Imaging vascolare profondo nell'occhio con ultrasuoni ottimizzati per il flusso

Riepilogo

Presentiamo una tecnica ecografica non invasiva per generare angiografie tridimensionali nell'occhio senza l'uso di mezzi di contrasto.

Abstract

La retina all'interno dell'occhio è uno dei tessuti più esigenti dal punto di vista energetico nel corpo e quindi richiede alti tassi di erogazione di ossigeno da un ricco apporto di sangue. La lamina capillare della coroide riveste la superficie esterna della retina ed è la fonte dominante di ossigeno nella maggior parte delle retine dei vertebrati. Tuttavia, questo letto vascolare è difficile da fotografare con le tecniche ottiche tradizionali a causa della sua posizione dietro la retina altamente assorbente della luce. Qui descriviamo una tecnica ecografica ad alta frequenza con successivo miglioramento del flusso all'immagine di letti vascolari profondi (0,5-3 cm) dell'occhio con un'alta risoluzione spaziotemporale. Questo metodo non invasivo funziona bene nelle specie con globuli rossi nucleati (modelli animali non mammiferi e fetali). Consente la generazione di angiografie tridimensionali non invasive senza l'uso di mezzi di contrasto ed è indipendente dagli angoli del flusso sanguigno con una sensibilità più elevata rispetto alle tecniche di imaging ecografico basate su Doppler.

Introduzione

L'elevato metabolismo sulla retina dei vertebrati impone un compromesso intrinseco tra due esigenze contrastanti; alte velocità di flusso sanguigno e un percorso di luce privo di vasi sanguigni. Per evitare disturbi visivi di perfondere i globuli rossi, la retina di tutti i vertebrati riceve ossigeno e sostanze nutritive attraverso un foglio di capillari dietro i fotorecettori, il coriocapillare1,2,3. Tuttavia, questa singola fonte di nutrienti e ossigeno impone una limitazione di diffusione allo spessore della ^retina4,5, quindi molte specie visivamente attive possiedono una varietà di reti vascolari elaborate per fornire ulteriore afflusso di sangue a questo organo metabolicamente ^attivo6. Questi letti vascolari includono vasi sanguigni che perfondono gli strati retinici interni nei mammiferi e in alcuni pesci4,7,8,9,10, vasi sanguigni sul lato interno (rivolto verso la luce) della retina che si trovano in molti pesci, rettili e uccelli4,11,12,13, e disposizioni vascolari controcorrenti della coroide di pesce, la rete coroide mirabile, che consente la generazione di pressioni parziali di ossigeno super-atmosferico14,15,16,17,18,19,20. Nonostante questi percorsi aggiuntivi non coroidale per l'apporto di nutrienti retinici svolgano un ruolo essenziale nell'alimentare i requisiti metabolici di una visione ^superiore4, l'anatomia tridimensionale di queste strutture vascolari è poco conosciuta, limitando la nostra comprensione dell'evoluzione morfologica dell'occhio vertebrato.

Tradizionalmente, l'afflusso di sangue retinico è stato studiato utilizzando tecniche ottiche, come l'oftalmoscopia del fondo oculare. Questa categoria di tecniche fornisce informazioni non distruttive ad alto rendimento sull'anatomia dei vasi sanguigni non coroidale in alta ^{risoluzione21} ed è quindi prontamente utilizzata nella diagnosi clinica di anomalie nella struttura dei vasi ^retinici22. Tuttavia, l'epitelio pigmentato retinico assorbe la luce trasmessa e limita la profondità di visione in queste tecniche ottiche, fornendo informazioni ridotte sulla struttura e la funzione coroidale senza l'uso di mezzi di ^contrasto21. Limitazioni di profondità simili si verificano nella tomografia a coerenza ottica (OCT). Questa tecnica può generare angiografie del fondo oculare ad alta risoluzione utilizzando onde luminose a spese tecniche della penetrazione in ^{profondità23}, mentre l'OCT di imaging di profondità avanzato può visualizzare la coroide a scapito della qualità dell'imaging ^retinico24. La risonanza magnetica supera i limiti ottici dell'oftalmoscopia e dell'OCT e può mappare gli strati vascolari nella retina, anche se a bassa ^{risoluzione25}. L'istologia e la tomografia microcalcografica (μCT) mantengono l'alta risoluzione delle tecniche ottiche e forniscono informazioni sulla morfologia vascolare dell'occhio ^intero4, ma entrambe le tecniche richiedono il campionamento oculare e non sono quindi possibili in clinica o in specie rare o in via di estinzione. Per superare alcuni dei limiti di queste tecniche di imaging retinico consolidate, lo studio qui presenta un protocollo ecografico su animali anestetizzati, in cui il movimento del sangue è mappato in silico su una serie di ecografie bidimensionali equamente distanziate che coprono un intero occhio applicando una tecnica comparabile come descritto in precedenza per l'imaging embrionale e ^{cardiovascolare26,27, 28} e nell'angiografia ^OCT29. Questo approccio consente la generazione di angiografie oculari profonde tridimensionali non invasive senza l'uso di un mezzo di contrasto e apre nuove strade per mappare la distribuzione del flusso sanguigno all'interno dell'occhio tra le specie.

Protocollo

Il protocollo riportato di seguito è stato eseguito con il permesso dell'Ispettorato danese per la sperimentazione animale presso il Ministero danese dell'alimentazione, dell'agricoltura e della pesca, della veterinaria danese e dell'amministrazione alimentare (numero di autorizzazione 2016-15-0201-00835).

1. Anestesia e mezzo ad ultrasuoni

1. Anestetizzare l'animale da ricerca.
   NOTA: Il tipo e la dose di anestesia appropriata sono altamente dipendenti dalla specie. In generale, gli anestetici a base di immersione come MS-222 (acido metil 3-aminobenzoato metanosolfonico), benzocaina (etil 4-aminobenzoato) e propofol (2,6-diisopropilfenolo) sono utili nei pesci e negli anfibi che assorbono facilmente l'anestetico su branchie o pelle (ad esempio, 0,05 mg· ^L-1 benzocaina nella trota iridea). Una gamma di composti disciolti che possono essere somministrati per via endovenosa, intramuscolare, intraperitoneale è disponibile per gli amnioti, così come gli anestetici a base di gas. Alfaxalon somministrato per via intramuscolare è utile nei rettili (ad esempio, 30 mg·^kg-1 nelle lucertole) e l'isoflurano somministrato come gas è utile negli uccelli (ad esempio, il 2% nell'aria per i piccioni). Fare riferimento alla letteratura pubblicata30,31,32 per una panoramica completa degli anestetici disponibili tra le specie.
2. Testare i riflessi nell'animale per confermare un livello ottimale di anestesia. Assicurarsi che l'animale sia completamente immobile durante la procedura poiché la procedura ecografica potenziata dal flusso è sensibile al rumore del movimento.
   1. Un'anestesia troppo profonda può alterare i modelli di flusso sanguigno, quindi condurre una titolazione della dose nella fase di avvio di un esperimento.
   2. Aumentare il dosaggio dell'anestesia in passi e osservare il flusso sanguigno nell'occhio aiutato da una semplice ecografia in modalità luminosità (modalità B).
      NOTA: Un livello ottimale di anestesia si ottiene quando l'animale è immobile (tranne la respirazione) con flusso sanguigno oculare visibile.
3. Se il tipo/dose di anestetico non è permissivo per i movimenti respiratori, garantire un'adeguata ventilazione dell'animale, ad esempio utilizzando una pompa ad aria per ossigenare l'acqua per le specie acquatiche o un ventilatore per le specie che respirano l'aria.
4. Posizionare l'animale in una postura che consenta l'accesso diretto dall'alto all'occhio.
   NOTA: a seconda della specie, questo può essere in posizione supina o laterale. Può essere utile costruire un semplice dispositivo di tenuta utilizzando un piccolo pezzo di metallo non reattivo (ad esempio, acciaio inossidabile) e elastici sciolti (vedere la Figura 1).
5. Posizionare un mezzo ad ultrasuoni appropriato sull'occhio dell'animale. Se le palpebre squamate (impermeabili agli ultrasuoni) coprono l'occhio, spostarle delicatamente con un batuffolo di cotone.
   NOTA: Per le specie acquatiche, il miglior mezzo ad ultrasuoni è l'acqua pulita del serbatoio in cui l'animale di solito vive. Per le specie terrestri, una generosa quantità di gel ad ultrasuoni garantisce movimenti liberi e immagini del trasduttore ad ultrasuoni (cioè sonda lineare) su tutta la superficie dell'occhio. L'unguento veterinario sull'occhio controlaterale è richiesto per le specie terrestri.

2. Acquisizione di immagini ad ultrasuoni oculari 2D e 3D

1. Posizionare il trasduttore ad ultrasuoni mediale all'occhio in un orientamento dorsale/ventrale o rostrale/caudale a seconda dell'orientamento dell'immagine desiderato.
2. In modalità B, con una profondità di campo massima, visualizza la porzione mediale e più profonda dell'occhio e assicurati che tutte le strutture di interesse siano visibili nel campo dell'immagine.
   NOTA: In alcune specie, il cristallino occupa una percentuale relativamente grande dell'umore vitreo, che può assorbire gli ultrasuoni, specialmente a frequenze più elevate.
3. Traduci lentamente il trasduttore su ciascun lato mentre ispeziona le immagini in tempo reale. Assicurati che tutte le strutture di interesse siano visibili nel campo dell'immagine; in caso contrario, passare a un trasduttore con una frequenza inferiore e una maggiore profondità di campo.
   NOTA: le seguenti frequenze centrali consentono la seguente profondità massima di campo: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (vedere Tabella 1). Tuttavia, questi valori massimi di profondità di campo possono essere marcatamente inferiori se l'occhio contiene strutture impermeabili calcificate o altre ecografiche.
4. Regola la profondità dell'immagine, l'offset di profondità (distanza dalla parte superiore dell'immagine alla struttura di interesse), la larghezza dell'immagine, nonché il numero e la posizione delle zone focali per coprire la regione di interesse desiderata in tutte e tre le dimensioni spaziali (ad esempio, profondità dell'immagine di 1 cm, offset di profondità di 2 mm, larghezza dell'immagine di 1 cm, una zona focale).
   NOTA: sebbene la denominazione specifica dei pulsanti che regolano questi parametri possa variare tra i sistemi a ultrasuoni, la maggior parte dei sistemi avrà pulsanti con nomi logici per queste regolazioni. Queste impostazioni dei parametri dell'immagine di solito influenzano la gamma di possibili risoluzioni temporali dell'acquisizione ecografica.
5. Impostare la frequenza dei fotogrammi nell'intervallo 50-120 fotogrammi·^s-1.
   NOTA: La risoluzione temporale (cioè l'intervallo di tempo tra le successive scansioni B) deve essere adeguata per visualizzare una grande variabilità di intensità di pixel nei vasi sanguigni ripresi, cioè la risoluzione temporale non deve essere troppo alta. D'altra parte, per completare una registrazione 3D completa dell'occhio in un tempo ragionevole, la risoluzione temporale non può essere troppo bassa. Una risoluzione temporale che va da 50-120 fotogrammi·^s-1 è di solito adeguata per la procedura potenziata dal flusso nella maggior parte delle specie. Su alcuni sistemi ad ultrasuoni, questa risoluzione temporale desiderata può essere ottenuta passando tra le modalità "imaging generale" (alta risoluzione spaziale / bassa temporale) e "cardiologia" (bassa risoluzione spaziale / temporale alta).
6. Regola il guadagno 2D a un livello (~ 5 dB), in modo che le strutture anatomiche siano appena visibili nell'acquisizione in modalità B per aumentare il rapporto segnale-rumore nella successiva ricostruzione potenziata dal flusso.
7. Per acquisire un'immagine 2D ottimizzata per il flusso in una singola posizione slice, tradurre il trasduttore in questa posizione e continuare al passaggio 3.1.
8. Per acquisire una registrazione 3D di un'intera regione di interesse, ad esempio la retina, tradurre il trasduttore a un estremo della regione di interesse.
   1. Per determinare la posizione esatta dell'estremità estrema della regione di interesse, aumentare brevemente il guadagno 2D.
   2. Al termine del corretto posizionamento del trasduttore, ridurre il guadagno 2D prima della registrazione per garantire il massimo rapporto segnale-rumore nella successiva ricostruzione potenziata dal flusso.
9. Per ogni passaggio (slice) nella registrazione 3D, acquisire ≥100 fotogrammi (in modo ottimale ≥1000 fotogrammi).
10. Utilizzando un micromanipolatore o un motore trasduttore incorporato, tradurre il trasduttore attraverso l'intera regione di interesse in passi di, ad esempio, 25 μm o 50 μm (ricordarsi di notare la dimensione del passo) e ripetere l'acquisizione di fotogrammi ≥100 per ogni passaggio.
11. Eutanasia dell'animale da ricerca secondo le linee guida per la cura degli animali dell'istituzione.

3. Ricostruzione dell'immagine ottimizzata dal flusso

1. Esportare le registrazioni in formato di file DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) (little-endian).
2. Per produrre una singola immagine ottimizzata dal flusso basata su una registrazione cinematografica ≥100 fotogrammi (T), calcolate la deviazione standard a livello di pixel (STD(x,y)) utilizzando la formula:
   
   Dove _It(x,y) è l'intensità del pixel alla coordinata del pixel (x,y) al tempo t, e _Īt(x,y) è il valore medio aritmetico di I nel tempo.
3. Ripetere il passaggio 3.2 per ogni fetta nella registrazione 3D.
4. Per automatizzare il processo di calcolo STD e ricostruzione dell'immagine per più sezioni in una registrazione 3D, eseguire questa operazione in modalità batch utilizzando, ad esempio, ImageJ e lo script macro supplementare (File supplementare 1).
5. Combina tutte le sezioni ricostruite in un'unica pila di immagini (comando Da visualizzare a impilare in ImageJ).
6. Specificate lo spessore della fetta dalla dimensione del passo utilizzata durante l'acquisizione (comando Proprietà in ImageJ).
7. Salvare lo stack di immagini come file TIF 3D.
   NOTA: Le registrazioni tridimensionali ponderate a flusso dei vasi sanguigni oculari possono successivamente essere utilizzate per creare rendering di volume e costruire modelli anatomici digitali e fisici delle strutture vascolari dell'occhio. Queste opzioni di elaborazione delle immagini esulano dall'ambito di questo protocollo; fare riferimento agli articoli precedentemente pubblicati per maggiori dettagli33,34,35.

Risultati

La tecnica ecografica potenziata dal flusso per visualizzare i letti vascolari dell'occhio può essere applicata in una vasta gamma di specie ed è stata attualmente utilizzata in 46 diverse specie di vertebrati (Figura 1, Tabella 1). La presenza di globuli rossi nucleati nei vertebrati non adulti dei mammiferi fornisce un contrasto positivo del sangue che scorre rispetto al tessuto statico nelle registrazioni cinematografiche (file supplementare 2). Tuttavi...

Discussione

L'imaging vascolare che utilizza ultrasuoni potenziati dal flusso fornisce un nuovo metodo per l'imaging non invasivo della vascolarizzazione dell'occhio che offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche attuali, ma ha i suoi limiti intrinseci. Il vantaggio principale degli ultrasuoni potenziati dal flusso è la capacità di generare angiografie oculari con una profondità di campo che supera l'epitelio pigmentato retinico, che limita la profondità di campo nelle tecniche ottiche. Nell'imaging ad ultrasuoni, la risoluzi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MS-222	Sigma	E10521-50G
Benzocaine	Sigma	E-1501
Propofol	B Braun	12260470_0320
Alfaxalon	Jurox	NA
Isoflurane	Zoetis	50019100
Ultrasound scanner	VisualSonics	Vevo 2100