Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Riepilogo

L'ozono combinato e i topi esposti all'endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l'interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l'aumento dell'espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l'angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.

Abstract

I polmoni si trovano continuamente di fronte a insulti diretti e indiretti sotto forma di condizioni infiammatorie sterili (particelle o tossine reattive) e infettive (batteriche, virali o fungine). Una risposta ospite travolgente può comportare respirazione compromessa e lesioni polmonari acute, che è caratterizzata dal reclutamento di neutrofili polmonari a seguito della risposta immunitaria, coagulativa e rimodellante dei tessuti dell'ospite pato-logico. Metodi microscopici sensibili per visualizzare e quantificare gli adattamenti cellulari polmonari murini, in risposta all'ozono a basse dosi (0,05 ppm), un potente inquinante ambientale in combinazione con lipopolysaccharide batterico, un agonista TLR4, sono cruciali per comprendere i meccanismi infiammatori e riparatori dell'ospite. Descriviamo un'analisi microscopica fluorescente completa di vari compartimenti polmonari e sistemici del corpo, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare, il perfusato vascolare polmonare, le criosezioni polmonari sinistra e il perfusato di midollo osseo sternale. Mostriamo danni di macrofagi alveolari, neutrofili, tessuto parenchimico polmonare, così come cellule del midollo osseo in correlazione con una risposta immunitaria ritardata (fino a 36-72 ore) che è contrassegnata da gradienti discreti di chemiochina nei compartimenti analizzati. Inoltre, presentiamo la matrice extracellulare polmonare e le interazioni citoscheletriche cellulari (actina, tubulina), specie di ossigeno mitocondriale e reattivo, plasminogeno antico coagulativo, angiostatina del frammento peptidico anti-angiogenico, subunità V complesso mitocondriale di ATP sintasi, α e β. Questi marcatori surrogati, se integrati con adeguati saggi a base cellulare in vitro e tecniche di imaging animale in vivo come la microscopia intravitale, possono fornire informazioni vitali per comprendere la risposta polmonare a nuovi agenti immunomodulatori.

Introduzione

La lesione polmonare acuta (ALI) è una risposta patologica cruciale dei polmoni a stimoli infettivi o altri stimoli dannosi che è contrassegnata dall'attivazione simultanea di sistemi immunitari coagulativi, fibrinolitici e innati¹. I neutrofili percepisce prontamente modelli di danni microbici e intracellulari attraverso la famiglia di recettori simili a pedaggio (TLR)^2,3,4. I neutrofili rilasciano citochine preformate e contenuti di granuli citotossici, che possono quindi causare danni collaterali ai tessuti. Il conseguente danno alveolare è rovinato....

Protocollo

Il progetto dello studio è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca sugli animali dell'Università del Saskatchewan e ha aderito alle linee guida del Canadian Council on Animal Care per l'uso umano degli animali. Sono stati acquistati topi maschi di sei-otto settimane C57BL/6J. NOTA: Eutanasia di tutti gli animali che sviluppano letargia grave, angoscia respiratoria o altri segni di grave disagio prima del punto finale programmato.

NOTA: Preparare quanto segue: 27-18 G smussato con ago (dipenderà dal diametro del tracheale del mouse), tubi in PE di dimensioni appropriata per adattarsi all'ago smussato (fare una cannula PE per ogni t....

Risultati

L'esposizione combinata A₃ e LPS porta all'infiammazione sistemica e alla mobilizzazione del midollo osseo a 72 ore: il numero di cellule in diversi compartimenti ha rivelato cambiamenti significativi nel sangue periferico e nel midollo osseo del femore il conteggio totale delle cellule su esposizioni combinate O₃ e LPS. Sebbene le_esposizioni combinate O 3 e LPS non inducano a variazioni nel numero totale di cellule BAL (

Discussione

I metodi presentati nello studio attuale evidenziano l'utilità dell'analisi a compartimento multiplo per studiare più eventi cellulari durante l'infiammazione polmonare. Abbiamo riassunto i risultati della tabella 2. Noi e molti laboratori abbiamo studiato ampiamente la risposta murina all'instillazione intranasale LPS, che è segnata dal rapido reclutamento di neutrofili polmonari, che raggiunge picchi tra 6-24 ore dopo di che, la risoluzione prende il via. E recentemente, abbiamo dimostrato che il su.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
33-plex Bioplex chemokine panel	Biorad	12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin	Invitrogen	A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Confocal laser scanning microscope	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	D1306	aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope	Olympus	Olympus IX83
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	100 mg/ml	Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Reduced mitotracker orange	Invitrogen	M7511
Xylazine (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock