RNA polimerasi legata al DNA per la trascrizione in vitro programmabile e il calcolo molecolare

Riepilogo

Descriviamo l'ingegneria di una nuova T7 RNA polimerasi legata al DNA per regolare le reazioni di trascrizione in vitro. Discutiamo i passaggi per la sintesi e la caratterizzazione proteica, convalidiamo la regolazione trascrizionale proof-of-concept e discutiamo le sue applicazioni nel calcolo molecolare, nella diagnostica e nell'elaborazione delle informazioni molecolari.

Abstract

La nanotecnologia del DNA consente l'autoassemblaggio programmabile degli acidi nucleici in forme e dinamiche prescritte dall'utente per diverse applicazioni. Questo lavoro dimostra che i concetti della nanotecnologia del DNA possono essere utilizzati per programmare l'attività enzimatica della T7 RNA polimerasi derivata dai fagi (RNAP) e costruire reti di regolazione genica sintetica scalabili. In primo luogo, un RNAP T7 legato all'oligonucleotide viene ingegnerizzato tramite l'espressione di un RNAP con tag SNAP N-terminale e il successivo accoppiamento chimico del tag SNAP con un oligonucleotide modificato con benzilguanina (BG). Successivamente, lo spostamento del filamento di acido nucleico viene utilizzato per programmare la trascrizione della polimerasi su richiesta. Inoltre, gli assemblaggi di acidi nucleici ausiliari possono essere utilizzati come "fattori di trascrizione artificiale" per regolare le interazioni tra l'RNAP T7 programmato dal DNA con i suoi modelli di DNA. Questo meccanismo di regolazione della trascrizione in vitro può implementare una varietà di comportamenti circuitali come la logica digitale, il feedback, la cascata e il multiplexing. La componibilità di questa architettura di regolazione genica facilita l'astrazione, la standardizzazione e il ridimensionamento del design. Queste caratteristiche consentiranno la prototipazione rapida di dispositivi genetici in vitro per applicazioni quali il biorilevamento, il rilevamento di malattie e l'archiviazione dei dati.

Introduzione

Il calcolo del DNA utilizza un insieme di oligonucleotidi progettati come mezzo per il calcolo. Questi oligonucleotidi sono programmati con sequenze per assemblarsi dinamicamente secondo la logica specificata dall'utente e rispondere a specifici input di acido nucleico. Negli studi proof-of-concept, l'output del calcolo consiste tipicamente in un insieme di oligonucleotidi marcati fluorescentemente che possono essere rilevati tramite elettroforesi su gel o lettori di piastre di fluorescenza. Negli ultimi 30 anni sono stati dimostrati circuiti computazionali del DNA sempre più complessi, come varie cascate di logica digitale, reti di reazioni chimiche e reti neurali

Protocollo

1. Preparazione del buffer

NOTA: la preparazione del tampone di purificazione delle proteine può avvenire in qualsiasi giorno; qui, è stato fatto prima di iniziare gli esperimenti.

1. Preparare un tampone di lisi/equilibrazione contenente 50 mM di tris (idrossimetil)amminometano (Tris), 300 mM di cloruro di sodio (NaCl), 5% di glicerolo e 5 mM di β-mercaptoetanolo (BME), pH 8. Aggiungere 1,5 mL di 1M Tris, 1,8 mL di 5M NaCl, 1,5 mL di glicerolo, 25,2 mL di acqua deionizzata (ddH₂O) in un tubo centrifugo da 50 mL e aggiungere 10,5 μL di 14,2 M BME appena prima dell'uso.
   NOTA: Tris può causare tossicità acuta; quindi, evi....

Risultati

Figura 5: Analisi SDS-PAGE dell'espressione di SNAP T7 RNAP e test di trascrizione in vitro. (A) Analisi di purificazione della proteina SNAP T7 RNAP, peso molecolare SNAP T7 RNAP: 119.4kDa. FT = flusso dalla colonna, W1 = frazioni di eluizione del tampone di lavaggio contenente impurità, E1-3 = frazioni di eluizione contenenti prodotto puri.......

Discussione

Questo studio dimostra un approccio ispirato alla nanotecnologia del DNA per controllare l'attività della T7 RNA polimerasi accoppiando covalentemente un RNAP T7 ricombinante N-terminale con tag SNAP con un oligonucleotide funzionalizzato BG, che è stato successivamente utilizzato per programmare reazioni TMDSD. In base alla progettazione, lo SNAP-tag è stato posizionato al N-terminus della polimerasi, poiché il C-terminus del wild-type T7 RNAP è sepolto all'interno del nucleo della struttura proteica e stabilisce i.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)	BioShop	TWN510.5
0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio Basic	SD8135
10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)	Bio Basic	PD0435	Tablets used to make 10 mM buffer
10% ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678-100G
100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Fisher Scientific	UFC910008
100% acetone	Fisher Chemical	A18P4
100% ethanol (EtOH)	House Brand	39752-P016-EAAN
10x in vitro transcription (IVT) buffer	New England Biolabs	B9012
10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer	Bio Basic	A0026
1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I5502-1G
1M sodium bicarbonate buffer	Sigma Aldrich	S6014-500G
1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma Aldrich	648311-1KG
1X Tris-EDTA (TE) buffer	ThermoFisher	12090015
2M imidazole	Sigma Aldrich	56750-100G
2-mercaptoethanol (BME)	Sigma Aldrich	M3148
3M sodium acetate	Bio Basic	SRB1611
40% acrylamide (19:1)	Bio Basic	A00062
4x LDS protein sample loading buffer	Fisher Scientific	NP0007
5M sodium chloride (NaCl)	Bio Basic	DB0483
5mM dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43815-1G
6x gel loading dye	New England Biolabs	B7024S
agarose B powder	Bio Basic	AB0014
BG-GLA-NHS	New England Biolabs	S9151S
BL21 competent E. coli	Addgene	C2530H
BLUeye prestained protein ladder	FroggaBio	PM007-0500
bromophenol blue	Bio Basic	BDB0001
coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)	ThermoFisher	LC6060
cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)	Fisher Scientific	S11494
cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)	Fisher Scientific	S33102
dry dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D12345
formamide	Sigma Aldrich	F9037-100ML
glycerol	Bio Basic	GB0232
kanamycin sulfate	BioShop	KAN201.5
lysogeny broth	Sigma Aldrich	L2542-500ML
malachite green oxalate	Sigma Aldrich	2437-29-8
N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281-25ML
NuPAGE MES SDS running buffer (20x)	Fisher Scientific	LSNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well	Life Technologies	NP0322BOX
oligonucleotide (cage antisense)	IDT	N/A	TATAGTGAGTCGTATTAATTTG
oligonucleotide (cage sense)	IDT	N/A	TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA
oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)	IDT	N/A	GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT
oligonucleotide (malachite green aptamer sense)	IDT	N/A	TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC
oligonucleotide (Transcription Factor A)	IDT	N/A	AGTACACCAACTACGAGTGAG
oligonucleotide (Transcription Factor B)	IDT	N/A	TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG
oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether)	IDT	N/A	GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/
Pierce strong ion exchange spin columns	Fisher Scientific	90008
plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes	Genscript	N/A	custom gene insert
protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)	Fisher Scientific	88226
rNTP mix	New England Biolabs	N0466S
Roche mini quick DNA spin column	Sigma Aldrich	11814419001
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100ML
Ultra Low Range DNA ladder	Fisher Scientific	10597012
urea	BioShop	URE001.1