Elaborazione dei campioni di Shotgun Proteomics automatizzata da un robot da laboratorio open source

Riepilogo

Protocollo dettagliato e tre script Python sono forniti per il funzionamento di un sistema di gestione dei liquidi robotico open source per eseguire la preparazione semi-automatizzata di campioni proteici per esperimenti di spettrometria di massa, che coprono la rimozione del detergente, la digestione delle proteine e le fasi di desalinizzazione dei peptidi.

Abstract

Gli esperimenti di proteomica a fucile basati sulla spettrometria di massa richiedono più fasi di preparazione del campione, tra cui la digestione e la pulizia enzimatica delle proteine, che possono richiedere significative ore di lavoro al banco e presentare una fonte di variabilità da lotto a lotto. L'automazione di laboratorio con robot di pipettaggio può ridurre il lavoro manuale, massimizzare la produttività e aumentare la riproducibilità della ricerca. Tuttavia, i prezzi di partenza elevati delle stazioni di automazione standard le rendono inaccessibili per molti laboratori accademici. Questo articolo descrive un flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteomica utilizzando un conveniente sistema di automazione open source (The Opentrons OT-2), comprese le istruzioni per l'impostazione di passaggi semi-automatizzati di riduzione delle proteine, alchilazione, digestione e pulizia; così come gli script Python open source di accompagnamento per programmare il sistema OT-2 attraverso la sua interfaccia di programmazione delle applicazioni.

Introduzione

La proteomica del fucile a pompa basata sulla spettrometria di massa è un potente strumento per misurare l'abbondanza di molte proteine in campioni biologici contemporaneamente. Gli esperimenti di proteomica con l'analisi bioinformatica sono abitualmente impiegati per identificare i biomarcatori e scoprire complessi biologici associati e percorsi alla base dei meccanismi patologici. Con la sua elevata specificità analitica e la potenziale accuratezza quantitativa, la proteomica del fucile da caccia ha anche un eccellente potenziale per essere adottata da strutture di ricerca e laboratori diagnostici per l'analisi di campioni clinici senza la necessità di fare affidame....

Protocollo

Gli script Python sviluppati sono stati depositati su GitHub all'indirizzo: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Una copia degli script è fornita nel file supplementare 1. Fare riferimento al repository GitHub per le versioni più recenti.

1. Preparazioni sperimentali

1. Controllare l'hardware richiesto prima di avviare il protocollo.
   NOTA: sono necessari i seguenti componenti hardware: pipette OT-2, punte per pipette, set di rack per tubi 4 in 1, set di blocchi di alluminio, modulo magnetico, modulo di temperatura, piastre per pozzi profondi 2 ml a 96 pozzetti (vedere

Risultati

Qui vengono forniti tre script Python compatibili con il robot OT-2 e che eseguono la preparazione del campione per la proteomica della spettrometria di massa con una singola proteina standard di albumina sierica bovina (replica tecnicamente n = 5 digestioni) e un campione di lisato cardiaco umano contenente detergente (n = 5 digestioni). Ogni prodotto digestivo è suddiviso in due reazioni di pulizia peptidica. Il numero di corrispondenze peptidiche-spettro (PSM), peptidi e proteine identificati in ogni serie di campion.......

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo
Per ottenere le migliori prestazioni, è necessario utilizzare labware, moduli e materiali di consumo compatibili con OT-2 verificati da Opentrons. Il labware personalizzato può essere creato seguendo le istruzioni di Opentrons su ^Reference14. Assicurarsi di calibrare il deck OT-2, le pipette e il labware quando vengono utilizzati per la prima volta. È anche fondamentale seguire le linee guida del produttore di perline SP3 per prepa.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 µL pipette tips	Opentrons
4-in-1 tube rack set	Opentrons		Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column	Thermo Scientific	#164568	3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm
Acetonitrile LC-MS grade	VWR	#JT9829
Aluminum block set	Opentrons		This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.
Ammonium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	# A6141
Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL	Thermo Scientific	#23210
Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade	Thermo Scientific	#85190
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	#D5545
EASY-Spray HPLC Columns	Thermo Scientific	#ES800A
EasynLC 1200 Nano LC	Thermo Scientific	#LC140
Ethanol Proof 195-200	Fisher	#04-355-720
Formic Acid LC-MS grade	Thermo Scientific	#85178
Human heart lysate	Novus Biologicals	NB820-59217
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	#I1149
Magnetic tube rack	Thermo Scientific	#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43			Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini Centrifuge	Thermo Scientific	#75004061	benchtop mini centrifuge for quick spin
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom	Opentrons
OT-2 magnetic module	Opentrons		GEN1
OT-2 P300 single channel pipette	Opentrons		GEN1
OT-2 P50 single channel pipette	Opentrons		GEN1
OT-2 robot pipetting robot	Opentrons	OT-2
OT-2 temperature module	Opentrons		GEN1
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Scientific	#23275
Protein LoBind tubes 2.0 mL	Eppendorf	#022431102
Protein Sequence Database	UniProt/SwissProt		https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic	Cytiva	#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic	Cytiva	#45152105050250
SpeedVac	Thermo Scientific		Vacuum evaporator
Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer	Thermo Scientific	#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsin MS Grade	Thermo Scientific	#90057
Water LC-MS grade	VWR	#BDH83645.400