Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Riepilogo

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Abstract

L'affezione acuta del cervello dei roditori offre un approccio sperimentale trattabile per ottenere informazioni sull'organizzazione e la funzione dei circuiti neurali con risoluzione a singola cellula utilizzando elettrofisiologia, microscopia e farmacologia. Tuttavia, una considerazione importante nella progettazione di esperimenti in vitro è la misura in cui diversi preparati a fette ricapitolano modelli naturalistici di attività neurale osservati in vivo. Nel cervello intatto, la rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincronizzata che riflette lo stato comportamentale dell'animale, come esemplificato dai complessi a catena a onde acuti (SWR) che si verificano durante gli stati consumatori di veglia o il sonno non REM. Gli SWR e altre forme di attività di rete possono emergere spontaneamente in fette ippocampali isolate in condizioni appropriate. Al fine di applicare il potente toolkit di fette cerebrali allo studio dell'attività della rete ippocampale, è necessario utilizzare un approccio che ottimizzi la salute dei tessuti e la conservazione della connettività funzionale all'interno della rete ippocampale. I topi sono perfusi transcardialmente con liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio freddo. Le fette orizzontali contenenti l'ippocampo vengono tagliate con uno spessore di 450 μm per preservare la connettività sinaptica. Le fette si riprendono in una camera in stile interfaccia e vengono trasferite in una camera sommersa per le registrazioni. La camera di registrazione è progettata per la doppia superfusione superficiale di liquido cerebrospinale artificiale ad alta portata per migliorare l'ossigenazione della fetta. Questo protocollo produce tessuti sani adatti allo studio di attività di rete complesse e spontanee in vitro.

Introduzione

La misurazione elettrofisiologia da fette ippocampali viventi in vitro è un potente approccio sperimentale con numerosi vantaggi. Lo sperimentatore può usare un microscopio, micromanipolatori e un sistema di registrazione per visualizzare e raccogliere direttamente le misurazioni dai singoli neuroni nel tessuto. Le fette di tessuto sono anche molto accessibili alla fotostimolazione o alla somministrazione di farmaci per esperimenti optogenetici, chemiogenetici o farmacologici.

La rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincrona in vivo,visibile come oscillazioni nel potenziale di campo locale extracellula....

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Columbia University (AC-AAAU9451).

1. Preparare soluzioni

1. Preparare la soluzione di taglio del saccarosio per l'affezione, come descritto nella tabella 1.
   NOTA: Dopo aver preparato 1 L di soluzione di saccarosio, congelare una piccola quantità (circa 100-200 mL) in un vassoio di ghiaccio. Questi cubetti di ghiaccio di saccarosio congelati saranno miscelati in un liquame ghiacciato (vedere fase 4.3).
2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) per la registrazione come de....

Risultati

Qui sono presentate registrazioni rappresentative da fette HEC preparate come descritto in questo protocollo. Dopo il recupero in una camera di tenuta dell'interfaccia (Figura 1C), le fette vengono trasferite singolarmente in una camera di registrazione sommersa (Figura 2B). La camera di registrazione viene fornita con ACSF saturo di carbogen utilizzando una pompa peristaltica (Figura 2A). La pompa estrae prima L'ACSF da un becher d.......

Discussione

Ci sono diversi passaggi in questo protocollo di affettamento progettato per promuovere la salute dei tessuti e favorire l'emergere di attività spontanea della rete naturalistica: il topo viene transcardially perfuso con soluzione di taglio del saccarosio refrigerato; le fette di corteccia orizzontale-entorinale (HEC) sono tagliate ad uno spessore di 450 μm dall'ippocampo intermedio o ventrale; le fette si riprendono all'interfaccia dell'ACSF riscaldato e dell'aria umidificata ricca di carbogeni; durante le registrazio.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Lulzbot	LulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holder	NIH 3D Print Exchange	3DPX-001623	Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma Aldrich	A9187-500MG
Ag-Cl ground pellets	Warner	64-1309, (E205)
agar	Becton, Dickinson	214530-500g
ascorbic acid	Alfa Aesar	36237
beaker (250 mL)	Kimax	14000-250
beaker (400 mL)	Kimax	14000-400
biocytin	Sigma Aldrich	B4261
blender	Oster	BRLY07-B00-NP0
Bonn scissors, small	becton, Dickinson	14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)	Sutter Instruments	BF150-86-10HP	Fire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M)	G-Biosciences	R040
camera	Olympus	OLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)	Airgas	X02OX95C2003102
compressed oxygen	Airgas	OX 200
constant voltage isolated stimulator	Digitimer Ltd.	DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm)	VWR	16004-314
cyanoacrylate adhesive	Krazy Glue	KG925	Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition software	Axograph	N/A	Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop	Dell	N/A	Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440A	Molecular Devices	1-2950-0367
digital timer	VWR	62344-641	4-channel Traceable timer
disposable absorbant pads	VWR	56616-018
dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
double-edge razor blades	Personna	BP9020
dual automatic temperature controller	Warner Instrument Corporation	TC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber	N/A	N/A	The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rack	Automate Scientific	FR-EQ70"	A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	324626-25GM
filter paper	Whatman	1004 070
fine scale	Mettler Toledo	XS204DR
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
glass petri dish (100 x 15 mm)	Corning	3160-101
glucose	Fisher Scientific	D16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma Aldrich	G8877-250MG
ice buckets	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
isoflurane vaporizer	General Anesthetic Services	Tec 3
lab tape	Fisher Scientific	15-901-10R
lens paper	Fisher Scientific	11-996
light source	Olympus	TH4-100
magnesium chloride solution (1 M)	Quality Biological	351-033-721EA
magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-56	Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5
micromanipulator (manual)	Scientifica	LBM-2000-00
microscope	Olympus	BX51WI
microspatula	Fine Science Tools	10089-11
monitor	Dell	2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length)	Becton, Dickinson	305176
nylon filament	YLI Wonder Invisible Thread	212-15-004	size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon mesh	Warner Instruments Corporation	64-0198
perstaltic pump	Harvard Apparatus	70-2027
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma Aldrich	P1937-1G
pipette holders	Molecular Devices	1-HL-U
platinum wire	World Precision	PT0203
polylactic acid (PLA) filament	Ultimaker	RAL 9010
potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911-500G
potassium gluconate	Sigma Aldrich	1550001-200MG
potassium hydroxide	Sigma Aldrich	60377-1KG
razor blades	VWR	55411-050
roller clamp	World Precision Instruments	14041
scale	Mettler Toledo	PM2000
scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
slice harp	Warner	SHD-26GH/2
sodium bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500
sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrous	Fisher Chemical	S369-500
sodium pyruvate	Fisher Chemical	BP356-100
spatula	VWR	82027-520
spatula/spoon, large	VWR	470149-442
sterile scalpel blades	Feather	72044-10
stirrer / hot plate	Corning	6795-220
stopcock valves, 1-way	World Precision Instruments	14054
stopcock valves, 3-way	World Precision Instruments	14036
sucrose	Acros Organics	AC177142500
support for swivel clamps	Fisher Scientific	14-679Q
surgical scissors, sharp/blunt	Fine Science Tools	14001-12
syringe (1 mL)	Becton, Dickinson	309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip)	Becton, Dickinson	309653
three-pronged clamp	Fisher Scientific	05-769-8Q
tissue forceps, large	Fine Science Tools	11021-15
tissue forceps, small	Fine Science Tools	11023-10
transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
tubing	Tygon	E-3603	ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubing	Tygon	R-3603	ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum grease	Dow Corning	14-635-5D
vibrating blade microtome	Leica	VT 1200S
vibration-dampening table with faraday cage	Micro-G / TMC-ametek	2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L)	Kimax	KIM-28014-1000
volumetric flask (2 L)	PYREX	65640-2000
warm water bath	VWR	1209