Un modello preclinico di colpo di calore da sforzo nei topi

Riepilogo

Il protocollo descrive lo sviluppo di un modello standardizzato, ripetibile, preclinico di colpo di calore da sforzo (EHS) in topi privi di stimoli esterni avversi come scosse elettriche. Il modello fornisce una piattaforma per studi meccanicistici, preventivi e terapeutici.

Abstract

Il colpo di calore è la manifestazione più grave delle malattie legate al calore. Il colpo di calore classico (CHS), noto anche come colpo di calore passivo, si verifica a riposo, mentre il colpo di calore da sforzo (EHS) si verifica durante l'attività fisica. L'EHS differisce dalla CHS in eziologia, presentazione clinica e sequele di disfunzione multiorgano. Fino a poco tempo fa, solo i modelli di CHS sono stati ben consolidati. Questo protocollo mira a fornire linee guida per un raffinato modello murino preclinico di EHS che sia privo di importanti fattori limitanti come l'uso di anestesia, contenimento, sonde rettali o scosse elettriche. In questo modello sono stati utilizzati topi C57Bl/6 maschi e femmine, strumentati con sonde telemetriche di temperatura interna (Tc). Per familiarizzare con la modalità di corsa, i topi si sottopongono a 3 settimane di allenamento utilizzando ruote da corsa sia volontarie che forzate. Successivamente, i topi corrono su una ruota forzata all'interno di una camera climatica impostata a 37,5 °C e 40%-50% di umidità relativa (RH) fino a mostrare una limitazione dei sintomi (ad esempio, perdita di coscienza) a Tc di 42,1-42,5 °C, sebbene si possano ottenere risultati adeguati a temperature della camera comprese tra 34,5-39,5 °C e umidità tra il 30% e il 90%. A seconda della gravità desiderata, i topi vengono rimossi immediatamente dalla camera per il recupero a temperatura ambiente o rimangono nella camera riscaldata per una durata più lunga, inducendo un'esposizione più grave e una maggiore incidenza di mortalità. I risultati vengono confrontati con controlli di esercizio fittizi (EXC) e /o controlli ingenui (NC). Il modello rispecchia molti dei risultati fisiopatologici osservati nell'EHS umano, tra cui perdita di coscienza, grave ipertermia, danno multiorgano e rilascio di citochine infiammatorie e risposte di fase acuta del sistema immunitario. Questo modello è ideale per la ricerca basata su ipotesi per testare strategie preventive e terapeutiche che possono ritardare l'insorgenza di EHS o ridurre il danno multi-organo che caratterizza questa manifestazione.

Introduzione

Il colpo di calore è caratterizzato da disfunzione del sistema nervoso centrale e successivo danno d'organo in soggetti ipertermici¹. Ci sono due manifestazioni di colpo di calore. Il colpo di calore classico (CHS) colpisce soprattutto le popolazioni anziane durante le ondate di calore o i bambini lasciati in veicoli esposti al sole durante le calde giornate^{estive 1}. Il colpo di calore da sforzo (EHS) si verifica quando vi è un'incapacità di termoregolarsi adeguatamente durante lo sforzo fisico, tipicamente, ma non sempre, a temperature ambiente elevate con conseguenti sintomi neurologici, ipertermia e successiva disfunzione e danno multiorgano². L'EHS si verifica negli atleti ricreativi e d'élite, nonché nel personale militare e nei lavoratori con e senza disidratazione concomitante^3,4. Infatti, l'EHS è la terza causa di mortalità negli atleti durante l'attività fisica⁵. È estremamente difficile studiare l'EHS negli esseri umani in quanto l'episodio può essere letale o portare a esiti negativi sulla salute a lungo termine^6,7. Pertanto, un modello preclinico affidabile di EHS potrebbe servire come strumento prezioso per superare i limiti delle osservazioni cliniche retrospettive e associative nelle vittime di EHS umane. I modelli preclinici di CHS in roditori e suini sono stati ben caratterizzati^8,9,10. Tuttavia, i modelli preclinici di CHS non si traducono direttamente in fisiopatologia EHS a causa degli effetti unici dell'esercizio fisico sul profilo termoregolatore e sulla risposta immunitaria innata¹¹. Inoltre, i precedenti tentativi di sviluppare modelli EHS preclinici nei roditori hanno posto restrizioni significative, tra cui stimoli di stress sovrapposti indotti da scosse elettriche, inserimento di una sonda rettale e temperature corporee interne massime predefinite con alti tassi di mortalità^{12,13,14,15,16} che non corrispondono ai dati epidemiologici attuali. Questi rappresentano limitazioni significative che possono confondere l'interpretazione dei dati e fornire indici di biomarcatori inaffidabili. Pertanto, il protocollo mira a caratterizzare e descrivere i passaggi di un modello preclinico standardizzato, altamente ripetibile e traducibile di EHS nei topi che è in gran parte privo delle limitazioni sopra menzionate. Vengono descritti gli aggiustamenti al modello che possono portare a esiti fisiologici graduali da colpo di calore moderato a fatale. Per quanto a conoscenza degli autori, questo è l'unico modello preclinico di EHS con tali caratteristiche, che consente di perseguire la ricerca EHS pertinente in modo basato su ipotesi^11,17,18.

Protocollo

Tutte le procedure sono state riviste e approvate dalla IACUC dell'Università della Florida. Per lo studio vengono utilizzati topi maschi o femmine C57BL / 6J, di età compresa tra ~ 4 mesi, di peso compreso tra 27-34 g e 20-25 g, rispettivamente.

1. Impianto chirurgico del sistema di monitoraggio telemetrico della temperatura

1. All'arrivo dal venditore, consentire agli animali di riposare nel vivaio per almeno 1 settimana prima dell'intervento chirurgico per ridurre al minimo lo stress del trasporto.
2. Il gruppo ospita i topi (massimo 5 per gabbia secondo le linee guida locali IACUC) fino al giorno dell'intervento chirurgico per l'impianto del dispositivo telemetrico a temperatura. Ospitali in gabbie standard da 7,25 " (L) x 11,75 " (L) x 5 " (H) contenenti lettiera di pannocchia di mais. Mantenere il ciclo di luce su un ciclo di luce 12 x 12 (acceso: 7 AM; spento: 7 PM). Mantenere la temperatura dell'alloggiamento a 20-22 °C e l'umidità relativa (RH) al 30%-60%. Fornire la dieta standard chow e acqua ad libitum fino al protocollo EHS.
   NOTA: Il razionale per l'alloggiamento individuale è quello di evitare frequenti lesioni da combattimento nei topi maschi C57bl / 6J e di fornire ampie opportunità per la corsa spontanea della ruota per ciascun topo.
3. Per il posizionamento dei dispositivi di telemetria, anestetizzare il mouse con isoflurano (4%, 0,4-0,6 L/min di flusso O₂₎ in una camera di induzione. Quindi, posizionare il mouse in anestesia continua tramite un cono nasale (1,5%, 0,6 L / min).
4. Utilizzare lubrificante per gli occhi, come un unguento veterinario, per proteggere gli occhi dell'animale da danni o lesioni durante l'intervento chirurgico.
5. Per preparare il sito chirurgico, radersi l'addome inferiore con piccoli tagliacapelli per animali o utilizzare un dispositivo di rimozione dei capelli disponibile in commercio. Somministrare la prima dose di buprenorfina sottocutanea (0,1 mg/kg) durante questo periodo.
6. Strofinare l'area con tre lavaggi di povidone-iodio (o scrub germicida simile) seguiti da risciacquo con alcool isopropilico al 70% (o soluzione salina sterile a seconda delle esigenze veterinarie locali). Quindi, trasferire il mouse nell'area chirurgica.
7. Utilizzare un telo adesivo per isolare il sito chirurgico sul mouse. Utilizzando strumenti sterili e tecnica asettica, fare un'incisione di ~ 1 cm sulla linea mediana lungo la linea alba, a circa 0,5 cm dal margine costale. Quindi, separare la pelle dallo strato muscolare e fare un'incisione leggermente più piccola sulla linea alba, facendo attenzione a non danneggiare l'intestino o gli organi interni.
8. Una volta aperto lo strato muscolare, posizionare il telemetro sterile (dispositivo di radiotelemetria riutilizzabile in miniatura senza batteria; 16,5 x 6,5 mm) nella cavità intraperitoneale di fronte alle arterie caudali e alle vene e dorsale agli organi digestivi per consentirgli di fluttuare liberamente.
   NOTA: Tutti i telemetri vengono puliti con acqua e sapone, accuratamente risciacquati e sterilizzati a gas con ossido di etilene tra un utilizzo e l'altro. Se la sterilizzazione a gas non è disponibile, l'immersione in soluzioni di sterilizzazione (seguendo la raccomandazione del produttore per il tempo di diluizione e immersione) è accettata per disinfettare e sterilizzare i telemetri.
9. Chiudere l'apertura addominale con una sutura riassorbibile sterile 5-0 e chiudere la pelle usando un semplice punto interrotto con sutura di prolina 5-0.
   NOTA: Consentire al telemetro di galleggiare nel compartimento addominale senza legarlo alla parete addominale (un metodo raccomandato dal produttore) ha dimostrato di avere successo e preferito dagli autori per eliminare l'eccesso di tensione nella parete addominale durante la guarigione. Inoltre, ciò non ha alcun impatto sulla capacità del ricevitore di ottenere il segnale dall'emettitore.
10. Posizionare il mouse nella sua gabbia pulita con una piastra riscaldante portatile sotto la gabbia. Monitorare il mouse ogni 15 minuti durante la prima ora di recupero dall'anestesia e quindi tornare alla struttura di stabulazione degli animali.
11. Fornire ai topi iniezioni sottocutanee di buprenorfina ogni 12 ore per 48 ore durante il recupero e continuare a monitorare i segni di sofferenza. Se disponibile, somministrare buprenorfina a lento rilascio per via sottocutanea ogni 24 ore (1 mg/kg) per 48 ore. Lasciare che i topi si riprendano per ~ 2 settimane dopo l'intervento chirurgico prima di introdurre una ruota volontaria in esecuzione.

2. Familiarizzazione: corsa volontaria e forzata della ruota

1. Dopo il recupero dall'intervento chirurgico, posizionare le ruote da corsa volontarie nella gabbia per il libero accesso alla ruota. Altre selezioni di ruote da corsa possono essere ugualmente efficaci, ma assicurarsi che si adatti alle limitate dimensioni della gabbia disponibili.
   NOTA: le ruote di scorrimento dovevano essere leggermente ridotte di dimensioni per adattarsi a una gabbia standard.
2. Acclimatare il mouse alla ruota volontaria nella gabbia per 2 settimane. Una volta acclimatato, il mouse è pronto per l'allenamento con le procedure di familiarizzazione per le ruote da corsa forzate.
3. Eseguire le quattro sessioni di allenamento (una/giorno) nella camera ambientale a temperatura ambiente (~25 °C, 30% di umidità relativa).
   NOTA: Sebbene questo sia l'ideale, i topi sono stati anche addestrati con successo in identiche ruote a corsa forzata al di fuori della camera. Diversi topi possono quindi essere addestrati contemporaneamente senza interferire con l'uso della camera.
4. Per iniziare la prima sessione di allenamento, consentire al mouse di liberare la rotella nella ruota di corsa modificata per 15 minuti rimuovendo o allentando la cinghia di trasmissione del motore per consentire al mouse di determinare la velocità della ruota e acclimatarsi ad essa in modo non stressante.
   NOTA: i protocolli possono essere eseguiti con software e hardware forniti dal produttore della ruota dentata o possono essere sostituiti da un alimentatore programmabile esterno collegato direttamente al motore della ruota, che consente l'automazione del protocollo di esercizio incrementale.
5. Calibrare il sistema per ogni ruota di scorrimento per determinare la relazione tra la tensione di alimentazione e i metri/minuto (m/min) di ciascuna ruota.
   NOTA: Anche le ruote di scorrimento forzate sono state modificate per elevare il motore di 15 cm, invertire e spostare la puleggia che guida la ruota fino a 5 cm sopra la piattaforma del ricevitore di telemetria. Ciò ha garantito che la piattaforma del ricevitore ottenesse dati di telemetria accurati durante il protocollo in esecuzione senza interferenze da parte del motore.
6. Dopo un breve periodo di riposo (<5 min), avviare il protocollo della ruota di corsa forzata. Avviare la ruota a 2,5 m/min e aumentare di 0,3 m/min ogni 10 minuti per un totale di 1 ora per imitare la prima ora della prova EHS effettiva, ma a temperatura ambiente. Riportare il mouse nella sua gabbia di casa e consentire il recupero 24 ore su 24. Condurre le successive tre sessioni di corsa forzata nello stesso modo in giorni consecutivi. Dopo il giorno 1, la porzione di acclimatazione a ruota libera non è necessaria.
7. Consentire al mouse 2-3 giorni di wash-out o recupero dallo stress della pratica della ruota di corsa forzata, ma consentire al mouse libero accesso alla ruota volontaria della gabbia domestica. Il mouse è ora pronto per sottoporsi al protocollo EHS.

3. Protocollo EHS

1. La notte prima del protocollo EHS, posizionare il mouse nella camera ambientale a temperatura ambiente (~ 25 ° C, ≈30% di umidità relativa) per acclimatarsi alla camera.
2. Utilizzare un sistema di acquisizione dati per raccogliere Tc continuo, in media su intervalli di 30 s durante la notte.
3. La mattina del protocollo EHS, assicurarsi che il mouse sia pari o inferiore a un intervallo normale di temperatura diurna prima di aumentare la temperatura della camera (ad esempio, 36-37,5 °C). Ciò garantisce che il mouse non abbia la febbre e non abbia sperimentato uno stress eccessivo durante questo periodo.
4. Una volta che il mouse è stabile e all'interno di un intervallo di normale temperatura interna a riposo, rimuovere il cibo e l'acqua e pesare l'animale. Chiudere la porta della camera e aumentare la temperatura della camera a un obiettivo di 37,5 °C e 40%-50% di umidità relativa, o la temperatura e l'umidità ambientale desiderate¹⁹. Verificare la temperatura e l'umidità della camera con un monitor di temperatura e umidità calibrato.
5. Circonda la camera con una tenda oscurante per mantenere la luce e i disturbi minimi durante il protocollo. Monitorare continuamente il mouse durante il protocollo tramite telecamere ir illuminate da remoto. Focalizzare una seconda telecamera sul monitor di temperatura e umidità, posizionato vicino alla ruota di marcia. Effettuare eventuali regolazioni al controller per il set-point della camera ambientale per garantire letture accurate della temperatura vicino all'animale.
6. Una volta che la camera ha raggiunto la temperatura target misurata dalla seconda telecamera sul monitor della temperatura (questo può richiedere ~ 30 minuti), aprire rapidamente lo sportello della camera e posizionare il mouse nella rotella di corsa forzata.
7. Avviare il protocollo della ruota di corsa forzata a una velocità di 2,5 m/min e aumentare la velocità di 0,3 m/min ogni 10 minuti fino a quando il mouse raggiunge un Tc di 41 °C. Una volta che il mouse ha raggiunto questa temperatura interna, lasciare che la velocità rimanga costante fino alla limitazione dei sintomi, caratterizzata da un'apparente perdita di coscienza, una caduta all'indietro o uno svenimento e l'incapacità di continuare a correre o aggrapparsi alla ruota. Confermare questo punto temporale quando il mouse ha tre rotazioni all'indietro sulla rotellina senza segni di una risposta fisica. In alternativa, identificare un endpoint umano seguendo le regole IACUC locali per determinare quando interrompere il protocollo (ad esempio, quando Tc ~ 43 °C). Questo endpoint è leggermente superiore alla limitazione dei sintomi essenzialmente in tutti i topi.
8. Per eseguire il protocollo Rapid Cooling (R), una volta che il mouse raggiunge la limitazione dei sintomi, arrestare la rotellina e rimuoverla immediatamente dalla rotella di corsa forzata. Pesare il mouse e rimetterlo nella sua gabbia di casa per recuperare a temperatura ambiente. Durante questo periodo, lasciare la porta della camera aperta e riportare il set point dell'incubatore a temperatura ambiente per consentire alla camera di raffreddarsi rapidamente. Questa procedura si traduce in >99% di sopravvivenza a lungo termine.
9. Per eseguire un'esposizione EHS più grave (S), mantenere la gabbia domestica dell'animale all'interno della camera a 37,5 °C durante il protocollo EHS. Quando l'animale raggiunge la limitazione dei sintomi, permettigli di rimanere nella ruota di corsa fino a quando non ritorna alla coscienza come osservato dalla telecamera remota (~ 5-9 minuti).
10. Quindi rimuovere rapidamente il mouse dalla rotella di corsa e riportarlo direttamente alla sua gabbia preriscaldata per ottenere un profilo di raffreddamento molto più lento(Figura 1A,linea tratteggiata rossa), eliminando essenzialmente la fase ipotermica EHS. Rimuovere la parte superiore del filtro dalla gabbia durante questo periodo per migliorare l'equilibrio con la camera.
11. Utilizzare una gabbia di recupero preraffreddata a temperatura ambiente per eseguire una procedura alternativa meno severa per provocare una fase ipotermica soppressa ma con un tasso di sopravvivenza del 100%²⁰.
12. Per il protocollo S, monitorare attentamente il mouse durante il ripristino e verificare continuamente la presenza di endpoint umani. Sebbene sia difficile testare a distanza endpoint umani comunemente usati (ad esempio, riflesso di raddrizzamento), osservare i topi da remoto per movimenti normali durante il recupero come toelettatura, respirazione normale, leccare, ecc. Monitorare il Tc durante questo periodo.
13. È improbabile che i topi si riprendano se la loro temperatura interna inverte la direzione durante la fase di recupero, superando infine i 40 °C; in questo momento, terminare l'esperimento e valutare il mouse per endpoint umani standard.

Risultati

I tipici profili termoregolatori durante l'intero protocollo EHS e il recupero precoce di un topo sono illustrati nella Figura 1A. Questo profilo comprende quattro fasi distinte che possono essere definite come la fase di riscaldamento della camera, la fase di esercizio incrementale, la fase di esercizio allo stato stazionario e una fase di recupero mediante un metodo di raffreddamento rapido (R) o severo (S)¹⁷. I principali risultati termoregolatori includono il mass...

Discussione

Questa revisione tecnica mira a fornire linee guida per le prestazioni di un modello preclinico di EHS nei topi. Vengono forniti passaggi dettagliati e materiali necessari per l'esecuzione di un episodio EHS riproducibile di gravità variabile. È importante sottolineare che il modello imita in gran parte i segni, i sintomi e la disfunzione multiorgano osservati nelle vittime umane di EHS^11,19. Inoltre, questo modello consente di esaminare il meccanismo alla base...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit	LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided	Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament	Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18	Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201	BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit	DR Instruments
Energizer Power Supply	Starr Life Sciences
G2 Emitteret al.	Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B	Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane	Patterson Veterinary
Platform receiveret al.	Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911	ThermoForma
Training Wheels	Columbus Inst.