Un test cellulare basato su reporter per il monitoraggio dell'efficienza di giunzione

Riepilogo

Questo protocollo descrive un minigene reporter assay per monitorare l'impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5'-splicing sullo splicing e sviluppa snRNA U1 soppressore per il salvataggio dell'inibizione dello splicing indotta da mutazioni. I costrutti di snRNA U1 reporter e soppressore sono espressi in cellule HeLa e lo splicing viene analizzato mediante estensione di primer o RT-PCR.

Abstract

Durante l'espressione genica, la fase vitale dello splicing pre-mRNA comporta un riconoscimento accurato dei siti di giunzione e un assemblaggio efficiente di complessi spliceosomiali per unire gli esoni e rimuovere gli introni prima dell'esportazione citoplasmatica dell'mRNA maturo. L'efficienza dello splicing può essere alterata dalla presenza di mutazioni nei siti di giunzione, dall'influenza di fattori di splicing trans-agenti o dall'attività terapeutica. Qui, descriviamo il protocollo per un test cellulare che può essere applicato per monitorare l'efficienza di giunzione di un dato esone. Il test utilizza un reporter minigene plasmidico codificato plasmidico 3-esone/2-introne adattabile, che può essere espresso in cellule di mammifero mediante trasfezione transitoria. Dopo la trasfezione, l'RNA cellulare totale viene isolato e l'efficienza dello splicing dell'esone nell'mRNA reporter è determinata dall'estensione del primer o dalla reazione a catena semi-quantitativa della trascrittasi-polimerasi inversa (RT-PCR). Descriviamo come l'impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5′ associate alla malattia può essere determinato introducendole nel reporter; e come la soppressione di queste mutazioni può essere ottenuta mediante co-trasfezione con il piccolo costrutto di RNA nucleare U1 (snRNA) che porta mutazioni compensatorie nella sua regione 5′ che le parti base con i siti di giunzione 5′-giunzione alle giunzioni esone-introne nei pre-mRNA. Pertanto, il reporter può essere utilizzato per la progettazione di particelle U1 terapeutiche per migliorare il riconoscimento dei siti di giunzione 5′ mutanti. L'inserimento di siti regolatori ad azione cis, come il potenziatore di splicing o le sequenze di silenziatori, nel reporter può anche essere utilizzato per esaminare il ruolo dell'U1 snRNP nella regolazione mediata da uno specifico fattore di splicing alternativo. Infine, le cellule che esprimono reporter possono essere incubate con piccole molecole per determinare l'effetto di potenziali terapie sullo splicing costitutivo pre-mRNA o su esoni portatori di siti di giunzione 5′ mutanti. Nel complesso, il test reporter può essere applicato per monitorare l'efficienza dello splicing in una varietà di condizioni per studiare i meccanismi fondamentali di splicing e le malattie associate allo splicing.

Introduzione

Lo splicing pre-mRNA è una fase di elaborazione essenziale che rimuove gli introni non codificanti e lega precisamente gli esoni codificanti per formare mRNA maturo. Il riconoscimento delle sequenze di consenso alle giunzioni esone-introne, denominate sito di giunzione 5′ e sito di giunzione 3′, da parte dei componenti del macchinario di giunzione avvia il processo di giunzione. La piccola ribonucleoproteina nucleare U1 (snRNP) riconosce il sito di giunzione 5′ mediante accoppiamento di basi dello snRNA U1 al pre-mRNA1. Le mutazioni geneticamente ereditate che alterano le sequenze del sito di g....

Protocollo

1. Reagenti e tamponi

NOTA: tutta la sterilizzazione con filtri a vuoto deve essere eseguita con membrana di polietersolfone (PES) da 0,2 μm in un armadio di biosicurezza.

1. Preparare acqua priva di RNasi aggiungendo 1,0 ml di dietilpirocarbonato (DEPC) a 1,0 L di acqua deionizzata, mescolare per almeno 1 ora a temperatura ambiente (RT), autoclave due volte e quindi raffreddare a RT prima dell'uso.
2. Preparare Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mescolando un pacchetto di polvere DMEM (13,4 g), 3,7 g di bicarbonato di sodio, 100 ml di siero bovino fetale (FBS), penicillina e streptomicina a ~ 800 ml di acqua deionizzata ....

Risultati

Il reporter di splicing Dup51, un minigene di tre esoni-due introni, è stato derivato dal gene umano β-globina ed è stato descritto in precedenza (Figura 1A) ^11,12 . Abbiamo creato un reporter mutante, Dup51p, introducendo mutazioni del sito di giunzione associate alla sindrome di Usher che si verificano nell'esone 3 del gene protocadherina 15 (PCDH15)¹³. La sequenza del sito di giunzione 5'-giunzi.......

Discussione

Il test può essere adattato per l'analisi di splicing in linee cellulari diverse da HeLa, tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare i fattori che influenzano l'efficienza della trasfezione, come la confluenza cellulare e la quantità di DNA. Il rapporto tra il costruttore reporter e U1 è un altro parametro critico che potrebbe dover essere determinato in base ai livelli di espressione osservati in altri tipi di cellule. La qualità dell'RNA estratto è fondamentale per l'analisi dello splicing; pertanto, l'uso d.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent Grade Deionized Water	ThermoFisher Scientific	23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet	Gibco	12100-046
Sodium Bicarbonate	ThermoFisher Scientific	S233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N	Sigma-Aldrich	S2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0%	ThermoFisher Scientific	A144-500
Disposable PES Bottle Top Filters	ThermoFisher Scientific	FB12566510
EDTA Disodium Salt Dihydrate	Amresco	0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	15090046
Sodium Chloride	Fisher Bioreagent	BP358-212
Potassium Chloride	Fisher Bioreagent	BP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate	Fisher Bioreagent	BP332-1
Potassium Dihydrogen Phosphate	Fisher Bioreagent	BP362-1
Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	11058021
Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000	ThermoFisher Scientific	13778150
TRIzol™ Reagent	ThermoFisher Scientific	15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)	ThermoFisher Scientific	BP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents	ThermoFisher Scientific	BP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents	ThermoFisher Scientific	BP2618-212
Glycogen (5 mg/ml)	ThermoFisher Scientific	AM9510
Direct-zol RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi	PerkinElmer	NEG035C001MC
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
Size exclusion beands - Sephadex® G-25	Sigma-Aldrich	G2580-10G
Size exclusion mini columns	USA Scientific	1415-0600
pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	N3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt	Affymetrix	76410 100 UL
Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™	Sigma-Aldrich	R2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea)	ThermoFisher Scientific	18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	10777019
Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	28025013	used for primer extension
Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10342020
Random Hexamers (50 µM)	ThermoFisher Scientific	N8080127
Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix	ThermoFisher Scientific	4472903
SuperScript™ III Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080093	used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	18080093
5X First-Strand Buffer	ThermoFisher Scientific	18080093
Formamide (≥99.5%)	ThermoFisher Scientific	BP228-100	Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium salt	Sigma-Aldrich	114405-5G
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)	ThermoFisher Scientific	BP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis)	ThermoFisher Scientific	BP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis)	ThermoFisher Scientific	BP1406-1	Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.)	ThermoFisher Scientific	BP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade	VWR	M133-25G
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure	VWR	0761-25ML	Review Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon	VWR	ASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm	VWR	NGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm	VWR	NGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm	VWR	NGP-400NR
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager	GE Healthcare	28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter	GMI	8043-30-1194
C1000 Touch Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems	ThermoFisher Scientific