Fabbricazione di chip micro-patterned con spessore controllato per microscopia elettronica criogenica ad alta produttività

Riepilogo

Un chip micro-modellato di nuova concezione con finestre di ossido di grafene viene fabbricato applicando tecniche di sistema microelettromeccanico, consentendo l'imaging criogenico al microscopio elettronico efficiente e ad alto rendimento di varie biomolecole e nanomateriali.

Abstract

Una delle principali limitazioni per l'analisi efficiente e ad alto rendimento della struttura delle biomolecole utilizzando la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) è la difficoltà di preparare campioni crio-EM con spessore di ghiaccio controllato su scala nanometrica. Il chip a base di silicio (Si), che ha una serie regolare di micro-fori con finestra di ossido di grafene (GO) modellata su un film di nitruro di silicio (Si_xN_y) a spessore controllato, è stato sviluppato applicando tecniche di sistema microelettromeccanico (MEMS). La fotolitografia UV, la deposizione chimica da vapore, l'incisione a umido e a secco del film sottile e la fusione a goccia di materiali nanofogli 2D sono state utilizzate per la produzione di massa dei chip micro-modellati con finestre GO. La profondità dei microfori è regolata per controllare lo spessore del ghiaccio su richiesta, a seconda delle dimensioni del campione per l'analisi crio-EM. L'affinità favorevole di GO verso le biomolecole concentra le biomolecole di interesse all'interno del micro-foro durante la preparazione del campione crio-EM. Il chip micro-modellato con finestre GO consente l'imaging crio-EM ad alto rendimento di varie molecole biologiche e nanomateriali inorganici.

Introduzione

La microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) è stata sviluppata per risolvere la struttura tridimensionale (3D) delle proteine nel loro stato nativo 1,2,3,4. La tecnica prevede il fissaggio di proteine in uno strato sottile (10-100 nm) di ghiaccio vitreo e l'acquisizione di immagini di proiezione di proteine orientate casualmente utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM), con il campione mantenuto a temperatura di azoto liquido. Migliaia o milioni di immagini di proiezione vengono acquisite e utilizzate per ricostruire una struttura 3D della proteina mediante algoritmi computazionali ^5,6. Per un'analisi di successo con crio-EM, la preparazione del criocampione è stata automatizzata congelando a immersione l'apparecchiatura che controlla le condizioni di blotting, l'umidità e la temperatura. La soluzione campione viene caricata su una griglia TEM con una membrana di carbonio bucato, successivamente cancellata per rimuovere la soluzione in eccesso, e quindi congelata a immersione con etano liquido per produrre ghiaccio sottile e vitreo ^1,5,6. Con i progressi nella crio-EM e l'automazione della preparazione del campione⁷, il cryo-EM è stato sempre più utilizzato per risolvere la struttura delle proteine, comprese le proteine dell'involucro per i virus e le proteine del canale ionico nella membrana cellulare ^8,9,10. La struttura delle proteine dell'involucro delle particelle virali patogene è importante per comprendere la patologia dell'infezione virale, nonché per sviluppare il sistema di diagnosi e i vaccini, ad esempio SARS-CoV-2¹¹, che ha causato la pandemia di COVID-19. Inoltre, le tecniche crio-EM sono state recentemente applicate alle scienze dei materiali, come per l'imaging di materiali sensibili al fascio utilizzati nelle batterie ^12,13,14 e nei sistemi catalitici ^14,15 e l'analisi della struttura dei materiali inorganici nello stato di soluzione¹⁶.

Nonostante i notevoli sviluppi nella crio-EM e nelle tecniche pertinenti, esistono limitazioni nella preparazione del criocampione, ostacolando l'analisi della struttura 3D ad alto rendimento. Preparare un film di ghiaccio vitreo con spessore ottimale è particolarmente importante per ottenere la struttura 3D di materiali biologici con risoluzione atomica. Il ghiaccio deve essere abbastanza sottile da ridurre al minimo il rumore di fondo degli elettroni dispersi dal ghiaccio e da vietare sovrapposizioni di biomolecole lungo il percorso del fascio di elettroni ^1,17. Tuttavia, se il ghiaccio è troppo sottile, può causare l'allineamento delle molecole proteiche negli orientamenti preferiti o la denaturazione 18,19,20. Pertanto, lo spessore del ghiaccio vitreo dovrebbe essere ottimizzato in base alle dimensioni del materiale di interesse. Inoltre, è in genere necessario un grande sforzo per la preparazione del campione e lo screening manuale dell'integrità del ghiaccio e delle proteine sulle griglie TEM preparate. Questo processo richiede molto tempo, il che ne ostacola l'efficienza per l'analisi della struttura 3D ad alto rendimento. Pertanto, i miglioramenti nell'affidabilità e nella riproducibilità della preparazione del campione crio-EM migliorerebbero l'utilizzo del crio-EM nella biologia strutturale e nella scoperta di farmaci commerciali, nonché per la scienza dei materiali.

Qui, introduciamo processi di microfabbricazione per la realizzazione di un chip micro-modellato con finestre di ossido di grafene (GO) progettate per crio-EM ad alto rendimento con spessore di ghiaccio controllato²¹. Il chip micro-modellato è stato fabbricato utilizzando tecniche di sistema microelettromeccanico (MEMS), che possono manipolare la struttura e le dimensioni del chip a seconda degli scopi di imaging. Il chip micro-modellato con finestre GO ha una struttura a micro pozzetto che può essere riempita con la soluzione campione e la profondità del microwell può essere regolata per controllare lo spessore del ghiaccio vitreo. La forte affinità di GO per le biomolecole aumenta la concentrazione di biomolecole per la visualizzazione, migliorando l'efficienza dell'analisi della struttura. Inoltre, il chip micro-modellato è composto da un telaio Si, che fornisce un'elevata stabilità meccanica per la griglia¹⁹, rendendolo ideale per la gestione del chip durante le procedure di preparazione del campione e l'imaging crio-EM. Pertanto, un chip micro-modellato con finestre GO fabbricate con tecniche MEMS fornisce affidabilità e riproducibilità della preparazione del campione crio-EM, che può consentire un'analisi della struttura efficiente e ad alto rendimento basata su cryo-EM.

Protocollo

1. Fabbricazione di chip micro-pattern con finestre GO (Figura 1)

1. Depositare il nitruro di silicio.
   1. Depositare il nitruro di silicio a basso stress (Si_xN_y) su entrambi i lati del wafer Si (diametro 4 pollici e spessore 100 μm) utilizzando la deposizione chimica da vapore a bassa pressione (LPCVD) a 830 °C e una pressione di 150 mTorr, sotto un flusso di 170 sccm diclorosilano (SiH₂Cl₂, DCS) e 38 sccm ammoniaca (NH₃).
   2. Utilizzando una velocità di deposizione di ~30 Å/min, controllare lo spessore Si_xN_y entro 25-100 nm variando il tempo di deposizione.
      NOTA: Estrema attenzione è necessario prestare attenzione quando si maneggia il wafer Si perché il wafer è molto sottile e fragile. Fare attenzione a non piegare il wafer durante la sua manipolazione o caricamento nell'apparecchiatura.
2. Modella il fotoresist.
   1. Applicare una soluzione di esametildilazano (HMDS) sul wafer Si_depositatoa Si x N_y con volume sufficiente a coprire l'intera superficie del wafer, girare il rivestimento con una centrifuga a 3.000 giri / min per 30 s e cuocere a 95 ° C per 30 s su una piastra calda per rendere la superficie del wafer idrofoba e quindi garantire una buona prestazione di rivestimento con fotoresist (PR).
   2. Applicare PR (Table of Materials) positivo con un volume sufficiente a coprire l'intera superficie del wafer, girare la mano a 3.000 giri / min per 30 s e cuocere a 100 ° C per 90 s su una piastra calda. Spin-coated PR ha uno spessore di 500 nm.
   3. Esporre il wafer rivestito pr con luce ultravioletta (lunghezza d'onda 365 nm e intensità 20 mW/cm²) per 5 s attraverso una maschera di cromo (Figura 2A-D) utilizzando un allineatore.
   4. Sviluppa il PR per 1 minuto usando uno sviluppatore (Table of Materials) e risciacqua il wafer immergendolo in acqua deionizzata (DI) 2x. Asciugare completamente il wafer con pattern PR soffiando gas N₂ sulla superficie del wafer.
      NOTA: Prestare estrema attenzione durante il soffiaggio del gas N₂ sul wafer Si perché il wafer è molto sottile e fragile. Non soffiare gas N₂ ad alta pressione in una direzione perpendicolare al wafer, in quanto ciò potrebbe causare la frattura del wafer.
3. Create una serie di valori Si_xN_y.
   1. Incidere il Si_xN_y esposto seguendo il modello del PR utilizzando un'incisore ionica reattiva costruita in laboratorio (RIE), con gas esafluoruro di zolfo (SF₆) da 3 sccm a una potenza di radiofrequenza (RF) di 50 W. La velocità di incisione con queste impostazioni è ~ 6 Å / s. Impostare il tempo di incisione in base allo spessore dello strato Si_xN_y depositato.
      NOTA: la velocità di incisione può variare e richiedere un'ottimizzazione in laboratorio a seconda delle specifiche dell'apparecchiatura RIE utilizzata.
   2. Eliminare il PR immergendo il wafer modellato Si_xN_y in acetone a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi risciacquando il wafer immergendolo in acqua DI 2x. Asciugare completamente il wafer soffiando gas N₂ sulla superficie del wafer.
      NOTA: è necessario prestare estrema attenzione durante l'immersione o l'estrazione del wafer dalle soluzioni perché il wafer può essere fratturato dalla tensione superficiale della soluzione. Non immergere o estrarre il wafer parallelamente alla superficie della soluzione. Utilizzare pinzette di precisione per la gestione dei wafer con punte in fibra di carbonio. Non afferrare con forza il wafer con la pinzetta; sollevare un lato del wafer fino a quando il wafer non si inclina ad angolo, dove può essere estratto dalla soluzione. Il wafer può fratturarsi quando si piega a causa della presa salda durante il sollevamento.
4. Incidere il Si.
   1. Preparare una soluzione di idrossido di potassio (KOH) da 1,5 M sciogliendo la polvere di KOH in acqua DI a 80 °C.
   2. Immergere il wafer con pattern Si_xN_y in soluzione KOH per incidere il Si esposto. Lasciare il wafer nella soluzione mescolando fino a quando le finestre Si_xN_y indipendenti possono essere osservate sul lato opposto del Si_xN_y modellato.
      NOTA: Il tempo di incisione a umido può variare a seconda dello spessore del Si; per un wafer di 100 μm di spessore, l'incisione a umido richiede normalmente diverse ore. Non impostare la velocità di agitazione troppo alta durante l'incisione Si perché le finestre si_xN_y indipendenti sono molto sottili e possono essere fratturate dal flusso del fluido. In questo esperimento, la velocità di agitazione è stata impostata su 250 giri / min.
   3. Pulire il wafer inciso immergendolo più volte in un bagno d'acqua DI per eliminare i residui di incisione. Asciugare il wafer all'aria.
      NOTA: è necessario prestare estrema attenzione durante l'immersione o l'estrazione del wafer modellato Si dalle soluzioni perché le finestre si_xN_y autoportanti sono molto sottili e fragili e possono essere fratturate dalla tensione superficiale della soluzione. Il wafer deve essere immerso o estratto ad angolo, in modo tale che il bordo del wafer entri ed esca prima dalla soluzione.
5. Eliminare i residui di incisione KOH.
   1. Premere leggermente i bordi dell'array di chip con una pinzetta per ottenere una matrice di chip che saranno micro-modellati (Figura 1B).
   2. Preparare la soluzione koh da 1,5 M a 80 °C mescolando.
   3. Immergere l'array di chip in soluzione KOH per 30 s e risciacquarlo immergendolo in acqua DI 2x. Asciugare completamente i trucioli soffiando gas N₂ .
      NOTA: Prestare estrema attenzione durante l'immersione dei trucioli in soluzioni e asciugarli con gas N₂ perché le finestre Si_xN_y indipendenti sono molto sottili e fragili. Mentre il chip è immerso nella soluzione KOH, l'agitazione deve essere interrotta. I trucioli devono essere immersi con i loro bordi prima nella direzione perpendicolare alla soluzione e soffiati con gas N₂ nella direzione parallela.
   4. Asciugare completamente l'array di chip nell'aria per almeno 1 ora.
6. Modella il PR.
   1. Preparare un wafer Si vuoto da 525 μm come supporto solido. Rivestire il wafer Si con HMDS e PR positivo, come descritto sopra, ma collegare l'array di chip (con il lato della finestra Si_xN_y indipendente verso l'alto) sul wafer Si prima di cuocere il PR. Il PR funge da adesivo tra il wafer e l'array di chip. Cuocere il wafer Si attaccato con l'array di chip a 100 °C per 90 s su una piastra calda.
   2. Spin coat il chipset con HMDS e PR positivo, come descritto sopra.
   3. Esporre il chipset con luce ultravioletta (lunghezza d'onda 365 nm; intensità 20 mW/cm²) per 5 s attraverso una maschera al cromo (Figura 2E,F) utilizzando un allineatore.
   4. Sviluppa il PR utilizzando uno sviluppatore per 15 s, risciacqua il chipset immergendolo in acqua DI 2x e asciuga completamente il chipset con pattern PR soffiando N₂ gas.
7. Preparare il micro-patterned Si_xN_y.
   1. Etch Si_xN_y seguendo il modello PR utilizzando un RIE costruito in laboratorio, con 3 sccm SF₆ gas a potenza RF di 50 W. Controllare il tempo di incisione a seconda dello spessore dello strato Si_xN_y .
8. Elimina il PR.
   1. Eliminare il PR immergendo il set di chip modellato in soluzione di 1-metil-2-pirrolidinone (NMP) a 60 °C e lasciandolo durante la notte. Risciacquare il chipset immergendolo in acqua DI 2x e asciugare completamente il chipset modellato soffiando N₂ gas.
   2. Elimina i residui di PR con un processo al plasma O₂ utilizzando gas O_{2 da} 100 sccm a una potenza RF di 150 W per 1 minuto con il RIE costruito in laboratorio.
9. Risciacquare il chip micro-modellato.
   1. Preparare una soluzione KOH da 1,5 M a 80 °C.
   2. Immergere i chip micro-modellati in soluzione KOH per 30 s per eliminare completamente i residui di PR e risciacquare i trucioli immergendoli in acqua DI 2x. Asciugare completamente i trucioli soffiando gas N₂ .
   3. Asciugare completamente i trucioli all'aria per almeno 1 ora.
10. Trasferire l'ossido di grafene (GO) con il metodo drop-casting.
    1. Diluire la soluzione di GO (2 mg/mL) a 0,2 mg/L con acqua DI e sonicare per 10 minuti per rompere gli aggregati dei fogli di GO. Centrifugare la soluzione GO diluita a 300 x g per 30 s.
    2. Glow scarica il lato inciso Si del chip micro-modellato per rendere la superficie del chip con carica positiva utilizzando uno scaricatore a bagliore (Table of Materials) a 15 mA per 1 min.
    3. Rilasciare 3 μL della soluzione GO sul lato scaricato a bagliore del chip micro-modellato e lasciare la goccia sul chip per 1 minuto. Dopo 1 minuto, asciugare la soluzione GO in eccesso sul chip con carta da filtro.
    4. Lavare il chip trasferito GO con gocce d'acqua DI preparate su pellicola di paraffina e asciugare l'acqua DI sul chip con carta da filtro. Ripetere questa procedura 2x sul lato GO trasferito e 1x sul lato opposto. Asciugare il chip trasferito GO a temperatura ambiente durante la notte.
    5. Lavare il chip micro-modellato con le finestre GO immergendolo nell'acqua DI e asciugare il chip con gas N₂ .

2. Imaging crio-EM

1. Preparare il criocampione.
   1. Preparare il criocampione utilizzando una crioimmergatrice meccanica (Table of Materials), che controlla la temperatura, l'umidità, il tempo di blotting e la forza. Dopo aver caricato il tampone sui blotter, assicurarsi che l'umidità e la temperatura nella camera siano mantenute rispettivamente al 100% e al 15 °C.
   2. Raccogli il chip micro-modellato con una tipica criopenzetta e carica la pinzetta sulla crio-tuffatrice. Pipettare 3 μL di soluzione campione sul chip micro-modellato sul lato a foro, con finestre GO sul fondo. Controllare il tempo di blotting e la forza a seconda della soluzione campione.
      NOTA: Qui, campioni biologici, vale a dire il virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1), la ferritina, il proteasoma 26S, il groEL, le particelle proteiche apoferritin e le proteine del filamento tau sono stati utilizzati per l'imaging crio-EM. Inoltre, diversi tipi di materiali inorganici, come le nanoparticelle Fe₂O₃ (NP), le nanoparticelle Au, le nanobarre Au e le nanoparticelle di silice, sono stati utilizzati per l'imaging crio-EM. Il tempo di blotting e la forza desiderati sono stati impostati sullo stantuffo crio per diversi tipi di campioni.
   3. Dopo il processo di blotting, congelare immediatamente il chip caricato con il campione in etano liquido. Trasferire il chip nella griglia in azoto liquido (LN₂) e conservarlo in LN₂ prima dell'imaging crio-EM.
2. Eseguire l'imaging crio-EM.
   1. Caricare il criocampione su un supporto crio-EM con la temperatura mantenuta a -180 °C.
   2. Caricare il supporto crio-EM in un TEM e osservare i campioni con la modalità sistema a dose minima (MDS).

Risultati

Un chip micro-modellato con finestre GO è stato fabbricato dalla fabbricazione MEMS e dal trasferimento di nanofogli GO 2D. I chip per il micro-patterning sono stati prodotti in serie, con circa 500 chip prodotti da un wafer da 4 pollici (Figura 1B e Figura 2A,B). I disegni dei chip micro-modellati possono essere manipolati utilizzando diversi disegni della maschera al cromo (Figura 2) durante la procedura di fotol...

Discussione

Qui vengono introdotti i processi di microfabbricazione per la produzione di chip micro-modellati con finestre GO. Il chip micro-modellato fabbricato è progettato per regolare lo spessore dello strato di ghiaccio vitreo controllando la profondità del microforo con finestre GO a seconda delle dimensioni del materiale da analizzare. Un chip micro-modellato con finestre GO è stato fabbricato utilizzando una serie di tecniche MEMS e un metodo di trasferimento di nanofogli 2D (Figura 1). Il pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma Aldrich, USA	443778
Acetone
AFM	Park Systems, South Korea	NX-10
Aligner	Midas System, South Korea	MDA-600S
AZ 300 MIF developer	AZ Electronic Materials USA Corp., USA	184411
Cryo-EM holder	Gatan, USA	626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine	Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA	Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)	FEI Company, USA	Helios NanoLab 650
Glow discharger	Ted Pella Inc., USA	PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution	Sigma Aldrich, USA	763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%	Alfa Aesar, USA	10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)	Centrotherm, Germany	LPCVD E1200
maP1205 positive PR	Micro resist technology, Germany	A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake	DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea	6597-4400
Raman Spectrometer	NOST, South Korea	Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)	Scientific Engineering, South Korea	Lab-built
SEM	Carl Zeiss, Germany	SUPRA 55VP
Si wafer	JP COMMERCE, South Korea		4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater	Dong Ah Trade Corp., South Korea	ACE-200
TEM	JEOL, Japan	JEM-2100F