Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Riepilogo

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Abstract

L'aggregazione proteica è un segno distintivo di disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SSS), il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Huntington (MH) e così via. Per rilevare e analizzare oligomeri o aggregati proteici solubili o diffusi, è stata utilizzata la spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), in grado di rilevare la velocità di diffusione e la luminosità di una singola particella con una singola sensibilità molecolare. Tuttavia, la procedura e il know-how adeguati per il rilevamento dell'aggregazione proteica non sono stati ampiamente condivisi. Qui, mostriamo una procedura standard di misurazione FCS per le proprietà di diffusione delle proteine soggette a aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive: frammento carbossile-terminale associato alla SLA di DNA/proteina legante l'RNA 43 kDa (TDP25) e superossido dismutasi 1 (SOD1). I risultati rappresentativi mostrano che una parte degli aggregati di TDP25 taggato da proteine fluorescenti verdi (GFP) è stata leggermente inclusa nella frazione solubile del neuroblastoma murino Neuro2a cell lysate. Inoltre, sod1 con tag GFP che trasporta mutazioni associate alla SS mostra una diffusione più lenta nelle cellule vive. Di conseguenza, qui introduciamo la procedura per rilevare l'aggregazione proteica attraverso la sua proprietà di diffusione utilizzando FCS.

Introduzione

Le aggregazioni proteiche che coinvolgono disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, il morbo di Huntington e^{così via sono note} per essere tossiche e disturberebbero l'omeostasi proteica (proteostasi) nelle cellule e negli organi, che potrebbe quindi portare all'invecchiamento². La clearance dell'aggregazione proteica è prevista come strategia terapeutica; tuttavia, non sono ancora state stabilite sostanze chimiche che impediscono la formazione di aggregazione proteica e degradano aggregati proteici (ad esempio, piccole molecole o farmaci). Inoltre, il modo in cui l'aggregazione proteica esercita la tossicità rimane inafferrabile. Pertanto, per promuovere progetti di ricerca relativi all'aggregazione proteica, è importante introdurre procedure ad alta produttività per rilevare semplicemente l'aggregazione proteica. Il rilevamento dell'aggregazione proteica utilizzando anticorpi che riconoscono la conformazione dell'aggregazione proteica e del colorante fluorescente specifico dell'aggregazione è stato^{ampiamente utilizzato 3}. Tuttavia, è difficile rilevare l'aggregazione, specialmente nelle cellule vive che utilizzano tali procedure classiche.

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è una procedura per rilevare l'aggregazione proteica e il cambiamento strutturale. Tuttavia, fret non è in grado di analizzare la dinamica proteica (ad esempio, diffusione e oligomerizzazione delle proteine nelle cellule vive)³. Pertanto, introduciamo qui un semplice protocollo per rilevare l'aggregazione proteica in soluzione (ad esempio, lisato cellulare) e cellule vive utilizzando spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), che misura la proprietà di diffusione e la luminosità delle molecole fluorescenti con sensibilità a singola^{molecola 4}. FCS è un metodo di conteggio dei fotoni utilizzando un microscopio confocale a scansione laser (LSM). Utilizzando un rivelatore di fotoni altamente sensibile e il calcolo della funzione di autocorrelazione (ACF) del tempo di arrivo del fotone, viene misurato il passare attraverso il tempo e la luminosità delle molecole fluorescenti nel volume di rilevamento. La diffusione rallenta con un aumento del peso molecolare; pertanto, l'interazione intermolecolare può essere stimata utilizzando FCS. Ancora più potentemente, un aumento della luminosità della molecola fluorescente indica l'omo-oligomerizzazione delle molecole. Pertanto, FCS è un potente strumento per rilevare tale aggregazione proteica.

Protocollo

1. Materiali e reagenti

1. Utilizzare soluzioni e mezzi pirogenici liberi per la coltura cellulare(tabella 1).
2. Preparare soluzioni per l'esperimento biochimico utilizzando acqua ultrapura e utilizzare come privo di DNasi/RNasi.
3. Selezionare un FBS appropriato per le impostazioni cultura delle celle con un processo di controllo del lotto. Poiché il lotto FBS selezionato cambia regolarmente, il catalogo e il numero di lotto per FBS non possono essere rappresentati qui.
4. DNA plasmide
   1. Preparare pmeGFP-N1^{5 per l'espressione} monomero eGFP; pmeGFP-C1-TDP25^{6 per} l'espressione GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R^{7 per} l'espressione SOD1-G85R-GFP; e pCAGGS⁸ come vettore.
      NOTA: il meGFP è una variante monomerica che porta la mutazione A206K della GFP potenziata (eGFP). TDP25 è un frammento di terminale C associato alla SS del TDP-43. SOD1-G85R è un mutante associato alla SS di SOD1.
5. Ceppo cellulare
   1. Utilizzare cellule neuroblastoma neuro2a murine.
      NOTA: Le cellule Neuro2a hanno un'elevata efficienza di trasfezione e proteine esogene altamente esplicite. Per l'espressione di TDP25, sono necessari ceppi cellulari con elevate efficienze di espressione come le cellule Neuro2a o HEK293. Nelle cellule HeLa, TDP25 non è stato in grado di essere espresso in modo efficiente.

2. Coltura cellulare e trasfezione

1. Preparare un piatto di plastica da 100 mm che coltiva cellule Neuro2a semi-confluenti nel normale mezzo di crescita.
   NOTA: È necessario incubare a 37 °C per circa 48-72 ore dopo la semina precedente fino al raggiungere la semi-confluenza.
2. Rimuovere il supporto.
3. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di tripside-EDTA nel piatto di coltura cellulare e incubarli a 37 °C per 1 min.
4. Aggiungere 9,5 mL di mezzo di crescita normale nel piatto e sospendere le cellule staccate.
5. Usando Trypan blue per macchiare le celle morte, contare il numero di celle utilizzando un contatore di celle o manualmente. Quindi diluire le cellule nel mezzo di coltura (1,0 × 10⁵/mL).
6. Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare in un piatto di plastica da 35 mm per la lisi cellulare o in una base di vetro per la misurazione delle cellule vive.
7. Incubare il piatto a 37 °C per 1 giorno.
8. Iniziare i seguenti preparativi 15 minuti prima del giorno della trasfezione.
9. Preparare due tubi da 1,5 ml e aggiungere 100 μL di Opti-MEM I a ciascun tubo.
10. Nel primo tubo, mescolare 1,0 μg di DNA plasmide (soluzione A). Nel secondo tubo, mescolare 2,5 μL di lipofectamina 2000 (soluzione B).
    NOTA: Per mantenere l'efficienza di trasfezione, mantenere la quantità totale di DNA uguale. Per ridurre il livello di espressione per la misurazione FCS nelle cellule vive, la quantità frazionata di DNA plasmide per l'espressione proteica dovrebbe diminuire (ad esempio, 0,2 μg di pmeGFP-N1-SOD1-G85R e 0,8 μg di miscela pCAGGS). Inoltre, mantenere lo stesso rapporto tra il volume di Lipofectamina 2000 e la quantità di DNA plasmide.
11. Mescolare delicatamente la soluzione A e B aggiungendone una in entrambi i tubi, quindi incubarla per 1 minuto a temperatura ambiente (soluzione C).
12. Aggiungere la soluzione C al supporto di coltura; e incubare le cellule per 24 ore a 37 °C.

3.Lisi cellulare e scambio medio

1. Controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio di routine.
2. Rimuovere il mezzo nel piatto.
3. Aggiungere 2 mL di PBS a 25 °C per lavare il mezzo. Rimuovere il PBS.
4. Posizionare il piatto su una piastra di alluminio sopra il ghiaccio schiacciato.
   NOTA: Utilizziamo una piastra di alluminio spessa 1 mm tagliata in un negozio di utensili domenicale o disponibile in commercio come attrezzatura da laboratorio.
5. Aggiungere 200 μL di tampone dilisi a 4 °C. Agitare leggermente il piatto in modo che il tampone sia distribuito uniformemente nella parte inferiore del piatto.
6. Raschiare il piatto utilizzando un raschietto cellulare e recuperare il lisato con detriti cellulari non dissolti in un nuovo tubo da 1,5 ml.
7. Centrifugare la soluzione a 20.400 x g per 5 minuti a 4 °C.
8. Recuperare il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 ml e tenerlo a 4 °C o sul ghiaccio.
   NOTA: Non congelare il lisato.
9. Per le misurazioni delle cellule vive, sostituire il supporto prima della misurazione. Controllare l'attacco cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Confermare l'espressione utilizzando un microscopio a fluorescenza.

4. Calibrazione della spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS)

1. Avviare il sistema ed eseguire il software operativo. Accendere il laser Argon⁺ (458/477/488/514 nm). Stabilizzare il sistema almeno per 30 minuti.
2. Impostare il percorso ottico: Splitter fascio principale: HFT488; Specchio dicroico: NFT600; Filtro barriera a fluorescenza: filtro passa banda 505-540 (BP505-540); Rivelatore: fotodiodo valanghe (APD)).
3. Impostare la dimensione del foro stenopeica inserendo direttamente il valore (66 μm; 1 unità ariosa).
4. Aggiungere la soluzione Rhodamine 6G (Rh6G) in un pozzo della camera di vetro di copertura sul palco.
5. Aggiungere l'acqua ultrapura ad immersione sull'obiettivo. Non utilizzare l'olio ad immersione.
6. Impostare la camera sul palco del microscopio. Spostare il palco nella posizione appropriata.
7. Concentrati sulla superficie superiore del vetro misurando la luce diffusa dalla superficie del vetro. Dopo aver abbassato l'obiettivo verso il basso, ruotare la manopola di messa a fuoco in senso orario per regolare.
   NOTA: Controllare la direzione di rotazione della manopola di messa a fuoco perché è opposta tra quelle realizzate in Giappone e Germania.
8. Sollevare il punto focale 200 μm sopra la superficie superiore del vetro per osservare l'interno della soluzione.
9. Fare clic sulla frequenza di conteggio e monitorare la frequenza di conteggio dei fotoni.
10. Aumentare gradualmente il valore aotf (acousto-optic tunable filters) (ad esempio, trasmissione laser ad eccitazione) in modo che il valore della velocità di conteggio sia superiore a 10 kHz.
11. Fate clic sulla regolazione del foro stenopeica e aprite la procedura guidata di regolazione del foro stenopeica. Trova la posizione del foro stenopeica con il numero più alto (un picco) di fotoni sia nell'asse x che in quello y.
12. Ruotare l'anello di correzione della lente oggettiva in modo che il valore di conteggio per molecola (CPM) sia il più alto.
    NOTA: Poiché lo spessore del vetro di copertura della camera qui specificato è di 0,12-0,17 mm, l'anello di correzione è intorno al suo minimo o a pochi giri da esso, dove il CPM è al massimo.
13. Diminuire gradualmente il valore AOTF in modo che il valore CPM diventi 2-3 kHz.
14. Acquisire la funzione di autocorrelazione (ACF) di Rh6G per 90 s.
15. Una volta completata la misurazione, fate clic su Adatta (Fit) per eseguire l'analisi del raccordo a curva.
16. Selezionate un modello per la diffusione tridimensionale (3D) un componente con uno stato di tripletta.
    NOTA: Il Rh6G è monodisperso e diffuso monocomponente con uno stato di tripletta.
17. Impostare l'ora di inizio del raccordo spostando la linea rossa. Fate clic su Adatta tutto (Fit All) e selezionate la deviazione di adattamento. Dopo aver eseguito il raccordo a curva, assicurarsi che il tempo di diffusione (DT) e il parametro di struttura (SP) siano approssimativamente nell'intervallo di 20-30 μs e 4-8, rispettivamente.
18. Ricordare il valore del parametro strutturale. Utilizzare il valore SP per l'analisi del raccordo a curva di tutti gli ACL misurati lo stesso giorno, nelle stesse condizioni ottiche, e utilizzando lo stesso tipo di base in vetro o vetro di copertura a camera impostato sullo stadio del microscopio.

5. Misurazione FCS nel llysato cellulare

1. Preparare i lire cellulari (vedi sopra).
2. Posizionare il llysate sulla camera di vetro di copertura. Posizionare un coperchio per evitare l'asciugatura e il coperchio del palco per un'ombreggiatura leggera.
3. Impostare le condizioni di acquisizione, la potenza del laser, il tempo di misurazione e le ripetizioni.
4. Fare clic su Count rate e regolare il valore AOTF del laser in modo che il valore CPM diventi più di 1 kHz.
5. Eseguire una misurazione di prova per 1 minuto. Verificare se l'ACF calcolato mostra un'ampiezza positiva e un decadimento liscio.
6. Eseguire la misurazione principale per 5 minuti.
   NOTA: Il tempo totale di misurazione viene gradualmente aumentato fino a quando la forma dell'ACF non cambia anche se il tempo di misurazione è aumentato.
7. Fate clic su Adatta (Fit) per eseguire l'analisi del raccordo curva.
8. Selezionate un modello per la diffusione 3D a due componenti con uno stato di tripletta. Ricordarsi di immettere il valore SP e modificarne l'impostazione su "Fisso" non "Libero" prima di fare clic su Adatta tutto.
9. Esportare la tabella adattata come file di testo delimitato da tabulazioni.
10. Se necessario, esportare il record ACF e Count rate come file di testo delimitato da tabulazioni.

6. Misurazione FCS nelle cellule vive

1. Sostituire il mezzo con uno fresco prima della misurazione.
2. Utilizzare un incubatore di palcoscenico termico. Impostare il piatto di coltura cellulare sul palco del microscopio.
3. Confermare la messa a fuoco e la posizione utilizzando la micropia confocale. Selezionare la cella di misura. Ingrandire e regolare la posizione della cella. Acquisire immagini a fluorescenza di una cella che esprime GFP utilizzando la modalità di velocità di scansione lenta.
4. Selezionare una posizione di misurazione FCS utilizzando Posizione nella sezione "FCS".
5. Selezionare almeno un punto di misurazione FCS utilizzando un mirino (Figura 1).
6. Misurare l'ACF per 1 min.
   NOTA: Poiché le proteine fluorescenti tendono ad essere fotolicenza nelle cellule vive a causa del movimento lento rispetto alla soluzione, il tempo di misurazione dovrebbe essere minimo. È generalmente difficile ottenere ACF nella cellula senza intoppi come le misurazioni della soluzione perché la misurazione prolungata porterà al fotoblesaggio delle proteine fluorescenti.
7. Fate clic su Adatta (Fit) per eseguire l'analisi del raccordo di curva utilizzando un modello per la diffusione 3D a due componenti con uno stato di tripletta.
   NOTA: Per le misurazioni delle cellule vive, un modello per la diffusione 3D a due componenti con uno stato di tripletta sarebbe migliore perché è empiricamente difficile ridurre il valore chi quadrato con un modello di diffusione 3D a un componente a causa dell'esistenza di vari componenti mobili nella cella viva. Ma anche utilizzando un modello per la diffusione 3D a tre componenti, i componenti di diffusione di solito non sono separati rispetto all'utilizzo del modello per due componenti.

Risultati

Abbiamo eseguito la misurazione FCS di GFP-TDP25 in lisato cellulare e SOD1-G85R-GFP in cellule vive. In entrambi i casi, è stato possibile acquisire un'ampiezza positiva e aFS lisci. Abbiamo dimostrato che una porzione di GFP-TDP25 espressa in cellule Neuro2a è stata recuperata nella frazione solubile nella condizione indicata⁶. Nella frazione solubile del lisato cellulare, molecole di fluorescenza estremamente luminose sono state rilevate nel record di velocità di conteggio dei fotoni utilizz...

Discussione

Per quanto riguarda la taratura del sistema prima delle misurazioni, devono essere utilizzate le stesse vetrerie utilizzate per misurare il campione (ad esempio, la camera di vetro di copertura a 8 pozzi per il lisato cellulare e la base in vetro da 35 mm per celle vive). A causa dell'adsorbimento di Rh6G sul vetro, la sua concentrazione effettiva può talvolta diminuire. In tal caso, una soluzione Rh6G altamente concentrata come 1 μM deve essere utilizzata solo per la regolazione del foro stenopeica. Le velocità di co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304