Determinare il ruolo dei geni espressi per via materna nello sviluppo precoce con i crispanti materni

Riepilogo

Lo sviluppo precoce dipende dai prodotti ereditari materni e il ruolo di molti di questi prodotti è attualmente sconosciuto. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza CRISPR-Cas9 per identificare i fenotipi di effetti materni in una singola generazione.

Abstract

Lo sviluppo precoce dipende da un pool di fattori materni incorporati nell'ovocita maturo durante l'oogenesi che svolgono tutte le funzioni cellulari necessarie per lo sviluppo fino all'attivazione del genoma zigotico. Tipicamente, il targeting genetico di questi fattori materni richiede una generazione aggiuntiva per identificare i fenotipi degli effetti materni, ostacolando la capacità di determinare il ruolo dei geni espressi per via materna durante lo sviluppo. La scoperta delle capacità di editing biallelico di CRISPR-Cas9 ha permesso lo screening dei fenotipi embrionali nei tessuti somatici di embrioni iniettati o "crispanti", aumentando la comprensione del ruolo che i geni espressi zigoticamente svolgono nei programmi di sviluppo. In questo articolo viene descritto un protocollo che è un'estensione del metodo crispant. In questo metodo, l'editing biallelico delle cellule germinali consente l'isolamento di un fenotipo di effetto materno in una singola generazione, o "crispanti materni". Il multiplexing degli RNA guida verso un singolo bersaglio promuove la produzione efficiente di crispanti materni, mentre l'analisi della sequenza degli aploidi dei crispanti materni fornisce un metodo semplice per corroborare le lesioni genetiche che producono un fenotipo di effetto materno. L'uso di crispanti materni supporta la rapida identificazione di geni essenziali espressi per la madre, facilitando così la comprensione dello sviluppo precoce.

Introduzione

Un pool di prodotti depositati per la madre (ad esempio, RNA, proteine e altre biomolecole) è necessario per tutti i processi cellulari precoci fino all'attivazione del genoma zigotico dell'embrione¹. L'esaurimento prematuro di questi prodotti dall'ovocita è tipicamente letale embrionale. Nonostante l'importanza di questi geni nello sviluppo, il ruolo di molti geni espressi per via materna è attualmente sconosciuto. I progressi nella tecnologia di modifica genetica nei pesci zebra, come CRISPR-Cas9, consentono il targeting dei geni espressi per via materna ^2,3,4. Tuttavia, l'identificazione di un fenotipo con effetto materno richiede una generazione in più rispetto a un fenotipo zigotico, richiedendo quindi più risorse. Recentemente, la capacità di editing biallelico di CRISPR-Cas9 è stata utilizzata per lo screening di fenotipi embrionali in tessuti somatici di embrioni iniettati (F0), noti come "crispants"5,6,7,8,9,10. La tecnica crispant consente uno screening efficiente in termini di risorse dei geni candidati nelle cellule somatiche, facilitando la comprensione di aspetti specifici nello sviluppo. Il protocollo descritto in questo documento consente l'identificazione di fenotipi di effetti materni, o "crispanti materni", in una singola generazione¹¹. Questo schema è ottenibile moltiplicando gli RNA guida in un singolo gene e promuovendo eventi di editing biallelico nella linea germinale. Questi embrioni materni crispanti possono essere identificati da fenotipi morfologici grossolani e sottoposti a caratterizzazione primaria, come l'etichettatura per i confini cellulari e il pattern del DNA¹¹. L'analisi combinata del fenotipo osservabile e la caratterizzazione molecolare di base degli INDEL indotti consente di prevedere il ruolo del gene bersaglio nello sviluppo precoce.

Nel pesce zebra, durante le prime 24 ore dopo la fecondazione (hpf), un piccolo gruppo di cellule si sviluppa nelle cellule germinali primordiali, un precursore della linea germinale^12,13,14,15. Nelle frizioni deposte dalle femmine F0, la proporzione di embrioni materni di crispant recuperati dipende da quante cellule germinali contengono un evento di editing biallelico nel gene bersaglio. In generale, prima si verifica l'evento di editing nell'embrione, maggiore è la probabilità che si osservino mutazioni CRISPR-Cas9 nella linea germinale. Nella maggior parte dei casi, i fenotipi degli embrioni materni crispanti derivano dalla perdita di funzione nei due alleli materni presenti nell'ovocita in via di sviluppo. Quando l'ovocita termina la meiosi, uno degli alleli materni viene estruso dall'embrione attraverso il corpo polare, mentre l'altro allele viene incorporato nel pronucleo materno. Il sequenziamento di aploidi crispanti materni multipli rappresenterà una miscela delle mutazioni (inserzioni e/o delezioni (INDEL)) presenti nella linea germinale che contribuiscono al fenotipo¹¹.

Il seguente protocollo descrive i passi necessari per creare mutazioni CRISPR-Cas9 nei geni con effetto materno e identificare il fenotipo corrispondente utilizzando un approccio crispante materno (Figura 1). La prima sezione spiegherà come progettare e creare efficacemente RNA guida, mentre le sezioni due e tre contengono passaggi critici per la creazione di crispanti materni mediante microiniezione. Dopo aver iniettato la miscela CRISPR-Cas9, gli embrioni iniettati vengono sottoposti a screening per modifiche somatiche tramite PCR (sezione quattro). Una volta che gli embrioni F0 iniettati si sviluppano e raggiungono la maturità sessuale, le femmine F0 vengono incrociate con maschi wild-type e la loro prole viene sottoposta a screening per fenotipi di effetti materni (sezione cinque). La sesta sezione include istruzioni su come produrre aploidi crispanti materni che possono essere combinati con il sequenziamento Sanger per identificare gli INDEL indotti da CRISPR-Cas9. Inoltre, la discussione contiene modifiche che possono essere apportate al protocollo per aumentare la sensibilità e la potenza di questo metodo.

Protocollo

Negli studi che hanno portato allo sviluppo di questo protocollo, tutti gli stabulamenti e gli esperimenti del pesce zebra sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).

1. Sintesi di RNA guida

NOTA: I crispanti zigotici sono stati creati utilizzando un singolo RNA guida o multiplexando più RNA guida a un singolo bersaglio 5,6,7,8,9,10. Il multiplexing degli RNA guida aumenta la percentuale di embrioni che mostrano un fenotipo¹⁰ croccante zigotico. A causa di questa maggiore frequenza di embrioni che mostrano un fenotipo, i crispanti materni vengono creati multiplexando quattro RNA guida a un singolo gene. Un protocollo più dettagliato sull'uso di CHOPCHOP per progettare RNA guida e un metodo di ricottura per sintetizzare RNA guida per zebrafish può essere trovato altrove 16,17,18,19,20.

1. Per identificare un gene espresso per la madre da colpire, accertare i livelli di trascrizione dell'mRNA durante lo sviluppo tramite un database di sequenze di RNA che fornisce informazioni sul trascrittoma dallo zigote a 5 giorni²¹. In generale, i geni materno-specifici sono altamente espressi nell'embrione precoce e vengono degradati dopo l'attivazione del genoma zigotico²².
2. Una volta identificato un gene bersaglio espresso per la madre, determinare il primo dominio proteico previsto utilizzando la sezione "domini e caratteristiche" disponibile sul browser del genoma Ensembl²³. Usa questo dominio come regione target per i quattro RNA guida.
3. Utilizzare il programma di selezione dell'RNA guida CHOPCHOP per identificare quattro siti bersaglio dell'RNA guida nel primo dominio attivo. Progettare oligonucleotidi gene-specifici, come mostrato di seguito per ciascun sito bersaglio. Nell'oligonucleotide gene-specifico, la sezione N²⁰ corrisponde alla sequenza bersaglio meno il sito PAM (NGG) di CHOPCHOP. Ordinare questi oligonucleotidi gene-specifici e l'oligonucleotide costante usando la purificazione desalinosa standard (vedi Tabella dei materiali).
   Oligonucleotide gene-specifico:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Per creare un modello di RNA guida per ogni oligonucleotide gene-specifico, rifornirlo all'oligonucleotide costante e riempire le sporgenze con T4-DNA polimerasi come descritto in precedenza¹⁶. Dopo aver assemblato i quattro modelli di RNA guida, purificarli e concentrarli insieme utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
5. Sintetizzare la miscela di sgRNA dal modello di RNA guida aggregato utilizzando un kit di trascrizione T7 in vitro (vedi Tabella dei materiali). Eseguire la trascrizione in vitro secondo le istruzioni del produttore. L'utilizzo delle mezze reazioni del kit di trascrizione T7 può ridurre il costo per reazione.
6. Dopo la sintesi dell'RNA, purificare il pool risultante di sgRNA utilizzando un protocollo di etanolo / acetato di ammonio come precedentemente descritto 16,20,24. Dopo che l'RNA è stato isolato, risospenderlo in 20 μL di acqua priva di nucleasi. Se le semireazioni del kit di trascrizione T7 sono state utilizzate per trascrivere il pool di sgRNA, risospendere l'RNA purificato in 10-15 μL di acqua priva di nucleasi.
7. Quantificare la quantità di sgRNA aggregati che sono stati creati utilizzando uno spettrofotometro. Diluire il pool di sgRNA in acqua priva di nucleasi fino a una diluizione di 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Tipicamente, il volume finale della diluizione di lavoro varia da 30-50 μL.
8. Dopo aver determinato la concentrazione del pool di sgRNA, verificare l'integrità degli sgRNA su un gel di agarosio all'1%.
   1. Gettare un gel di agarosio/0,5 μg/mL di bromuro di etidio/TBE all'1%. Una volta che il gel si è solidificato, posizionarlo nel tampone di esecuzione TBE.
   2. Mescolare 1 μL della miscela di sgRNA e 1 μL di tampone di carico del gel di RNA (vedere Tabella dei materiali). Caricare questo campione nel gel e far scorrere il gel a 100 V per 5 minuti.
9. Visualizza le bande usando la luce ultravioletta (UV). Il pool di sgRNA dovrebbe apparire come una singola banda. Se si osserva uno striscio, è probabile che si sia verificata la degradazione dell'RNA.
10. Conservare il pool di sgRNA in aliquote monouso da 1 μL in provette per strisce PCR prive di nucleasi nel congelatore a -80 °C. Per grandi volumi di miscela di sgRNA (30 μL o più), aliquote metà del volume nelle provette per strisce PCR prive di nucleasi e conservare l'altra metà come volume maggiore in una provetta da microcentrifuga priva di nucleasi. Scongelare e aliquote quando necessario.
11. Per prevenire la degradazione dell'RNA, assicurarsi che i campioni nella provetta della microcentrifuga non subiscano più di due cicli di congelamento-scongelamento.

2. Preparazione di reagenti e materiali per la microiniezione

NOTA: Nel pesce zebra, l'iniezione di mRNA Cas9 può creare crispanti zigotici. Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che la proteina Cas9 è più efficiente nella creazione di INDEL negli embrioni iniettati^16,25. Questo protocollo utilizza la proteina Cas9 per generare crispanti materni perché questa proteina non sperimenta lo stesso ritardo nell'attività dell'mRNA Cas9 iniettato. In teoria, questo dovrebbe aumentare la probabilità di una mutazione biallelica all'inizio dello sviluppo, con conseguente aumento della possibilità che una sezione più estesa della linea germinale venga colpita. Altri protocolli e risorse che descrivono in dettaglio come prepararsi per le microiniezioni possono essere trovati altrove^24,26.

1. Acquistare o generare la proteina Cas9 (vedi Tabella dei materiali). Risospendere la proteina Cas9 in acqua priva di nucleasi per produrre una soluzione da 2 mg/ml e aliquote 1 μL in provette per microcentrifuga in polipropilene privo di RNasi. Conservarli come tubi monouso a -80 °C.
2. Il pomeriggio prima dell'iniezione, utilizzare un estrattore di micropipette per tirare un capillare di vetro e creare un ago per iniezione. Conservare l'ago intatto in un portaaghi chiuso fino alla mattina delle microiniezioni.
3. Per creare una piastra di iniezione, versare 20 ml di agarosio all'1,5% / H₂O sterile per riempire metà di una capsula di Petri da 100 mm X 15 mm e attendere che si solidifichi. Una volta fissata la soluzione di agarosio, aggiungere 20 ml di agarosio all'1,5% / H₂O sterile alla piastra di Petri e posizionare lo stampo di plastica (vedi Tabella dei materiali) nell'agarosio liquido e lasciarlo indurire.
4. Dopo che l'agarosio si è indurito, rimuovere lo stampo di plastica e conservare la piastra di iniezione capovolta in frigorifero fino alla mattina delle iniezioni. Una singola piastra può essere utilizzata per iniezioni multiple purché i pozzetti mantengano la loro integrità.

3. Microiniezione del cocktail CRISPR-Cas9 in un embrione di zebrafish unicellulare per generare crispanti materni

NOTA: Ulteriori risorse per la microiniezione negli embrioni di zebrafish possono essere trovate altrove^24,26,27. L'iniezione della miscela CRISPR-Cas9 nel blastodisco in via di sviluppo di embrioni unicellulari può aumentare la probabilità di creare crispanti materni. La miscela può anche essere iniettata nel sacco vitellino fino allo stadio a 2 cellule. Tuttavia, le miscele iniettate nel tuorlo dipendono dal flusso ooplasmatico per raggiungere il blastodisco, quindi CRISPR-Cas9 iniettato nel tuorlo potrebbe ridurre l'efficienza di taglio di CRISPR-Cas9²⁸.

1. Il pomeriggio prima delle microiniezioni, impostare incroci di tipo selvatico in scatole di accoppiamento zebrafish. Tenere sia il pesce maschio che la femmina nella stessa vasca ma separarli con un divisorio per la scatola di accoppiamento o posizionare la femmina all'interno di un inserto per la deposizione delle uova.
2. La mattina dell'esperimento, estrarre un'aliquota di 2 mg/ml di proteina Cas9 e un'aliquota del pool di sgRNA. Nel tubo di microcentrifuga in polipropilene privo di RNasi che contiene la proteina Cas9, assemblare una miscela di iniezione da 5 μL che include il pool di sgRNA, 1 μL di soluzione rosso fenolo allo 0,5% e acqua priva di nucleasi. Puntare a una concentrazione finale di 400 ng/μL di proteina Cas9 e 200 ng/μL di sgRNA aggregati in acqua priva di RNasi o un rapporto 2:1 tra proteina Cas9 e sgRNA nell'embrione iniettato. Questa miscela per iniezione può essere conservata sul ghiaccio per la mattina dell'iniezione.
3. Rimuovere una piastra di iniezione dal frigorifero e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente (RT) per almeno 20 minuti.
4. Dopo aver assemblato il cocktail di iniezione, consentire al maschio e alla femmina di accoppiarsi, ad esempio rimuovendo il divisorio della scatola di accoppiamento o posizionando il maschio nello stesso inserto di deposizione delle uova della femmina, a seconda dei casi.
5. Dopo che il pesce ha deposto, ma prima che gli embrioni siano stati raccolti, tagliare la punta di un ago ininterrotto usando una nuova lama di rasoio o una pinza sottile per creare un ago che abbia un foro abbastanza piccolo da evitare danni agli embrioni ma abbastanza largo da non intasarsi con la miscela per iniezione. Dopo aver tagliato l'ago, caricare l'ago con la miscela per iniezione utilizzando una punta di pipetta microloader inserita nell'estremità posteriore del capillare (vedere Tabelle dei materiali).
6. Dopo aver riempito l'ago, incubare l'ago per 5 minuti a RT per assemblare i complessi Cas9-sgRNA.
7. Accendere il microiniettore e inserire l'ago nel micromanipolatore. Posizionare una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e calibrare l'ago regolando la pressione di iniezione fino a quando l'ago espelle un bolo di 1 nL nell'olio minerale.
   NOTA: Quando si inietta nell'olio minerale, un bolo di 1 nL avrà un diametro di circa 0,125 mm (o raggio di 0,062 mm) misurato con il vetrino micrometrico.
8. Per sincronizzare gli embrioni, raccoglierli dopo 10 minuti usando un colino di plastica e sciacquarli in una capsula di Petri usando 1x mezzo E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ e aggiungere 20 μL di 0,03 M Blu di metilene per 1 L di 1x E3). Rimuovere 10-15 embrioni e metterli in una capsula di Petri separata per essere conservati come controlli non iniettati.
9. Trasferire il resto degli embrioni in via di sviluppo nei pozzetti della piastra di iniezione.
10. Iniettare 1 nL di soluzione (un totale di 400 pg di proteina Cas9 e 200 pg di sgRNA) nel blastodisco in via di sviluppo di un embrione unicellulare. Se la punta dell'ago si ostruisce, usare una pinza per rompere la punta indietro e ricalibrare l'ago per espellere un bolo di 1 nL. Assicurarsi di iniettare tutti gli embrioni durante i primi 40 minuti di sviluppo dopo la fecondazione.
11. Al termine dell'iniezione, riportare gli embrioni iniettati in una capsula di Petri marcata che contiene 1x mezzo E3 e consentire loro di svilupparsi durante il giorno. Rimuovere tutti gli embrioni che non sono fecondati o non si sviluppano normalmente secondo la serie di stadiazione del pesce zebra²⁹.

4. Screening per INDELs somatici in embrioni iniettati F0

NOTA: Altri metodi per identificare gli INDEL, come il saggio di endonucleasi I T7 o l'analisi di fusione ad alta risoluzione, possono essere utilizzati per determinare se gli embrioni contengono INDEL somatici ³⁰.

1. Il giorno successivo alle iniezioni, rimuovere gli embrioni difettosi e lisati dalla capsula di Petri e sostituire i 1x mezzi E3 per mantenere la salute dell'embrione.
2. Dopo aver pulito il piatto, raccogliere sei embrioni sani iniettati e due embrioni di controllo dalla piastra non iniettata. Posizionare ogni embrione individualmente in un singolo pozzetto di un tubo di striscia PCR ed etichettare la parte superiore dei tubi.
3. Per estrarre il DNA genomico dei singoli embrioni, rimuovere il mezzo E3 in eccesso dai pozzetti del tubo a strisce e aggiungere 100 μL di 50 mM NaOH per pozzetto.
4. Incubare gli embrioni a 95 °C per 20 minuti. Quindi raffreddare i campioni fino a 4 °C, aggiungere 10 μL di 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vorticerli per 5-10 s. Questo DNA estratto può essere conservato a -20 °C per almeno 6 mesi senza una significativa degradazione del DNA.
5. Progetta primer di screening unici per ogni sito guida per amplificare un frammento di DNA di 100-110 bp che include il sito target CRISPR-Cas9. Se possibile, posizionare il sito di destinazione al centro del frammento amplificato, consentendo l'identificazione di delezioni più grandi.
6. Per ciascuno dei quattro siti bersaglio guida, impostare otto reazioni PCR da 25 μL utilizzando 5 μL del DNA genomico a singolo embrione preparato, del mix PCR e dei primer di screening specifici della guida per identificare le mutazioni somatiche nel sito bersaglio (Tabella 1).
7. Gettare un gel di agarosio/0,5 μg/mL di bromuro di etidio/TBE al 2,5% utilizzando pettini che creano pozzetti larghi circa 0,625 cm. Questo ampio pettine consente una migliore risoluzione quando si rilevano cambiamenti di dimensioni nella sequenza genomica. Dopo che il gel si è solidificato, posizionarlo in una camera di elettroforesi contenente tampone di funzionamento TBE.
8. Aggiungere 5 μL di colorante di carico 6x al prodotto PCR e caricare 25 μL di questa miscela nel gel. Assicurarsi che i campioni iniettati e di controllo siano eseguiti sulla stessa fila di gel. Dopo aver caricato tutti i campioni, aggiungere 5 μL di bromuro di etidio per 1 L di tampone corrente TBE all'estremità positiva della scatola di gel.
9. Eseguire il gel a 120 V fino a quando le bande di DNA si risolvono o il DNA si avvicina alla fine della corsia. Se il Cas9 ha creato INDEL nel sito target, uno striscio è tipicamente osservato nei campioni iniettati ma non nei controlli.
10. Se si osservano strisci in almeno tre dei quattro siti guida negli embrioni iniettati con quattro RNA guida, crescere gli embrioni iniettati fratelli.
11. Ogni volta che i campioni iniettati non contengono strisci nel numero richiesto di siti guida, progettare nuovi RNA guida per sostituire quelli che non hanno funzionato e creare un nuovo pool di RNA guida che includa quelli che hanno funzionato e quelli di nuova progettazione. Iniettare e testare il nuovo pool per INDEL somatici come descritto sopra.

5. Identificazione dei fenotipi dell'effetto materno in embrioni materni crispanti

NOTA: Una volta che le femmine F0 iniettate hanno raggiunto la maturità sessuale, le loro cellule germinali hanno il potenziale per generare una miscela di embrioni materni crispant e wild-type. Anche se questa miscela consente controlli interni per la fecondazione e la tempistica dello sviluppo, è comunque utile impostare un incrocio di tipo selvatico come controllo esterno nel caso in cui una frizione della femmina F0 contenga solo embrioni croccanti materni.

1. Il pomeriggio prima dell'esperimento, impostare le femmine iniettate F0 contro maschi wild-type e controllare gli incroci wild-type in scatole di accoppiamento zebrafish standard. Metti sia il pesce maschio che la femmina nella stessa vasca ma separali con un divisorio per la scatola di accoppiamento o posiziona la femmina all'interno di un inserto per la deposizione delle uova.
2. La mattina dell'esperimento, consentire al maschio e alla femmina di iniziare l'accoppiamento, ad esempio, rimuovendo il divisore della scatola di accoppiamento o posizionando il maschio nello stesso inserto di deposizione delle uova della femmina.
3. Raccogliere gli embrioni ogni 10 minuti spostando l'inserto per la deposizione delle uova in un nuovo fondo della vasca di accoppiamento che contiene acqua fresca del sistema ed etichettare la vasca con un'etichetta che identifica la singola femmina F0. Prendi la vecchia vasca di accoppiamento e versa l'acqua attraverso un colino da tè per raccogliere gli embrioni da una singola frizione di 10 minuti.
4. Una volta che gli embrioni di una singola frizione di 10 minuti sono stati raccolti nel filtro, trasferirli in una capsula di Petri contenente 1x mezzo E3. Etichettare la capsula di Petri con l'ora di raccolta e le informazioni sul pesce.
5. Sotto un microscopio da dissezione con una fonte di luce trasmessa, osservare gli embrioni in fase di sviluppo ogni ora per le prime 6-8 ore e ogni giorno per i prossimi 5 giorni.
6. Identificare potenziali embrioni materni crispant mediante grossolani cambiamenti morfologici nel loro sviluppo rispetto ai controlli wild-type corrispondenti nel tempo²⁹.
7. Spostare i potenziali embrioni materni crispant in una capsula di Petri che contenga 1x E3 media e saggio per fenotipo morfologico a 24 hpf e vitalità (ad esempio, gonfiaggio della vescica natatoria) a 5 giorni dopo la fecondazione.

6. Sequenziamento degli alleli negli aploidi croccanti materni

NOTA: Gli aploidi croccanti materni contengono un singolo allele nel locus bersaglio, consentendo l'identificazione di INDELs nel gene bersaglio tramite sequenziamento Sanger. Gli embrioni aploidi croccanti materni possono anche essere analizzati utilizzando saggi di sequenziamento di nuova generazione. Gli embrioni che mostrano un fenotipo croccante materno dovrebbero portare una lesione in almeno uno dei quattro siti bersaglio (vedi discussione).

1. Il pomeriggio prima dell'esperimento, hanno creato coppie di accoppiamento di femmine F0 note per produrre embrioni materni crispant incrociati con maschi selvatici. Tenere i maschi selvatici fisicamente separati dalle femmine usando un divisorio per la scatola di accoppiamento o posizionare la femmina nell'inserto per la deposizione delle uova.
2. La mattina dell'esperimento, rimuovere la partizione fisica o posizionare sia i maschi che le femmine all'interno dell'inserto di deposizione delle uova per iniziare l'accoppiamento. Al primo segno di deposizione delle uova, interrompere l'allevamento separando il maschio e le femmine F0. Tenere ogni femmina F0 separata in singole scatole di accoppiamento.
3. Preparare la soluzione di spermatozoi trattati con UV usando testicoli di un maschio wild-type per ogni 100 μL di soluzione di Hank (Tabella 2), sufficiente per fecondare le uova estruse da una femmina, come descritto in precedenza³¹.
4. Estrusione manuale di ovuli maturi dalle femmine F0 preselezionate ed eseguire la fecondazione in vitro (IVF) utilizzando lo sperma trattato con UV³¹.
5. Dopo la fecondazione in vitro , lasciare che gli embrioni aploidi si sviluppino fino a quando non si osserva il fenotipo del crispante materno e posizionare tali embrioni in una capsula di Petri diversa.
6. Una volta identificati gli embrioni aploidi croccanti materni, lasciarli sviluppare per almeno 6 ore dopo la fecondazione.
7. Per estrarre il DNA genomico da almeno dieci embrioni aploidi croccanti materni, posizionare un singolo embrione aploide in un singolo pozzetto di un tubo a striscia PCR, rimuovere i mezzi E3 in eccesso dal pozzetto e aggiungere 50 μL di 50 mM NaOH.
8. Incubare gli embrioni a 95 °C per 20 minuti. Quindi raffreddare i campioni fino a 4 °C, aggiungere 5 μL di 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vortice per 5-10 s. Il DNA estratto può essere conservato a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
9. Per identificare quali siti guida contengono INDEL, progettare primer di sequenziamento per amplificare un frammento di DNA che include tutti e quattro i siti bersaglio CRISPR-Cas9. Questi primer di sequenziamento consentono l'identificazione di INDEL che si estendono su più siti guida.
10. Impostare due reazioni PCR da 25 μL per embrione utilizzando 5 μL del DNA genomico preparato e dei primer di sequenziamento.
11. Al termine della PCR, purificare e concentrare i due campioni utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA (vedere Tabella dei materiali). Quindi sottoporre il frammento di DNA al sequenziamento Sanger utilizzando entrambi i primer di sequenziamento in avanti e indietro.
12. Dopo che il frammento di crispant materno aploide è stato sequenziato, allinearlo alla sequenza wild-type e identificare gli INDEL nei siti bersaglio utilizzando un programma di allineamento della sequenza.

Risultati

L'approccio sperimentale descritto in questo protocollo consente l'identificazione dei fenotipi degli effetti materni in modo rapido ed efficiente sotto il profilo delle risorse (Figura 1).

Generazione di crispanti materni:
Quando si progettano i quattro RNA guida per colpire un singolo gene candidato ad effetto materno, si dovrebbe prestare particolare attenzione a dove gli RNA guida si legheranno al DNA. In generale, dovrebbero essere tutti r...

Discussione

Il protocollo presentato in questo manoscritto consente l'identificazione e la caratterizzazione molecolare primaria di un fenotipo ad effetto materno in una singola generazione invece delle molteplici generazioni richieste per le tecniche genetiche sia dirette che inverse. Attualmente, il ruolo di molti geni espressi per via materna è sconosciuto. Questa mancanza di conoscenza è in parte dovuta alla generazione extra necessaria per visualizzare un fenotipo quando si identificano i geni dell'effetto materno. In passato...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes