppia lato e coverlip rivestito con nitrocellulosa. Per rivestire il coverslip con nitrocellulosa, immergere il coverslip in un becher contenente lo 0,1% di collodion in acetato di amile e asciugato all'aria.
   1. Preparare la soluzione di nitrocellulosa effettuando una diluizione di 20 volte dal collodio del 2% disponibile in commercio in acetato di amile con solvente acetato di isoamile.
3. Preparare la soluzione di albumina di siero bovino biotinilato (Biotin-BSA) pesando 1 mg di Biotin-BSA e scioglierla in 1 mL di 1x PBS. Flusso 15 μL di 1 mg/mL Biotin-BSA in tampone PBS 1x posizionando il canale di flusso ad angolo. Incubare il canale di flusso per 2-4 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
4. Preparare il tampone di lavaggio sciogliendo 1 mg di BSA in 1 mL di 1x PBS. Lavare l'eccesso di Biotin-BSA fluendo 15 μL del tampone di lavaggio. Per passivare la superficie, incubare il canale di flusso per 2-4 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
5. Preparare la soluzione di streptavidina misurando 0,5 mg di streptavidina e 1 mg di BSA e quindi sciogliersi utilizzando 1 mL di 1x PBS. Flusso 15 μL di 0,5 mg/mL streptavidina in 1x PBS contenente 1 mg/mL di BSA. Incubare il canale di flusso per 2-4 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Scorrere 15 μL del tampone di lavaggio per lavare via la Streptavidin non vincolata.
6. Flusso 15 μL di lotto precedentemente ricotto di oligomeri γPNA a concentrazione di 500 nM per trefolo in condizioni di DMSO al 75%, 75% DMF o 40% 1,4-diossina. Incubare il canale di flusso per 2-4 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
7. Preparare 1 mM Trolox in condizioni di solvente preferite diluendo 10 volte da uno stock di 10 mM di Trolox in DMSO (misurare 2,5 mg di Trolox e sciogliere in 1 mL di DMSO). Lavare le nanostrutture non vincolate nel canale di flusso con 15 μL di 1 mM Trolox con la stessa composizione del solvente delle nanostrutture.
   NOTA: Il contenuto di DMSO >50% nel canale di flusso produrrebbe lievi disturbi del segnale a causa del diverso indice di rifrazione della condizione del solvente durante il TIRF, che è tipicamente calibrato per gli angoli TIRF dell'acqua di rigliona. Questo può essere corretto lavando con 1 mM Trolox realizzato diluire il Trolox 10-fold da 10 mM utilizzando acqua deionizzata. Questa tecnica fornisce immagini più chiare, ma è utile solo per valutare se la formazione si è verificata, tuttavia, perché produce microbolle bifase nel canale di flusso. Di conseguenza, le nanostrutture potrebbero essere visibili all'interfaccia delle due fasi, come mostrato nella figura 4D.
8. Trasferire il canale di flusso sul porta scorrevole e sull'immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di imaging TIRF utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio 60x e una lente d'ingrandimento 1,5x. Eseguire la scansione del canale di flusso con ingrandimento 60x o 90x monitorando il canale Cy3 (vedere la figura 4).

6. Imaging di microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

1. Pesare 0,5 g di acetato di uranile in 50 mL di acqua distillata per preparare una soluzione acquosa di acetato di uranile acquoso. Filtrare la soluzione di macchia di acetato di uranile acquoso all'1% utilizzando un filtro da 0,2 μm collegato a una siringa.
   NOTA: In alternativa, l'acetato di uranile acquoso al 2% potrebbe essere acquistato da un produttore commerciale.
2. Acquista griglie in rame rivestite a strato di formvar disponibili in commercio con dimensioni a 300 maglie.
   NOTA: È importante notare che lo strato di supporto formvar potrebbe essere sciolto via da solventi come DMSO oltre i 2 minuti. Per un'incubazione del campione più lunga, sono disponibili formvar commercialmente disponibili stabilizzati con monossido di silicio sulle griglie di rame che consentono alla rete di essere più idrofila delle griglie rivestite di carbonio e possono resistere a condizioni di campionamento vigorose e fascio di elettroni, come mostrato nella figura 5C.
3. Pipetta 4 μL di campione sulla griglia per 15 s. Utilizzare un pezzo di carta da filtro per eliminare il campione portando la carta filtrante a contatto con la griglia dal lato.
4. Aggiungere immediatamente 4 μL della soluzione di macchia sulla griglia per 5 s.
5. Eliminare la macchia come prima e tenere la carta filtrante contro la griglia per 1\u20122 min per assicurarsi che la griglia sia asciutta. I campioni devono essere in genere con immagini entro 1\u20122 h dopo la colorazione. In alternativa, se si garantisce che la griglia sia completamente asciutta, le griglie possono essere conservate in una scatola di stoccaggio della griglia TEM per un massimo di 3 giorni prima dell'imaging.
6. Trasferire la griglia su un porta campioni TEM e un'immagine utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione azionato a 80 kV con ingrandimento compreso tra 10 K e 150K (vedere figura 5).

7. Morfologie diverse per ibridi γPNA-DNA basati sulla sostituzione selettiva con DNA

1. Ottenere oligomeri di DNA di sequenze specificate (cfr. tabella 5) da produttori commerciali di oligonucleotidi sintetizzati su scala di 25 nmol utilizzando la dissalazione standard. Resuspend queste sequenze di DNA usando acqua deionizzata priva di RNasi a concentrazioni di 20 μM.
2. Per le sostituzioni contigue del filamento γPNA con DNA, le sequenze D3, D5 e D9 possono sostituire i filamenti p3, p5 e p9. Allo stesso modo, per le sostituzioni di filamenti γPNA crossover con DNA, le sequenze D1, D4 e D7 possono sostituire i filamenti p1, p4 e p7.
3. Aliquota 1 μL dalle scorte di 20 μM per ogni oligomero γPNA o DNA e aggiungerla a un tubo PCR da 200 μL come nel passaggio 2.7. Aggiungere 30 μL di DMSO anidro e 1 μL di acqua deionizzata priva di RNasi per rendere il volume finale a 40 μL (cfr. tabella 6).
4. Caricare i lotti ricottori sul ciclore termico e sul ricottura utilizzando il protocollo menzionato al passaggio 4.2.
5. Caratterizzare le nanostrutture ibride γPNA-DNA utilizzando il protocollo TIRF seguendo i passaggi della sezione 5 o utilizzando il protocollo di imaging TEM menzionato nella sezione 6 (vedere la figura 6).

8. Morfologie diverse per le nanofibre γPNA in concentrazioni variabili di SDS

1. Preparare uno stock principale di SDS del 20% (wt/v) misurando 20 mg di SDS e scioglierlo in 100 μL di acqua deionizzata.
2. Preparare un sotto stock SDS 6% (wt/v) aliquotando 3 μL dal 20% di stock di SDS e facendo il volume a 10 μL utilizzando acqua deionizzata.
3. Ricottura gli oligomeri γPNA in concentrazioni finali di 5,25 mM e 17,5 mM SDS come segue. Aliquota 1 μL dalle scorte di 20 μM per ogni oligomero γPNA e aggiungerla a un tubo PCR da 200 μL come nel passaggio 2.7. Aggiungere 30 μL di DMSO anidro e 1 μL di SDS 6% e 20% per fare il volume finale a 40 μL per raggiungere concentrazioni finali di SDS rispettivamente di 5,25 mM e 17,5 mM (cfr. tabella 7).
4. Caricare i lotti ricottori di diverse concentrazioni di SDS sul ciclore termico e sul ricottura utilizzando il protocollo menzionato al passaggio 4.2.
5. Caratterizzare le nanostrutture γPNA in presenza di SDS utilizzando il protocollo TIRF seguendo i passaggi della sezione 5 o utilizzando il protocollo di imaging TEM menzionato nella sezione 6 (vedere la figura 7).

Risultati

I protocolli discussi nelle sezioni precedenti descrivono la progettazione di un motivo SST adattato dalle nanofibre di DNA per la robusta generazione di strutture di nanofibre auto-assemblate utilizzando oligomeri γPNA multipli e distinti. Questa sezione descrive l'interpretazione dei dati ottenuti dalla ricreazione riuscita dei protocolli descritti.

Seguendo il protocollo descritto nella sezione 5 per l'imaging TIRF di campioni di oligomeri γPNA ricotti in DMSO al 75%: H₂O (v/v)...

Discussione

Questo articolo si concentra sull'adattamento e il miglioramento dei protocolli di nanotecnologia degli acidi nucleici esistenti verso miscele di solventi organici. I metodi qui descritti si concentrano sulle modifiche e sulla risoluzione dei problemi all'interno di uno spazio sperimentale definito di solventi organici aprotici polari selezionati. Esiste ancora un potenziale inesplorato per altri protocolli consolidati di nanotecnologia dell'acido nucleico da adattare all'interno di questo spazio. Ciò potrebbe migliorar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
γPNA strands/oligomers	Trucode Gene Repair Inc.		Section 2.1
UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	Varian Cary 300	Section 3.1.2
Quartz cuvettes	Starna	29-Q-10	Section 3.1.1
Thermal cycler	Bio Rad	C1000 touch	Section 4.1
0.2 mL PCR tubes	VWR	53509-304	Section 4.5
Anhydrous DMF	VWR	EM-DX1727-6	Section 4.6
Anhydrous DMSO	VWR	EM-MX1457-6	Section 4.6
Anhydrous 1,4-Dioxane	Fisher Scientific	AC615121000	Section 4.6
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	VWR	75800-994	Section 3.1.1
Microscope slides	VWR	89085-399	Section 5.2
Glass cover slips	VWR	48382-126	Section 5.2
2% Collodion in Amyl Acetate	Sigma-Aldrich	9817	Section 5.2
Isoamyl Acetate	VWR	200001-180	Section 5.2
Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)	Sigma-Aldrich	A8549	Section 5.3
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	Section 5.4
Streptavidin	Sigma-Aldrich	189730	Section 5.5
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	Section 5.7
Total Internal Reflection Fluorescence microscope	Nikon	Nikon Ti2-E	Section 5.8
Transmission Electron Microscope	Joel	JEM 1011	Section 6.6
Tweezers	Dumont	0203-N5AC-PO	Section 6.3
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Section 6.1
Formvar, 300 mesh, Copper grids	Ted Pella Inc.	1701-F	Section 6.2
Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids	Ted Pella Inc.	1829	Section 6.2
DNA oligomers/strands	IDT		Section 7.1
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)	VWR	97064-860	Section 8.1