Un modello scalabile per studiare gli effetti della lesione da forza smussata nel pesce zebra adulto

Riepilogo

Abbiamo modificato il modello di calo di peso di Marmarou per il pesce zebra adulto per esaminare un'ampia gamma di patologie a seguito di lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) e i meccanismi alla base della successiva rigenerazione neuronale. Questo modello di TBI a forza smussata è scalabile, induce un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola l'eterogeneità delle lesioni osservata nel TBI umano.

Abstract

Le lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) sono la forma più comune di trauma cranico, che copre una gamma di gravità e si traduce in effetti secondari complessi ed eterogenei. Mentre non esiste un meccanismo per sostituire o rigenerare i neuroni persi a seguito di un TBI negli esseri umani, i pesci zebra possiedono la capacità di rigenerare i neuroni in tutto il corpo, incluso il cervello. Per esaminare l'ampiezza delle patologie esibite nel pesce zebra a seguito di un TBI a forza smussata e per studiare i meccanismi alla base della successiva risposta rigenerativa neuronale, abbiamo modificato il calo di peso del roditore Marmarou comunemente usato per l'uso nel pesce zebra adulto. Il nostro semplice modello di TBI a forza smussata è scalabile, inducendo un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola molti dei fenotipi osservati dopo TBI umano, come convulsioni da contatto e post-traumatiche, edema, ematomi subdurali e intracerebrali e disturbi cognitivi, ciascuno visualizzato in modo dipendente dalla gravità della lesione. Le sequele tbi, che iniziano a comparire entro pochi minuti dalla lesione, si attenuano e ritornano a livelli di controllo quasi intatti entro 7 giorni dopo l'infortunio. Il processo rigenerativo inizia già 48 ore dopo l'infortunio (hpi), con il picco di proliferazione cellulare osservato da 60 hpi. Pertanto, il nostro modello TBI a forza smussata del pesce zebra produce patologie TBI con lesioni primarie e secondarie caratteristiche simili al TBI umano, che consente di indagare l'insorgenza e la progressione della malattia, insieme ai meccanismi di rigenerazione neuronale che sono unici per il pesce zebra.

Introduzione

Le lesioni cerebrali traumatiche (TBI) sono una crisi sanitaria globale e una delle principali cause di morte e disabilità. Negli Stati Uniti, circa 2,9 milioni di persone sperimentano un TBI ogni anno e tra il 2006-2014 la mortalità dovuta a sequele di TBI o TBI è aumentata di oltre il 50%¹. Tuttavia, i TBI variano nella loro eziologia, patologia e presentazione clinica a causa in gran parte del meccanismo di lesione (MOI), che influenza anche le strategie di trattamento e la prognosi ^prevista2. Sebbene i TBI possano derivare da vari MOI, sono prevalentemente il risultato di un trauma penetrante o con forza contundente. I traumi penetranti rappresentano una piccola percentuale di TBI e generano una lesione grave e focale localizzata nelle regioni cerebrali impalate immediate e ^circostanti3. Al contrario, i TBI a forza smussata sono più comuni nella popolazione generale, coprono una gamma di gravità (lieve, moderata e grave) e producono una lesione diffusa, eterogenea e globale che colpisce più regioni del ^{cervello1,4,5}.

I pesci zebra (Danio rerio) sono stati utilizzati per esaminare una vasta gamma di insulti neurologici che attraversano il sistema nervoso centrale (SNC)6,7,8,9. I pesci zebra possiedono anche, a differenza dei mammiferi, una risposta rigenerativa innata e robusta per riparare i danni al ^SNC10. Gli attuali modelli di trauma del pesce zebra utilizzano vari metodi di lesione, tra cui penetrazione, escissione, insulto chimico o onde di ^{pressione11,12,13,14,15,16}. Tuttavia, ciascuno di questi metodi utilizza un MOI che è raramente sperimentato dalla popolazione umana, non è scalabile in una gamma di gravità delle lesioni e non affronta l'eterogeneità o la gravità dipendente dalle sequele TBI riportate dopo TBI a forza contundente. Questi fattori limitano l'uso del modello zebrafish per comprendere i meccanismi alla base delle patologie associate alla forma più comune di TBI nella popolazione umana (lievi lesioni da forza contundente).

Abbiamo mirato a sviluppare un modello di zebrafish TBI a forza smussata rapido e scalabile che fornisca strade per studiare la patologia della lesione, la progressione della sequela tbi e la risposta rigenerativa innata. Abbiamo modificato la caduta di peso del roditore Comunemente usato ^Marmarou17 e l'abbiamo applicata al pesce zebra adulto. Questo modello produce una gamma riproducibile di gravità che vanno da lieve, moderata a grave. Questo modello ricapitola anche molteplici aspetti della patologia TBI umana, in modo dipendente dalla gravità, tra cui convulsioni, edema, ematomi subdurali e intracerebrali, morte delle cellule neuronali e deficit cognitivi, come disturbi dell'apprendimento e della memoria. Giorni dopo l'infortunio, patologie e deficit si dissipano, tornando a livelli simili a controlli non danneggiati. Inoltre, questo modello di zebrafish mostra una robusta proliferazione e una risposta di rigenerazione neuronale attraverso il neuroassico per quanto riguarda la gravità delle lesioni.

Qui, forniamo dettagli sulla configurazione e l'induzione del trauma da forza contundente, il punteggio delle convulsioni post-traumatiche, la valutazione delle lesioni vascolari, le istruzioni sulla preparazione delle sezioni cerebrali, gli approcci per quantificare l'edema e le informazioni sulla risposta proliferativa dopo la lesione.

Protocollo

I pesci zebra sono stati allevati e mantenuti nella struttura di Notre Dame Zebrafish nel Freimann Life Sciences Center. I metodi descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Notre Dame.

1. Paradigma della lesione cerebrale traumatica

1. Aggiungere 1 mL di 2-fenossietanolo a 1 L di acqua di sistema (60 mg di Instant Ocean in 1 L di acqua RO deionizzata).
2. Preparare un serbatoio di recupero aerato contenente 2 L di acqua di sistema a temperatura ambiente.
3. Selezionare il peso desiderato del cuscinetto a sfere e la lunghezza e il diametro desiderati dei tubi in acciaio/plastica e determinare l'energia e la forza d'impatto.
   NOTA: il tubo deve avere un diametro interno che consenta al cuscinetto a sfere di passare senza modificarne il percorso o la velocità di movimento.
   1. Determinare l'energia cinetica all'impatto:
      
      Dove, KE = energia cinetica, m = massa (in kg), g = forza gravitazionale, h = altezza (in m) dal punto di caduta al pesce.
      NOTA: Questo fornisce energia cinetica in J. Moltiplicare il valore per 1.000 per determinare mJ. KE si basa su un oggetto accelerante, che si verifica quando il cuscinetto a sfere viene lasciato cadere da una posizione stazionaria.
   2. Genera un lieve TBI (miTBI) utilizzando tubi in acciaio/plastica lunghi 7,62 cm che terminano 1,5 cm sopra la piastra sul cranio del pesce zebra (distanza totale 9,1 cm) e un cuscinetto a sfere da 1,5 g (6,4 mm di diametro). Questi producono un'energia cinetica di 1,33 mJ. Questo danno è stato empiricamente deciso per essere equivalente a un miTBI basato su marcatori TBI fisiopatologici chiave, come lesioni vascolari, formazione di ematoma subdurale / intracerebrale, morte delle cellule neuronali e disturbi cognitivi che hanno ampiamente ricapitolato ciò che è stato riportato nella popolazione umana in modo dipendente dalla gravità.
   3. Calcola energia cinetica miTBI =
   4. Generare un TBI moderato (moTBI) utilizzando un tubo di acciaio/plastica lungo 12,7 cm che termina a 1,5 cm sopra la piastra sul cranio del pesce zebra (distanza totale 14,2 cm) e un cuscinetto a sfere da 1,5 g (6,4 mm di diametro) che produce energia cinetica di 2,08 mJ.
   5. Calcola energia cinetica moTBI =
   6. Generare un GRAVE TBI (sTBI) utilizzando un tubo in acciaio/plastica lungo 7,62 cm che termina a 1,5 cm sopra la piastra sul cranio del pesce zebra (distanza totale 9,1 cm) e un cuscinetto a sfere da 3,3 g (8,38 mm di diametro) che produce un'energia cinetica di 2,94 mJ.
   7. Calcola l'energia cinetica sTBI =
4. Riempi una capsula di Petri con argilla modellante (Figura 1, passaggio 1) e usa uno strumento smussato (cioè il retro di un paio di pinze) per creare una piattaforma rialzata (5 cm x 1,5 cm) con argilla modellante aggiuntiva (Figura 1, passaggio 2).
   1. Usa una lama di rasoio per dividere la piattaforma rialzata longitudinalmente in due metà approssimativamente uguali (Figura 1, passaggio 3, linea tratteggiata rossa). Formare le due metà in un canale che ospita la lunghezza di un pesce adulto (Figura 1, passaggio 4). Usa argilla aggiuntiva per costruire muri che assicureranno ~ 2/3 del corpo del pesce, lasciando la testa esposta.
   2. Modellare un piccolo supporto nella regione della testa esposta perpendicolare alle pareti per sostenere la testa per evitare la rotazione o il rinculo della testa in caso di lesione (Figura 1, fase 4).
      NOTA: Il canale dovrebbe essere abbastanza profondo da sostenere il pesce in posizione dorsale verso l'alto, ma dovrebbe comunque consentire alla testa di riposare sopra l'argilla circostante. Inoltre, il supporto della testa dovrebbe seguire la curvatura naturale del pesce, sostenendo la mandibola inferiore e le branchie.
   3. Assicurarsi che la perdita di peso non sia ostacolata dai lati del canale (Figura 1, passaggio 4).
5. Creare un disco in acciaio di 3 mm di diametro utilizzando un mini foro e un lampeggiante in acciaio da 22 g. Ogni disco può essere utilizzato più volte.
6. Anestetizzare un pesce mettendolo in un becher con 50-100 ml di 1:1000 (1 ml / 1 L, 0,1%) 2-fenossietanolo fino a quando non risponde al pizzico di coda.
7. Posizionare il pesce, lato dorsale verso l'alto, sullo stampo di argilla all'interno del canale in modo che il corpo sia fissato sui lati e posizionare un disco di acciaio da 3 mm e 22 g sulla testa, centrato sul punto di impatto desiderato (Figura 1, passaggio 5).
   1. Assicurarsi che il pesce sia allineato nel modo più perpendicolare possibile per evitare che la sua testa si inclini su un lato, il che potrebbe causare un impatto irregolare.
8. Fissare il tubo di acciaio/plastica, utilizzando un supporto ad anello standard e un morsetto per braccio, in modo che il fondo del tubo si trovi a 1,5 cm sopra la testa del pesce zebra (Figura 1, passaggio 6). Assicurarsi che il tubo sia dritto.
   1. Guarda in basso il tubo e assicurati che il tubo sia allineato sopra la piastra di acciaio.
9. Far cadere il cuscinetto a sfere (1,5 g per TBI lieve e moderato e 3,3 g per TBI grave) da un'altezza predeterminata (descritta nei passaggi 1.3.3-1.3.5) lungo il tubo sulla piastra di acciaio situata sopra la regione neuroanatomica di interesse desiderata (ad esempio, cervelletto, Figura 1, fase 5) per produrre il TBI a forza smussata per la gravità desiderata della lesione. Posizionare il pesce ferito in una vasca di recupero da monitorare.
   NOTA: A seconda della gravità della lesione, possono verificarsi mortalità o convulsioni tonico-cloniche. Se i pesci non rispondono per un periodo di tempo prolungato dopo il TBI, utilizzare una pipetta di trasferimento o una pinza per somministrare un pizzico di coda e valutare una risposta al dolore.

2. Punteggio delle convulsioni post-TBI nel pesce zebra adulto

1. Anestetizzare e ferire il pesce secondo il protocollo di lesione delineato nella sezione 1 e posizionare il pesce ferito in un serbatoio di recupero aerato di 2 L di acqua di sistema.
2. Osservare il pesce per eventuali segni di convulsioni post-traumatiche che iniziano immediatamente dopo essere stati collocati nella vasca di recupero. Impostare un tempo di osservazione (cioè 1 ora) e registrare tutte le attività convulsive, incluso il punteggio delle convulsioni (descritto di seguito), la durata di ciascun attacco e la percentuale di pesci che hanno avuto convulsioni (Figura 2A).
   NOTA: le convulsioni possono verificarsi immediatamente dopo l'infortunio, così come ore o giorni dopo il TBI. Le convulsioni possono persistere a lungo termine e un singolo pesce può avere più convulsioni. Impostare un tempo di osservazione di 1 ora o superiore produrrà una buona rappresentazione della tendenza generale dei tassi di convulsioni.
3. Segna i pesci usando le linee guida ^Mussulini18 per i fenotipi di convulsioni del pesce zebra adulto.
   NOTA: senza utilizzare il software di tracciamento, è difficile valutare i punteggi delle convulsioni inferiori a 3 in modo imparziale. Pertanto, solo i punteggi di sequestro di 3 o superiori devono essere registrati quando la valutazione viene eseguita senza software.

3. Dissezione cerebrale

1. Eutanasia dei pesci in una soluzione 1:500 (2 ml / 1 L, 0,2%) di 2-fenossietanolo, fino a quando i movimenti branchiali cessano e non sono reattivi al pizzicamento delle pinne, all'estremità desiderata.
2. Riempi una capsula di Petri con argilla modellante e crea una piccola cavità per sostenere il corpo durante la dissezione.
3. Posizionare il pesce, lato dorsale verso l'alto, nello stampo di argilla. Posizionare un perno di dissezione attraverso la linea mediana a metà del corpo del pesce e un secondo perno ~ 5 mm dietro la base della testa.
4. Sotto un microscopio ottico sezionante, tagliare senza mezzi termini il nervo ottico con un paio di pinze Dumont #5 e rimuovere gli occhi (Figura 2A).
5. Orientare il pesce in modo che l'estremità rostrale sia più lontana quando si guarda attraverso il microscopio (Figura 2B).
   NOTA: i seguenti passaggi sono per i destrimani. Gli individui mancini potrebbero preferire eseguire i seguenti passaggi in un orientamento speculare.
6. Usa la pinza #5 per posizionare lentamente un'estremità della pinza sotto la piastra parietale destra, facendo un'azione deliberata a forbice muovendosi verso l'estremità rostrale e rimuovendo le placche parietali e frontali destre (Figura 2C).
   1. Tenere la pinza ad un angolo di 45 ° o inferiore per evitare di penetrare nel cervello durante la dissezione.
7. Ruotare il pesce di 90° in senso orario. Posiziona un'estremità della pinza #5 sotto la piastra parietale sinistra e usa lo stesso movimento della forbice per rimuovere le placche parietali e frontali sinistre esponendo l'intero aspetto dorsale del cervello (Figura 2D,E).
8. Transetto senza mezzi termini la mascella con una pinza #5. Conservare i bulbi olfattivi e non danneggiarli se questa è la regione di interesse.
9. Rimuovere l'opercolo destro, il preopercolo, l'interopercolo e il sottoopercolo con una pinza #5 (Figura 2F).
10. Resettare senza mezzi termini la muscolatura all'estremità caudale dell'apertura del calvario usando la pinza #5, esponendo il midollo spinale.
11. Transettare senza mezzi termini il midollo spinale con una pinza #5. Posizionare con attenzione la pinza sotto il cervello e rimuovere delicatamente il cervello dal calvario.
    NOTA: non pizzicare mai il cervello. Usa la pinza per "cullare" il cervello o resecare caudalmente e utilizzare il midollo spinale esposto come punto di pizzico per manovrare il cervello.
12. Fissare i cervelli rimossi in 9 parti di etanolo al 100% a 1 parte di formaldeide al 37% durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a bilanciere.

4. Studi sull'edema nel cervello del pesce zebra

1. Anestetizzare e ferire i pesci secondo il protocollo di lesione delineato nella sezione 1 e consentire ai pesci di recuperare in una vasca di recupero fino a quando non iniziano a nuotare liberamente.
2. Rimetti il pesce nelle normali condizioni abitative post-infortunio per 1 giorno.
3. Eutanasia del pesce in 1:500 2-fenossietanolo, dopo che il tempo è trascorso.
4. Sezionare l'intero cervello o la regione di interesse secondo il protocollo delineato nella sezione 3 e posizionare immediatamente il cervello su una piccola barca di pesatura.
   NOTA: Prestare attenzione quando si trasferisce il cervello, utilizzando una pinza fine per posizionarlo delicatamente sulla barca di pesatura senza pugnalare o raschiare il cervello, il che potrebbe comportare la perdita di tessuto.
5. Etichettare (con gruppo di lesioni e numero di cervello) e tarare un'ulteriore piccola barca di asciugatura su una bilancia. Utilizzare una bilancia con la possibilità di misurare un minimo di 0,001 g per ottenere una misurazione accurata.
6. Trasferire il cervello alla barca di pesatura asfaltata e registrare il peso bagnato del cervello. Orienta i cervelli in modo che si trovino piatti sulla barca con il lato dorsale rivolto verso l'alto.
7. Posizionare la barca di pesatura e il cervello in un forno di ibridazione impostato a 60 °C per 8 ore.
8. Dopo l'essiccazione, il cervello può attaccarsi alla barca di pesatura di essiccazione e può essere difficile da rimuovere e trasferire su una nuova barca di piccola pesatura catramata. Evitare di pizzicare il cervello con una pinza, in quanto ciò potrebbe causare danni al cervello secco e perdita di tessuto. Invece, pizzicare insieme le pinze sottili e, a partire dal lato ventrale del cervello, raccogliere in un movimento verso l'alto.
9. Determinare il contenuto di acqua di ciascun cervello utilizzando la formula (Figura 4):
   

5. Etichettatura della proliferazione cellulare attraverso il neuroassi e preparazione del tessuto fisso.

1. Preparare 10 mM 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) in 2 mL di _ddH2O.
2. Anestetizzare da 3 a 4 pesci alla volta in 50-100 ml di 1:1000 (1 ml / 1 L, 0,1%) 2-fenossietanolo fino a quando il pesce non risponde al pizzico della coda, nel punto temporale desiderato dopo l'infortunio (utilizzando il protocollo descritto nella sezione 1).
3. Fai un'incisione parziale su una spugna bagnata e posiziona un pesce alla volta nell'apertura, lato ventrale verso l'alto.
4. Utilizzare un ago da 30 G per iniettare ~ 40 μL di 10 mM EdU nel corpo del pesce. Riportare il pesce in un serbatoio pieno di acqua di sistema.
   NOTA: Le iniezioni ripetute possono essere eseguite in momenti diversi per etichettare un numero maggiore di cellule proliferanti e possono essere necessarie se si desidera un periodo di inseguimento superiore a 1 settimana.
5. Raccogliere i cervelli come indicato nel paragrafo 3 e metterli come gruppo in una fiala di vetro da 5 ml contenente 2 mL di 9 parti di etanolo al 100% a 1 parte di formaldeide al 37%. Fissa il cervello a 4 ° C su una piattaforma a bilanciere.
   NOTA: una piattaforma a bilanciere o shaker proibisce al cervello di riposare nella parte inferiore e al telencefalo di cervelli interi di arricciarsi.
6. Reidratare i cervelli, nello stesso flaconcino di vetro usato per riparare i cervelli, in lavaggi di serie di etanolo discendenti, 75%, 50% e 25%, per 15 minuti ciascuno, seguiti da un lavaggio di 1,5 ore in saccarosio / PBS al 5% su un bilanciere a temperatura ambiente. Conservare il cervello in una fiala di vetro durante la notte in saccarosio al 30% / PBS a 4 ° C su una piattaforma a bilanciere.
7. Rimuovere i cervelli dal 30% di saccarosio / PBS e trasferirli con una pinza in una piastra a 12 pozzetti (un gruppo di trattamento per pozzetto) con pozzetti riempiti con una soluzione 2: 1 composta da 2 parti di mezzo di congelamento del tessuto e 1 parte di saccarosio al 30% / PBS. Incubare il cervello durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a bilanciere.
8. Trasferisci i cervelli alla fila successiva di pozzi all'interno dei cervelli sommersi a 12 pozzetti in TFM al 100% per 2-24 ore a 4 °C.
9. Utilizzare un mandrino criostato per incorporare il cervello in TFM nell'orientamento desiderato sul ghiaccio secco.
10. Eseguire la criosezione (sezioni spesse 16 μm) e raccogliere le sezioni su vetrini caricati positivamente. Asciugare i vetrini su uno scaldafili per 1 ora e poi conservare a -80 °C o continuare con l'immunoistochimica.
11. Preparare una barriera idrofobica sul vetrino intorno alle sezioni di tessuto e lasciare asciugare su uno scaldafilo per 20 minuti.
12. Lavare brevemente le diapositive in PBS per 5 minuti e poi due volte in PBS-Tween 20 (0,05%) per 10 minuti ciascuna.
13. Eseguire il rilevamento EdU utilizzando il kit di proliferazione delle celle EdU e le istruzioni del produttore.
14. Analizzare i vetrini e quantificare le cellule fluorescenti marcate edU utilizzando un microscopio epifluorescente o un microscopio confocale. Sarà richiesto un minimo di un obiettivo 40x per distinguere chiaramente le singole cellule.

Risultati

La preparazione del carro di induzione delle lesioni consente un mezzo rapido e semplicistico per fornire un TBI a forza smussata scalabile al pesce zebra adulto. La gravità graduale del modello di lesione fornisce diverse metriche facilmente identificabili della lesione di successo, sebbene la lesione vascolare sia una delle patologie più semplici e importanti (Figura 3). Il ceppo di pesce utilizzato durante la lesione può rendere questo indicatore più facile o più difficile da identif...

Discussione

Le indagini sui neurotraumi e sulle sequele associate sono state a lungo incentrate sui modelli tradizionali di roditori non rigenerativi20. Solo di recente gli studi hanno applicato varie forme di danno al SNC a modelli rigenerativi9,11,13,14,21. Sebbene approfonditi, questi modelli sono limitati dal loro uso di un metodo di lesione no...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-phenoxyethanol	Sigma Alderich	77699
#00 buckshot	Remington	RMS23770	3.3g weight for sTBI
#3 buckshot	Remington	RMS23776	1.5g weight for miTBI/moTBI
#5 Dumont forceps	WPI	14098
5-ethynyl-2’-deoxyuridine	Life Technologies	A10044	EdU
5ml glass vial	VWR	66011-063
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C10340
CytoOne 12-well plate	USA Scientific	CC7682-7512
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Super frost postiviely charged slides	VWR	48311-703
Super PAP Pen Liquid Blocker	Ted Pella	22309
Tissue freezing medium	VWR	15148-031