Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Riepilogo

Questo protocollo copre un'analisi dettagliata della composizione del peptidoglicano utilizzando la spettrometria di massa per cromatografia liquida abbinata a software avanzati di estrazione delle caratteristiche e analisi bioinformatica.

Abstract

Il peptidoglicano è un componente importante delle pareti cellulari batteriche e un bersaglio cellulare comune per gli antimicrobici. Sebbene gli aspetti della struttura del peptidoglicano siano abbastanza conservati in tutti i batteri, c'è anche una notevole variazione tra Gram-positivi / negativi e tra le specie. Inoltre, ci sono numerose varianti, modifiche o adattamenti noti al peptidoglicano che possono verificarsi all'interno di una specie batterica in risposta alla fase di crescita e / o stimoli ambientali. Queste variazioni producono una struttura altamente dinamica che è nota per partecipare a molte funzioni cellulari, tra cui la crescita / divisione, la resistenza agli antibiotici e l'evitamento della difesa dell'ospite. Per comprendere la variazione all'interno del peptidoglicano, la struttura complessiva deve essere scomposta nelle sue parti costitutive (note come muropeptidi) e valutata per la composizione cellulare complessiva. Peptidoglycomics utilizza la spettrometria di massa avanzata combinata con l'analisi dei dati bioinformatici ad alta potenza per esaminare la composizione del peptidoglicano nei minimi dettagli. Il seguente protocollo descrive la purificazione del peptidoglicano da colture batteriche, l'acquisizione di dati di intensità del muropeptide attraverso uno spettrometro di massa cromatografo liquido e l'analisi differenziale della composizione del peptidoglicano utilizzando la bioinformatica.

Introduzione

Il peptidoglicano (PG) è una caratteristica distintiva dei batteri che serve a mantenere la morfologia cellulare, fornendo supporto strutturale per proteine e altri componenti cellulari ^1,2. La spina dorsale del PG è composta dall'acido N-acetil muramico (MurNAc) alternato β-1,4-e dalla N-acetil glucosamina (GlcNAc)^1,2. Ogni MurNAc possiede un peptide corto legato al residuo ᴅ-lattile che può essere reticolato con peptidi adiacenti legati al disaccaride (Figura 1A,B). Questa reticolazione....