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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo lavoro presenta un approccio dal basso verso l'alto all'ingegneria delle forze magnetiche locali per il controllo dell'organizzazione neuronale. Le cellule simili a neuroni cariche di nanoparticelle magnetiche (MNP) sono placcate in cima e controllate da una piattaforma micro-modellata con magnetizzazione perpendicolare. Sono descritti anche la caratterizzazione magnetica, l'assorbimento cellulare MNP, la vitalità cellulare e l'analisi statistica.

Abstract

La capacità di indirizzare i neuroni verso reti neurali organizzate ha grandi implicazioni per la medicina rigenerativa, l'ingegneria tissutale e il bio-interfacciamento. Molti studi hanno mirato a dirigere i neuroni usando segnali chimici e topografici. Tuttavia, le segnalazioni di controllo organizzativo su scala micron su vaste aree sono scarse. Qui, è stato descritto un metodo efficace per posizionare i neuroni in siti preimpostati e guidare la crescita neuronale con risoluzione su scala micron, utilizzando piattaforme magnetiche incorporate con elementi magnetici micro-modellati. È stato dimostrato che il caricamento di neuroni con nanoparticelle magnetiche (MNP) li converte in unità magnetiche sensibili che possono essere influenzate da gradienti magnetici. Seguendo questo approccio, è stata fabbricata una piattaforma magnetica unica su cui le cellule PC12, un modello comune simile a un neurone, sono state placcate e caricate con nanoparticelle superparamagnetiche. Sottili pellicole di multistrati ferromagnetici (FM) con magnetizzazione perpendicolare stabile sono state depositate per fornire forze di attrazione efficaci verso i modelli magnetici. Queste celle PC12 cariche di MNP, placcate e differenziate in cima alle piattaforme magnetiche, erano direttamente attaccate ai modelli magnetici, e la crescita della neurite era ben allineata con la forma del modello, formando reti orientate. Vengono presentati metodi di caratterizzazione quantitativa delle proprietà magnetiche, assorbimento MNP cellulare, vitalità cellulare e analisi statistica dei risultati. Questo approccio consente il controllo della formazione di reti neurali e migliora l'interfaccia neurone-elettrodo attraverso la manipolazione delle forze magnetiche, che può essere uno strumento efficace per gli studi in vitro sulle reti e può offrire nuove direzioni terapeutiche di biointerfazione.

Introduzione

La micropatterning dei neuroni ha un grande potenziale per larigenerazione tissutale 1,2,3,4,5 e lo sviluppo di dispositivi neuro-elettronici6,7,8. Tuttavia, il posizionamento in scala micron dei neuroni ad alta risoluzione spaziale, come nei tessuti biologici, rappresenta una sfida significativa. La formazione di strutture predesignate su questa scala richiede la guida dei processi cellulari nervosi controllando localmente la motilità del soma e la crescita asonale. Studi precedenti hanno suggerito l'uso di segnali chimici e fisici9,10,11,12 per guidare la crescita neuronale. Qui, un nuovo approccio si concentra sul controllo del posizionamento cellulare in base ai gradienti dicampo magnetico 13,14,15,16,17, trasformando le celle cariche di MNP in unità sensibili al magnetico, che possono essere manipolate a distanza.

Kunze et al., che ha caratterizzato la forza necessaria per indurre le risposte cellulari usando cellule a chip magnetico e cariche di MNP, ha dimostrato che l'allungamento assionale precoce può essere innescato dalla tensione meccanica all'interno dellecelle 18. ha confermato che i substrati micro-fabbricati con gradienti di campo magnetico migliorati consentono la stimolazione wireless dei circuiti neurali dosati con MNP utilizzando coloranti indicatori calcio19. Inoltre, le nanoparticelle unite all'interno delle cellule, con conseguente forza localizzata mediata da nanoparticelle che si avvicinavano alla tensione cellulare20. Ciò ha portato alla fabbricazione di modelli definiti di substrati micromagnetici che hanno contribuito a studiare la risposta cellulare alle forze meccaniche. La tensione cellulare derivante dall'applicazione di forze localizzate mediate da nanoparticelle è stata raggiunta coalescenza di nanoparticelle all'interno dellecellule 20. Un sistema ibrido complementare di semiconduttori di ossido metallico (CMOS) -microfluidico è stato sviluppato da Lee et al.

ha utilizzato cuscinetti magnetici su microbila scala, pre-programmati come "punti caldi" magnetici per localizzare le celle22. Un'attività specifica potrebbe anche essere stimolata all'interno delle cellule utilizzando array magnetici micro-modellati per localizzare nanoparticelle in specifiche posizioni subcellulari23. L'assorbimento dell'MNP cellulare è stato dimostrato con successo nei neuroni primari di sanguisughe, ratti e topi24,25,26. Qui, questo è stato dimostrato su una linea cellulare feocromocitoma PC12 ratto, che è stato precedentemente segnalato per mostrare un elevato assorbimento di MNPs27. Negli ultimi anni, ci sono state varie applicazioni mediche di MNPs, tra cui la somministrazione di farmaci e la termoterapia nei trattamenti contro ilcancro 28,29,30,31. Nello specifico, gli studi riguardano l'applicazione di MNP e retineuronali 32,33,34,35. Tuttavia, l'organizzazione magnetica dei neuroni che utilizzano MNP a livello di una singola cellula merita ulteriori indagini.

In questo lavoro, è stato descritto un approccio dal basso verso l'alto per progettare forze magnetiche locali attraverso piattaforme predesignate per il controllo della disposizione neuronale. È stata presentata la fabbricazione di modelli su scala micron di multistrati FM. Questa struttura multistrato FM unica crea una magnetizzazione perpendicolare stabile che si traduce in forze di attrazione efficaci verso tutti i modelli magnetici. Attraverso l'incubazione, i MNP sono stati caricati in celle PC12, trasformandoli in unità sensibili magnetiche. Le celle cariche di MNP, placcate e differenziate in cima alle piattaforme magnetiche, erano preferenzialmente attaccate ai modelli magnetici, e la crescita della neurite era ben allineata con la forma del modello, formando reti orientate. Sono stati descritti diversi metodi per caratterizzare le proprietà magnetiche dei multistrati FM e degli MNP, e sono state presentate anche tecniche per l'assorbimento dell'MNP cellulare e i test di vitalità cellulare. Inoltre, i parametri morfometrici della crescita neuronale e l'analisi statistica dei risultati sono dettagliati.

Protocollo

NOTA: Eseguire tutte le reazioni biologiche in un armadio di biosicurezza.

1. Fabbricazione di piattaforme magnetiche

  1. litografia
    1. Tagliare vetri scivola in 2 x 2 cm2 usando una penna scriber. Pulire i vetrini in acetone e quindi isopropanolo per 5 minuti ciascuno in un bagno di ultra-sonicazione. Asciugare con azoto ad altissima purezza (UHP).
    2. Rivestire il vetro con fotoresist utilizzando lo spin-coating a 6.000 giri/min per 60 s, per raggiungere uno spessore di 1,5 μm, e cuocere a 100 °C per 60 s. Esporre il campione a una sorgente luminosa, utilizzando una lunghezza d'onda appropriata per il fotoresist, con un modello desiderato, utilizzando una fotomaschera o una litografia senza maschera.
    3. Sviluppare per 40 s in uno sviluppatore, diluito in acqua distillata (DW) secondo le istruzioni del produttore; lavare in DW per 45 s e asciugare con gas azoto UHP. Ispezionare il modello al microscopio ottico.
  2. Deposizione di Sputter
    1. Inserire il campione nella camera principale del sistema di deposizione e attendere la pressione di base (~5 × 10-8 Torr). Aprire il flusso di gas; impostare il flusso argon per lo sputtering standard (28 sccm [cm cubico standard per min) nel presente documento. Accendere i bersagli dello sputter, quindi impostare la pressione dello sputter su 3 mTorr.
    2. Aumentare la potenza su ogni bersaglio fino a raggiungere la velocità desiderata.
      NOTA: Pd Tasso: 0,62 A/s = 1,0 nm in 16 s; Co80Fe20 Tasso: 0,32 A/s, 0,2 nm in 6,25 s.
    3. Attivare la rotazione. Depositare il multistrato FM, alternando gli obiettivi Co80Fe20 e Pd, aprendo e chiudendo rispettivamente le persiane target. Depositare 14 bistrati di Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm) e terminare con un ulteriore livello di tappatura Pd a 2 nm.
    4. Decollo: immergere il campione in acetone per 30 minuti e risciacquare con isopropanolo. Quindi, asciugare con azoto UHP e conservare il campione in un ambiente pulito e asciutto fino all'uso.

2. Caratterizzazione del dispositivo magnetico tramite misurazioni del trasporto

  1. Utilizzare un substrato Si o uno scivolo di vetro con una barra magnetica a forma di croce di 100 μm di larghezza, depositata con multistrati FM (vedere figura 1C inset). Collegare il campione al supporto utilizzando nastro a doppia parte.
  2. Utilizzando un legatore di fili, legare 4 fili al campione, uno su ogni gamba dell'elettrodo incrociato. Impostare il portacampioni e il campione all'interno del sistema di misurazione del trasporto con un campo magnetico in modo che il campo magnetico sia perpendicolare al campione. Eseguire misurazioni a temperatura ambiente.
  3. Eseguire la misurazione della tensione trasversale (VT)del dispositivo; seguire le indicazioni della figura 1C (interno): applicare una corrente di 1 mA tra i contatti 1 e 3; misurare il VT tra i contatti 2 e 4; quindi, applicare una corrente compresa tra 2 e 4 e misurare la tensione tra 1 e 3. Infine, calcolare la differenza tra le tensioni sia delle misurazioni che dividere per 2 per ottenere VT. Utilizzare un sistema di commutazione per passare automaticamente tra le due configurazioni di misurazione.
  4. Spazzare il campo magnetico tra 0,4 T e -0,4 T in gradini di 5 mT e misurare il VT in funzione del campo. Tracciare la resistenza trasversale (VT/I) rispetto al campo magnetico per determinare il segnale anomalo di Hall, che è proporzionale alla magnetizzazione perpendicolare nella pellicola.

3. Caratterizzazione di MNP e multistrati magnetici mediante misurazioni della magnetometria

  1. Misurazione magnetometrica per multistrati FM
    1. Depositare il multistrato FM sul substrato Si (vedere sezione 1.2). Tagliare il campione in 6 quadrati di dimensioni 4 x 4 mm2. Impilare i campioni uno sopra l'altro e disporli nella capsula perpendicolarmente alla direzione del campo magnetico (vedere figura 1D inset).
    2. Inserire la capsula nel magnetometro e misurare la magnetizzazione a temperatura ambiente. Spazzare il campo magnetico tra -0,4 T e 0,4 T.
    3. Calcolare il volume totale del materiale magnetico, considerando lo spessore dello strato magnetico, la dimensione dei campioni e il numero di substrati. Dividere la magnetizzazione per il volume totale del materiale magnetico.
    4. Tracciare la magnetizzazione (per unità di volume) rispetto al campo magnetico. Sottrarre lo sfondo diamagnetico del substrato dall'elevata risposta del campo magnetico ed estrapolare la magnetizzazione di saturazione dell'FM dal grafico.
  2. Misurazione magnetometrica per MNP
    1. Inserire una massa designata di MNP in una capsula polimerica sintetica. Si consideri un volume maggiore se si misurano piccoli valori di saturazione di magnetizzazione.
    2. Se gli MNP sono sospesi in un solvente, asciugare i MNPs lasciando la capsula aperta durante la notte. Inserire la capsula nel magnetometro e misurare la magnetizzazione a temperatura ambiente. Spazzare il campo magnetico tra -0,2 T e 0,2 T.
    3. Calcolare la massa totale degli MNP moltiplicando il volume designato per la concentrazione di particelle. Normalizzare i risultati a 1 g.
    4. Tracciare la magnetizzazione normalizzata (per grammo) rispetto al campo magnetico. Estrapolare la saturazione di magnetizzazione degli MNP dal grafico.

4. Protocollo di rivestimento del collagene

  1. Rivestimento di stoviglie in plastica
    1. Preparare 0,01 M HCl aggiungendo 490 μL di HCl a 500 mL di acqua autoclavata a doppia distillazione (DDW).
      NOTA: Eseguire questo passaggio solo nella cappa chimica.
    2. Diluire il collagene di tipo 1 (soluzione dalla coda del ratto) 1:60-1:80 in 0,01 M HCl per ottenere la concentrazione di lavoro finale di 50 μg/mL. Posizionare 1,5 mL della soluzione diluita in un piatto da coltura da 35 mm. Lasciare il piatto nel cappuccio per 1 h, coperto.
    3. Rimuovere la soluzione e lavare 3 volte in soluzione salina sterile tamponata con fosfato 1x (PBS). Il piatto è pronto per la semina cellulare.
  2. Rivestimento vetrini
    1. Diluire il collagene di tipo 1 (soluzione dalla coda del ratto) 1:50 in 30% v/v etanolo. Per rivestire un piatto da 35 mm, aggiungere 20 μL di collagene a 1 mL di 30% di etanolo.
    2. Coprire il piatto con la soluzione e attendere che tutta la soluzione evapori, lasciando il piatto scoperto per alcune ore. Lavare 3 volte in 1x PBS sterile; lo scivolo di vetro è pronto per la semina cellulare.

5. Assorbimento e vitalità dell'MNP cellulare

  1. Assorbimento cellulare MNP
    1. Preparare il mezzo di crescita di base per la coltura cellulare PC12 aggiungendo il 10% di siero di cavallo (HS), il 5% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina / streptomicina e lo 0,2% di anbrotericina al mezzo Roswell Park Medical Institute (RPMI) e il filtro utilizzando un filtro in nylon da 0,22 μm.
    2. Aggiungere l'1% di siero di cavallo (HS), l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina/streptomicina e lo 0,2% di anbrotericina al mezzo RPMI per preparare il mezzo di differenziazione PC12 e filtrare utilizzando un filtro in nylon da 0,22 μm.
    3. Coltivare cellule in un pallone da coltura non trattato con 10 ml di mezzo di crescita di base; aggiungere 10 ml di mezzo di crescita di base al pallone ogni 2-3 giorni e sotto-coltura le cellule dopo 8 giorni.
    4. Per l'assorbimento cellulare, centrifugare la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga per 8 minuti a 200 × g e temperatura ambiente e scartare il supernatante.
    5. Rimosi le cellule in 3 mL di nuovo mezzo di crescita di base. Ancora una volta, centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 × g e temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimosi le cellule in 3 mL di mezzo di differenziazione fresco.
    6. Aspirare le cellule 10 volte usando una siringa e un ago per rompere i grappoli cellulari. Contare le cellule usando un emocitometro e seminare 106 cellule in un piatto normale non rivestito da 35 mm.
    7. Aggiungere al piatto il volume calcolato della sospensione MNP e il volume del mezzo di differenziazione per ottenere la concentrazione MNP desiderata e il volume totale. Mescolare le celle, gli MNP e il mezzo di differenziazione; incubare il piatto in un incubatore umidificato di CO2 al 5% a 37 °C per 24 ore.
    8. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 × g a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimescolare le cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione fresco e contare le cellule usando un emocitometro.
  2. Differenziazione delle celle caricate da MNP
    1. Eseguire il protocollo di assorbimento (sezione 5.1). Seed 8 × 104 cellule cariche di MNP su un piatto rivestito di collagene di 35 mm in presenza di mezzo di differenziazione (vedi protocollo di rivestimento del collagene nella sezione 4.1). Dopo 24 ore, aggiungere 1:100 fattore di crescita fresco murino beta-nervosa (β-NGF) (concentrazione finale 50 ng/mL).
    2. Rinnovare il mezzo di differenziazione e aggiungere murine β-NGF ogni 2 giorni. Immagini le cellule ogni 2 giorni usando la microscopia ottica. Dopo la formazione della rete (6-8 giorni per le cellule PC12), immaginiamo le cellule usando la microscopia confocale e osservano la fluorescenza delle particelle.
  3. Saggio di vitalità per le cellule cariche di MNP: test di vitalità cellulare 2,3-bis-(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT).
    1. Preparare il mezzo di crescita di base secondo la fase 5.1.1. Coltivare le cellule PC12 con MNP a diverse concentrazioni (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL nel mezzo di crescita di base) e anche senza MNP per il controllo del tripliceto in una piastra piatta da 96 pomp po ' (volume totale di 100 μL / pozzo). Incubare le cellule per 24 ore in un 5% di CO2,incubatore umidificato a 37 °C.
    2. Preparare pozzi vuoti contenenti supporto senza celle per la correzione dello sfondo. Scongelare la soluzione reagente XTT e la soluzione di reazione contenenteN-metile dibenzopirrazina metile solfato) in un bagno di 37 °C immediatamente prima dell'uso. Ruotare delicatamente fino a ottenere soluzioni chiare.
    3. Per una piastra da 96 po' , mescolare 0,1 mL di soluzione di attivazione con 5 mL di reagente XTT. Aggiungere 50 μL della soluzione di reazione ad ogni pozzo, scuotere leggermente la piastra per una distribuzione uniforme del colorante nei pozzi, quindi incubare la piastra in un'incubatrice per 5 ore.
    4. Misurare l'assorbanza del campione rispetto ai pozzi vuoti utilizzando un lettore elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ad una lunghezza d'onda di 450 nm. Misurare l'assorbanza di riferimento utilizzando una lunghezza d'onda di 630 nm e sottrarla dalla misurazione di 450 nm.
    5. Poiché una leggera assorbanza spontanea si verifica nel mezzo di coltura incubato con il reagente XTT a 450 nm, sottrarre l'assorbanza media dei pozzi vuoti da quella degli altri pozzi. Sottrarre i valori del segnale da campioni paralleli di MNP alle stesse concentrazioni testate dei campioni di cellule.
  4. Test di vitalità per celle caricate con MNP: test di vitalità cellulare basato sulla resazurina
    1. Preparare il mezzo di crescita di base secondo il passaggio 5.1.1. Coltivare le cellule PC12 con MNP a diverse concentrazioni (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL nel mezzo di crescita di base) e senza MNP come controllo in triplice copia in una piastra piatta da 96 po'per 24 ore. Incubare le cellule per 24 ore in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. Preparare pozzi vuoti contenenti mezzo senza celle.
    2. Lavare le celle con 1x PBS. Aggiungere il reagente a base di resazurina (10% w/v) al mezzo e incubare per 2 ore in un incubatore a 37 °C.
    3. Posizionare 150 μL di aliquote dei campioni nel lettore ELISA e misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 560 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm. Sottrarre i valori del segnale dai campioni paralleli di MNP alle stesse concentrazioni testate dei campioni di cellule.

6. Caratterizzazione della concentrazione di MNP all'interno delle cellule utilizzando plasma accoppiato induttivamente (PIC)

  1. Preparare il mezzo di crescita di base secondo il passaggio 5.1.1. Coltivare le cellule PC12 con MNP a diverse concentrazioni (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL nel mezzo di crescita di base) e senza MNP come controllo in triplice copia in una piastra piatta da 96 po '(volume totale di 100 μL /pozzo). Incubare in un 5% di CO2,incubatore umidificato a 37 °C per 24 ore.
  2. Trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga (da ogni pozzo separatamente), centrifugare le celle a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimescolare le cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione fresco e contare le cellule usando un emocitometro.
  3. Lenire le cellule per trattamento con 100 μL di acido nitrico al 70% per ogni pozzo separatamente per almeno 15 minuti. Aggiungere 5 mL di DDW alle celle lysed e filtrare le soluzioni.
  4. Misurare la concentrazione di ferro utilizzando ICP e utilizzare il conteggio delle cellule per registrare la concentrazione di Fe per cella.

7. Differenziazione cellulare e crescita su piattaforma magnetica

  1. Pulire il substrato modellato con 70% v/v/ etanolo e posizionare il substrato in un piatto di coltura da 35 mm nel cappuccio. Posizionare un grande magnete (~1500 Oe) sotto il substrato modellato per 1 minuto e rimuovere il magnete spostando prima il piatto su e lontano dal magnete, quindi estraere il magnete dal cappuccio. Accendere la luce ultravioletta per 15 minuti.
  2. Rivestire il substrato con collagene di tipo 1 secondo la sezione 4.2. Sospendere le cellule dopo l'assorbimento cellulare di MNP (sezione 5.1), seminare 105 cellule in un piatto di coltura da 35 mm e aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura in un 5% di CO2,incubatore umidificato a 37 °C.
  3. Dopo 24 ore, aggiungere 1:100 murine fresco β-NGF (concentrazione finale di 50 ng/mL). Rinnovare il mezzo di differenziazione e aggiungere murine β-NGF ogni 2 giorni. Immagini le cellule ogni 2 giorni utilizzando la microscopia ottica e, dopo la formazione della rete, esegui l'immunostaining sulle cellule (sezione 8.1).

8. Colorazione delle celle caricata da MNP

  1. Immunostaining di tubulina
    1. Preparare la soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% mescolando 10 mL di soluzione PFA 16% con 16%, 4 mL di PBS 10x e 26 mL di DDW. Preparare 50 mL di 1% di PBT aggiungendo 500 μL di un tensioattiva non ionico a 50 mL di 1x PBS. Preparare 50 mL di 0,5% di PBT mescolando 25 mL di 1% di PBT con 25 mL di 1x PBS. Preparare la soluzione di blocco mescolando l'1% di albumina di siero bovino e l'1% di siero d'asino normale nello 0,25% di PBT.
      NOTA: Utilizzare PFA solo all'interno della cappa chimica.
    2. Rimuovere il supporto supernatante dalle celle. Fissare le celle caricate con MNP in PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente all'interno di una cappa chimica. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1x PBS, 5 min ciascuna lavaggio, all'interno di una cappa chimica.
    3. Permeabilizzare le celle cariche di MNP con 0,5% di PBT per 10 minuti. Incubare le cellule cariche di MNP prima in soluzione di blocco per 45 minuti a temperatura ambiente e poi con anticorpo anti- α-tubulina di coniglio in soluzione di blocco durante la notte a 4 °C. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1 PBS, 5 min ciascuna di lavaggio.
    4. Incubare le cellule cariche di MNP con anticorpi secondari anti-coniglio dell'asino coniugato Cy2 per 45 minuti nell'oscurità e a temperatura ambiente. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1 PBS, 5 min ciascuna lavaggio.
    5. Eseguire l'imaging confocale. Per la tubulina, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 492 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 510 nm. Per gli MNP (rodiammina), utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 578 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 613 nm.
  2. Colorazione nucleare con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)
    1. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1 PBS, 5 min ciascuna lavaggio. Rimuovere il liquido in eccesso intorno al campione, aggiungere 1 goccia (~50 μL) di mezzo di montaggio contenente DAPI per coprire un'area di 22 mm x 22 mm e incubare per 5 minuti nell'oscurità e a temperatura ambiente.
    2. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1 PBS, 5 min ciascuna lavaggio. Eseguire l'imaging confocale. Per DAPI, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 358 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 461 nm. Per gli MNP (rodiammina), utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 578 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 613 nm.

9. Misure e analisi statistiche

  1. Analisi morfometrica della differenziazione cellulare caricata da MNP
    1. Per misurare il numero di intersezioni a varie distanze dal corpo cellulare, acquisire immagini di fase di cellule coltivate fino a 3 giorni dopo il trattamento con NGF.
      NOTA: Se fatte in seguito, le celle possono sviluppare reti, impedendo misurazioni della risoluzione a cella singola.
      1. Aprire le immagini nel programma di elaborazione delle immagini ImageJ e utilizzare il plug-in NeuronJ, che consente un tracciamento semiautomatico della neurite e la misurazione dellalunghezza 36. Utilizzando il plug-in tracciante neurite, tracciate le neurite e convertite i dati in immagini binarie. Definire il centro del soma.
      2. Eseguire l'analisi sholl, disponibile nel plug-in NeuronJ. Definite il raggio massimo. Ripeti l'esperimento tre volte. Analizza più di 100 cellule in ogni esperimento.
  2. Analisi della localizzazione cellulare
    1. Per determinare la percentuale di cellule localizzate sull'area magnetica dopo 3 giorni di incubazione, acquisire immagini microscopiche confocali di cellule con e senza assorbimento MNP. Utilizzare la colorazione DAPI (sezione 8.2).
    2. Contare manualmente le celle in cima o parzialmente in cima al modello (toccando le celle) e le celle che non lo sono. Ripetere per tre esperimenti. Analizzare più di 400 celle con MNP e senza assorbimento.
    3. Calcolare la proporzione relativa delle celle che si trovano in cima ai modelli magnetici dal numero totale di celle, con e senza MNP. Inoltre, calcolare la percentuale dell'area effettiva del modello magnetico aggiungendo il diametro del corpo cellulare alla larghezza del modello per determinare la probabilità casuale che le cellule affioro su un modello magnetico.
    4. Eseguire un singolo test Zcampione per analizzare se la distribuzione cellulare è il risultato dell'atterraggio di cellule isotrope, o se c'è una distorsione preferita al modello magnetico.
  3. Analisi della direzionalità della crescita
    1. Per quantificare l'effetto sulla direzionalità della crescita della neurite, acquisire immagini microscopiche confocali delle cellule con e senza trattamento MNP dopo 8 giorni di incubazione. Eseguire la colorazione immuno (sezione 8.1).
    2. Utilizzando il software ImageJ, misurare l'angolo tra la neurite cellulare e le strisce magnetiche in entrambe le condizioni.
      NOTA: Analizza solo i neuriti che provengono da soma situati sulle strisce magnetiche.
    3. Tracciare la distribuzione degli angoli dei neuriti rispetto alla direzione delle strisce (Δθ). Eseguire un test chi quadrato della distribuzione di Δθ per dimostrare che la distribuzione non è normale o uniforme.

Risultati

Sono state fabbricate piattaforme magnetiche con diverse forme geometriche(Figura 1A). I modelli magnetici sono stati depositati sputtering: 14 multistrati di Co80Fe20 e Pd, rispettivamente 0,2 nm e 1 nm. La microscopia elettronica ha rivelato che l'altezza totale dei modelli magnetici è di ~18 nm (Figura 1B). Questa esclusiva deposizione multistrato FM crea una piattaforma stabile con anisotropia di magnet...

Discussione

I risultati rappresentativi dimostrano l'efficacia della metodologia presentata per il controllo e l'organizzazione della formazione della rete neuronale su scala micron. Le celle PC12 caricate da MNP rimasero vitali e furono trasformate in unità sensibili magnetiche che furono attratte dalle forze magnetiche dagli elettrodi FM a siti specifici. Ciò è dimostrato al meglio nella figura 5C, dove le cellule hanno aderito preferenzialmente ai vertici più grandi degli esagoni e non alle linee...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta dal Ministero della Scienza & Tecnologia, Israele, e dalla Israeli Science Foundation (569/16).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6-well cell culture plateFALCON353846
96-well cell culture plateSPL life sciences30096
Amphotericin B solutionBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H photoresistMicroChemicals GmbH
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA)Biological Industries03-010-1B
Cell and Tissue cultur flaskBiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dishGreiner Bio-One627-16035 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based)Biological Industries20-300-1000
Centrifuge tubeBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% sputter targetACI Alloys99.95%
Collagen type ICorning Inc.354236Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Disposable needleKDL23 G
Disposable  syringeMedispo116022764010 mL
Donor horse serumBiological Industries04-124-1A
ELISA readerMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated)Biolab-chemicals52505
Fetal bovine serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
Fresh murine β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame electromagnet .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measureKeithley2400
Keithley switching systemKeithley3700
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Light microscopeLeicaDMIL LED
Maskless photolithographyHeidelberg Inst.MLA150
Microscope SlidesBAR-NAORBN1042000C
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich438073
Normal donkey serum (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 cell lineATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solutionBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagentMolecular probesA-13261resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulinSanta Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering systemOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamineBiological Industries01-100-1A
Sonication bathKUDOSSK3210HPFrequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometerQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

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