Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)

Riepilogo

Questo protocollo utilizza il gonfiore dell'agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (_5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.

Abstract

Robuste indagini in vitro sulla struttura e la funzione delle proteine di membrana integrali sono state una sfida a causa delle complessità della membrana plasmatica e dei numerosi fattori che influenzano il comportamento delle proteine nelle cellule vive. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono un sistema modello in vitro biomimetico e altamente sintonizzabile per studiare le interazioni proteina-membrana e sondare il comportamento proteico in modo preciso e dipendente dallo stimolo. In questo protocollo, presentiamo un metodo economico ed efficace per fabbricare GUV con il recettore umano della serotonina 1A (_5-HT1AR) stabilmente integrato nella membrana. Fabbrichiamo GUV utilizzando un metodo di rigonfiamento dell'idrogel modificato; depositando un film lipidico sopra una miscela di agarosio e _5-HT1AR e quindi idratando l'intero sistema, si possono formare vescicole con _{5-HT1AR opportunamente} orientato e funzionale incorporato nella membrana. Questi GUV possono quindi essere utilizzati per esaminare le interazioni proteina-membrana e il comportamento di localizzazione tramite microscopia. In definitiva, questo protocollo può far progredire la nostra comprensione della funzionalità delle proteine di membrana integrali, fornendo una profonda comprensione fisiologica.

Introduzione

Le membrane modello sintetiche sono potenti strumenti nello studio delle proprietà e delle funzioni fondamentali delle biomembrane. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono una delle piattaforme più importanti per studiare una varietà di proprietà della membrana plasmatica e possono essere progettate per imitare diverse condizioni fisiologiche1,2,3,4,5,6,7,8. È ben noto che la membrana plasmatica e l....

Protocollo

1. Etichettatura delle proteine

1. Consentire a NHS-Rhodamine, ai frammenti di membrana _5-HT1A e a una colonna di dissalazione di spin 7 K MWCO di equilibrarsi a temperatura ambiente.
2. Sciogliere 1 mg di NHS-rodamina in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO).
3. Aggiungere 5 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 1 M per aumentare il pH della soluzione _5-HT1AR a pH 8.
4. Aggiungere 3,66 μL della soluzione NHS-rodamina a 50 μL della soluzione _5-HT1AR e pipettare delicatamente su e giù in un tubo microcentrifugale.
   NOTA: Assicurarsi di avere almeno 10x eccesso molare di NHS-rodamina.
5. Tenere la misc....

Risultati

La concentrazione di proteine è stata misurata e il grado di etichettatura è stato calcolato come il rapporto molare tra il colorante e la proteina per essere 1: 1. Esaminando i GUV utilizzando la microscopia confocale, siamo stati in grado di confermare la formazione e l'integrazione proteica delle vescicole. I lipidi sono stati etichettati con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE e la proteina è stata etichettata covalentemente tramite la modifica dell'estere NHS della rodamina delle ammine primarie. La Figur.......

Discussione

Abbiamo identificato due passaggi fondamentali per il successo del protocollo complessivo: il trattamento al plasma e la deposizione lipidica. La pulizia al plasma dei coverslip è essenziale per garantire che vi sia un'adeguata copertura e adesione dell'idrogel di agarosio al coperchio di vetro. La pulizia al plasma realizza due cose: in primo luogo, rimuove tracce di materia organica dalla superficie del vetro; in secondo luogo, attiva la superficie del coverslip, consentendo un aumento della bagnabilità all'aumentare.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882