Isolamento fecale (micro) RNA

Riepilogo

Questo protocollo isola l'RNA totale di alta qualità da campioni fecali di soggetti animali e umani. Un kit commerciale di isolamento dei miRNA viene utilizzato con un adattamento significativo per isolare l'RNA puro con quantità e qualità ottimizzate. Gli isolati di RNA sono buoni per la maggior parte dei saggi di RNA a valle come sequenziamento, micro-array e RT-PCR.

Abstract

Sta diventando chiaro che l'RNA esiste nel lume intestinale e nelle feci negli animali e negli esseri umani. Il protocollo descritto di seguito isola l'RNA totale, compresi i microRNA, da campioni fecali di soggetti animali e umani. L'obiettivo è quello di isolare l'RNA totale con elevata purezza e quantità per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA, RT-PCR e micro-array. I vantaggi di questo protocollo ottimizzato nell'isolamento dei miRNA sono la capacità di isolare prodotti di RNA altamente purificati con ulteriori fasi di lavaggio descritte, una maggiore quantità di RNA ottenuta con un metodo migliorato nella risospensione del campione e importanti suggerimenti di decontaminazione. Una limitazione è l'incapacità di elaborare e purificare campioni più grandi di oltre 200 mg in quanto queste dimensioni del campione causerebbero una difficoltà nella chiara formazione dell'interfase. Di conseguenza, le grandi dimensioni del campione possono contaminare la fase acquosa da estrarre come descritto nel protocollo con sostanze organiche che influenzano la qualità dell'RNA isolato alla fine. Tuttavia, gli isolati di RNA da un campione fino a 200 mg sono sufficienti per la maggior parte delle analisi a valle.

Introduzione

L'RNA extracellulare viene riconosciuto come un fattore significativo che media molti processi biologici¹. L'RNA extracellulare nelle feci è stato segnalato per la prima volta nel 2008 come marker per il cancro del colon e la colite ulcerosa attiva², ed è stato recentemente rivelato come un componente normale del lume intestinale e delle feci e media le comunicazioni ospite-microbo ^3,4,5. Lo scopo di questo protocollo di isolamento dell'RNA è quello di estrarre RNA extracellulare di alta qualità da campioni fecali raccolti da so....

Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono animali da ricerca qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Tutti i metodi che coinvolgono soggetti di ricerca umana qui descritti sono conformi alle linee guida stabilite dal Comitato di ricerca umana dei partner.

1. Raccolta di campioni fecali

1. Autoclavare o preparare una provetta da microcentrifuga sterile e priva di nucleasi da 2 ml con tappo a vite per ciascun soggetto animale in un esperimento.
   1. Per i soggetti umani, fornire un dispositivo di raccolta dei....

Risultati

Gli RNA rappresentativi sono stati isolati rispettivamente da campioni fecali di topo da 50 mg (2 pellet fecali di topo) e campioni di feci umane da 100 mg ed eluiti in acqua priva di nucleasi da 50 μL. L'analisi spettrofotometrica della concentrazione suggerisce che una quantità totale di 49 μg e 16 μg di RNA sono stati isolati rispettivamente (Tabella 1). La purezza dell'RNA era elevata, come indicato da un rapporto A260/A280 di ~2,0 e un rapporto A260/A230 di ~1,8 (Tabella 1). Com.......

Discussione

È importante utilizzare una tecnica priva di RNasi per prevenire la contaminazione da RNasi durante l'isolamento⁷. Dopo la centrifugazione e la formazione di un'interfase compatta, è fondamentale evitare l'interfase, la fase inferiore e il contaminante particellare che galleggia sulla parte superiore della fase acquosa durante il recupero della fase acquosa. Inoltre, vengono aggiunte due fasi di lavaggio con 500 μL e 250 μL Wash Solution 2/3 per eliminare i contaminanti nella membrana del filt.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Vortex Shaker