Un metodo semplice modificato per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi

Riepilogo

In anestesia adeguata, il cuore del topo è stato esternalizzato attraverso lo spazio intercostale e l'infarto del miocardio è stato indotto con successo legando l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) utilizzando materiali prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori.

Abstract

L'infarto del miocardio (IM) rappresenta una delle principali cause di morte. I modelli di infarto miocardico sono ampiamente utilizzati per lo studio dei meccanismi patogenetici del rimodellamento post-infarto miocardico e per la valutazione di nuove terapie. Diversi metodi (ad esempio, trattamento con isoproterenolo, criolesione, legatura dell'arteria coronarica, ecc.) sono stati utilizzati per indurre l'infarto miocardico. Rispetto al trattamento con isoproterenolo e al criolesione, la legatura dell'arteria coronaria può riflettere meglio la risposta ischemica e il rimodellamento cronico dopo l'infarto miocardico. Tuttavia, i metodi tradizionali per la legatura coronarica nei topi sono tecnicamente impegnativi. Il presente studio descrive un processo semplice ed efficiente per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi con materiali prontamente disponibili. La pelle del torace del topo è stata tagliata in anestesia stabile. Il cuore è stato immediatamente esternalizzato attraverso lo spazio intercostale dopo la separazione smussata del grande pettorale e del piccolo pettorale. Il ramo discendente anteriore sinistro (LAD) è stato legato con una sutura 6-0 a 3 mm dalla sua origine. Dopo la legatura del LAD, la colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) ha indicato l'induzione riuscita dell'infarto miocardico e i cambiamenti temporali delle dimensioni della cicatrice post-infarto del miocardio. Nel frattempo, i risultati dell'analisi di sopravvivenza hanno mostrato mortalità conclamata entro 7 giorni dall'infarto miocardico, principalmente a causa della rottura cardiaca. Inoltre, la valutazione ecocardiografica post-infarto del miocardio ha dimostrato il successo dell'induzione della disfunzione contrattile e del rimodellamento ventricolare. Una volta padroneggiato, un modello di MI può essere stabilito nei topi entro 2-3 minuti con materiali prontamente disponibili.

Introduzione

L'infarto del miocardio (IM) rappresenta una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo 1,2,3,4,5. Nonostante la riperfusione tempestiva, attualmente mancano terapie efficaci per trattare il rimodellamento cardiaco post-infarto miocardico. Di conseguenza, sono stati compiuti sforzi considerevoli per l'esplorazione meccanicistica e lo sfruttamento terapeutico per l'infarto miocardico ^6,7,8. Da notare che l'istituzione di modelli MI è un prerequisito per raggiungere questi obiettivi.

Diversi metodi (ad esempio, il trattamento con isoproterenolo, il criodanno, la legatura delle arterie coronarie, ecc.) sono stati proposti per indurre modelli di infarto miocardico in piccoli animali. Il trattamento con isoproterenolo è un metodo semplice per l'induzione dell'infarto del miocardio, ma non può indurre l'infarto dell'area bersaglio⁹. La criolesione porta alla necrosi miocardica attraverso la generazione di cristalli di ghiaccio e la rottura della membrana cellulare piuttosto che l'ischemia diretta¹⁰. Al contrario, la legatura delle arterie coronarie consente un controllo preciso del sito di occlusione e dell'estensione dell'area dell'infarto e ricapitola fedelmente la risposta di rimodellamento dopo l'infarto^11,12. La legatura delle arterie coronarie viene in genere eseguita dopo l'intubazione, la ventilazione meccanica e la toracotomia, che è tecnicamente impegnativa^13,14. Sono stati riportati diversi protocolli modificati per la legatura delle arterie coronarie (ad esempio, senza ventilazione) che hanno potenziato l'induzione dell'infarto miocardico, ma mancano dimostrazioni visive dettagliate^15,16,17. Questi problemi rappresentano un ostacolo finanziario e tecnico significativo per i gruppi che desiderano impegnarsi nella ricerca utilizzando i modelli MI. Questo rapporto presenta un approccio per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi. Il metodo attuale è semplice, fa risparmiare tempo e utilizza strumenti e attrezzature chirurgiche che si trovano facilmente nella maggior parte dei laboratori.

Protocollo

Gli esperimenti che coinvolgono il lavoro sugli animali sono eseguiti con tutte le approvazioni necessarie da parte del Comitato etico per il benessere degli animali da laboratorio dell'ospedale Renji, Università Jiao Tong di Shanghai, Facoltà di Medicina (R52021-0506). Nello studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J femmina e maschio di età compresa tra 8 e 10 settimane.

1. Preparazione dell'attrezzatura per anestesia semplificata (OPZIONALE)

NOTA: Si tratta di una configurazione preoperatoria opzionale e può essere sostituita con un'anestesia titolabile come indicato nella sezione 2. Il comitato etico istituzionale per gli animali e il veterinario o i veterinari dovrebbero essere consultati prima di adattare tale impostazione alle procedure sugli animali.

1. Prendi una provetta da centrifuga da 15 mL e fai un taglio perpendicolare all'asse lungo della provetta a circa 3 cm dall'apertura.
   NOTA: Assicurarsi che il taglio sia maggiore della metà della circonferenza circolare del lume del tubo in modo che la valvola possa essere inserita correttamente.
2. Praticare dei fori (diametro, 2 mm) sulla parete della provetta da centrifuga tra il taglio e l'apertura della provetta.
3. Tagliare un pezzo di valvola di dimensioni adeguate da un foglio di plastica e inserire la valvola nel taglio sulla parete del tubo.
   NOTA: La valvola può essere utilizzata per controllare la velocità di rilascio dell'isoflurano modificando la profondità di inserimento.
4. All'interno di una cappa aspirante, aprire il fondo del tubo e collegarlo all'alimentazione dell'ossigeno. Posizionare un batuffolo di cotone vicino all'estremità inferiore del tubo, aggiungere un carico di 0.5 mL di isoflurano (come ottenuto, vedere la tabella dei materiali) sul batuffolo di cotone e chiudere la valvola.
5. Testare l'efficacia dell'anestesia mascherando i topi con provette preparate come descritto sopra. Monitorare la frequenza respiratoria e la profondità dell'anestesia in base alla risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
   NOTA: Una frequenza respiratoria inferiore a 10 volte/10 s suggerisce un'anestesia eccessiva e la profondità di inserimento della valvola deve essere regolata. Per tutte le procedure che prevedono l'anestesia, è necessario utilizzare un filtro per gas riempito con fogli di carbone attivo (Figura 1A-i) e l'intervento chirurgico deve essere eseguito all'interno di una cappa.

2. Preparazione operatoria e anestesia

1. Preparare e sterilizzare tutti gli strumenti necessari il giorno dell'intervento, tra cui un paio di pinze, un emostato per microzanzare, un paio di forbici chirurgiche, due paia di portaaghi, sutura chirurgica in seta 4-0, sutura chirurgica in seta 6-0, un filtro per gas e una fonte di luce (vedere Tabella dei materiali) (Figura 1A).
2. Indossare una mascherina chirurgica e guanti sterili.
3. Applicare la crema depilatoria sul petto del topo e attendere 1 minuto. Pulisci delicatamente la crema depilatoria e i capelli con una garza bagnata.
4. Tenere il mouse con la mano dominante dopo la depilazione. Indurre l'anestesia per inalazione di isoflurano vaporizzato (4%) con apporto di ossigeno (1L/min) e mantenere al 2-3% di isoflurano.
5. Confermare un'anestesia adeguata in base alla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
6. Applicare una crema per gli occhi sterile su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale.
7. Fissare i topi su una piattaforma chirurgica in posizione supina. Applicare tre volte tamponi di iodio povidone (vedere Tabella dei materiali) sul torace e coprire il torace disinfettato con un telo sterile.

3. Induzione dell'infarto del miocardio

1. Sostituire i guanti contaminati per garantire la sterilità.
2. Praticare un taglio cutaneo di 0,5 cm lungo la linea che collega lo xifoide e l'ascella dopo il blocco locale con lidocaina.
3. Separare senza mezzi termini i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori usando una pinza e un emostatico micro-zanzara per esporre il quarto spazio intercostale.
4. Aprire il quarto spazio intercostale utilizzando un emostato micro-zanzare.
5. Esternare il cuore spingendo il cuore verso il quarto spazio intercostale con l'indice della mano sinistra.
6. Fissare il cuore con la mano sinistra e legare il ramo discendente anteriore sinistro con una sutura 6-0 a 3 mm dalla sua origine.
7. Riposizionare rapidamente il cuore nella cavità toracica.
   NOTA: È sicuro esternare il cuore per meno di 30 secondi.
8. Evacuare l'aria dalla cavità toracica premendo delicatamente la cavità toracica manualmente.
9. Chiudi lo strato muscolare sopra le costole con una sutura di seta 6-0.
10. Chiudere la pelle con una sutura di seta 4-0.
11. Posizionare i mouse su un pad (37 °C) subito dopo l'operazione.
12. Iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via sottocutanea ogni 4-6 ore per ridurre il dolore post-operatorio fino a 72 ore.
13. Riportare i topi operati nelle gabbie quando si sono completamente ripresi.
    NOTA: I topi saranno completamente recuperati entro 3-5 minuti dopo l'intervento chirurgico.
14. Monitora attentamente i topi e fornisci cibo umido per un massimo di 7 giorni.

4. Prelievo dei tessuti

1. Sacrificare i topi in diversi momenti dopo l'insediamento dell'infarto miocardico per lussazione cervicale.
2. Fissare i topi sacrificati sulla piattaforma chirurgica in posizione supina.
3. Praticare un'incisione ventrale (~3-4 cm) nella parte superiore dell'addome. Tagliare le costole da entrambi i lati della cavità del torace e rimuovere il diaframma.
4. Perfondere il cuore con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (1x PBS, 4 °C) mediante iniezione intraventricolare.
5. Raccogliere il cuore tagliando la radice aortica e conservare immediatamente il cuore a -80 °C.
   NOTA: Secondo l'esperienza degli autori, è possibile eseguire la colorazione TTC entro due settimane dalla conservazione.
6. Colorare il cuore con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC).
   1. Tagliate il cuore congelato in fette spesse 1 mm sul ghiaccio con delle lamette da barba.
   2. Incubare le fette di cuore preparate in una soluzione di TTC all'1% (sciolta in 1x PBS) a 37 °C per 10-15 min.
      NOTA: Dopo 15 minuti di incubazione, scartare la soluzione TTC e immergere le fette di cuore macchiate in 1x PBS.
7. Fotografa le fette usando una fotocamera digitale.

Risultati

Il protocollo sperimentale e alcuni dei passaggi critici sono mostrati nella Figura 1. L'attrezzatura per anestesia semplificata ha indotto l'anestesia. Come mostrato nella Figura 2A, l'anestesia indotta è risultata stabile, come si evince dalle frequenze respiratorie regolari (variavano da 90 a 107 respiri/min nei topi testati). Dopo la legatura dell'arteria coronaria, l'analisi della colorazione TTC ha indicato l'induzione riuscita dell'infarto miocardico e i...

Discussione

Il presente rapporto ha dimostrato un semplice protocollo per l'induzione dell'infarto miocardico nei topi con materiali prontamente disponibili, che è stato modificato da un metodo riportato da Gao¹⁶. I modelli murini di infarto miocardico sono indispensabili per l'esplorazione meccanicistica e lo screening farmacologico per la disfunzione post-infarto del miocardio e il rimodellamento¹². Tra le tecniche esistenti per l'induzione dell'infarto miocardico, la legatura delle...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA	T8877-25G	TTC staining
4-0 silk suture	YUANKANG	4-0	Surgical instrument
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50	Sterilization for the solid
Buprenorphine	Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd.	H10940181	reduce post-operative pain
Centrifugation tube	Biological Hope	1850-K	15ML
Depilatory cream	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Depilation agent for laboratory animals
Forcep	RWD	F12028	Surgical instrument
Gas filter	ZHAOXIN	SA-493	Operator protection
Isoflurane	RWD	20071302	Used for anesthesia
Light source	Beijing PDV	LG-150B	Operating lamp
Micro-mosquito hemostat	FST	13011-12	Surgical instrument
Needle	BINXIONG	42180104	Surgical instrument
Needle and the 6-0 silk suture	JIAHE	SC086	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32030	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32010	Surgical instrument
Povidone-iodine swabs	SingleLady	GB26368-2010	Skin disinfection
Scissors	CNSTRONG	JYJ1030	Surgical instrument
Sterile eye cream	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.	H10940177	prevent corneal dryness
Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals	VisualSonics	Vevo 2100	Echocardiographic analysis