Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio

Riepilogo

Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l'analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

L'interesse per la microscopia a elettroni liquidi (liquid-EM) è salito alle stelle negli ultimi anni, poiché gli scienziati possono ora osservare i processi in tempo reale su scala nanometrica. È estremamente desiderabile accoppiare informazioni crio-EM ad alta risoluzione con osservazioni dinamiche poiché molti eventi si verificano su scale temporali rapide - nell'intervallo di millisecondi o più velocemente. Una migliore conoscenza delle strutture flessibili può anche aiutare nella progettazione di nuovi reagenti per combattere i patogeni emergenti, come SARS-CoV-2. Ancora più importante, la visualizzazione di materiali biologici in un ambiente fluido offre uno sguardo unico delle loro prestazioni nel corpo umano. Qui sono presentati metodi recentemente sviluppati per studiare le proprietà su scala nanometrica degli assemblaggi di virus nel ghiaccio liquido e vetroso. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati utilizzati campioni ben definiti come sistemi modello. Vengono presentati confronti affiancati dei metodi di preparazione dei campioni e delle informazioni strutturali rappresentative. Le caratteristiche sub-nanometriche sono mostrate per le strutture risolte nell'intervallo di ~ 3,5-Å-10 Å. Altri risultati recenti che supportano questo quadro complementare includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini e delle terapie basate su anticorpi visualizzate in liquido. Nel complesso, queste applicazioni correlate migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per il loro uso nella salute umana e nelle malattie.

Introduzione

La ricerca biomedica migliora la nostra comprensione della salute umana e delle malattie attraverso lo sviluppo di nuove tecnologie. L'imaging ad alta risoluzione sta trasformando la nostra visione del nanomondo, permettendoci di studiare cellule e molecole in dettaglio squisito 1,2,3,4,5. Le informazioni statiche di componenti dinamici come polimeri molli, assemblaggi proteici o virus umani rivelano solo un'istantanea limitata della loro complessa narrazione. Per comprendere meglio come operano le entità m....

Protocollo

1. Caricamento del portacampioni per liquid-EM

1. Pulire i microchip di nitruro di silicio (SiN) incubando ciascun chip in 150 ml di acetone per 2 minuti, seguito dall'incubazione in 150 ml di metanolo per 2 minuti. Lasciare asciugare i trucioli nel flusso d'aria laminare.
2. Pulire al plasma i trucioli essiccati utilizzando uno strumento a scarica di bagliore operante in condizioni standard di 30 W, 15 mA per 45 s utilizzando gas Argon.
3. Caricare un microchip a base asciutta nella punta del supporto del campione. Aggiungere ~0,2 μL di campione (0,2-1 mg/ml di gruppi virali in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 m....

Risultati

Un TEM liquido funzionante a 200 kV è stato utilizzato per tutti gli esperimenti di imaging liquid-EM e un crio-TEM funzionante a 300 kV è stato utilizzato per tutta la raccolta di dati crio-EM. Vengono presentate immagini rappresentative e strutture di più virus per dimostrare l'utilità dei metodi in vari soggetti del test. Questi includono il virus adeno-associato ricombinante sottotipo 3 (AAV), gli assemblaggi subvirali SARS-CoV-2 derivati dal siero del paziente e le particelle a doppio strato (DLP) del rotavirus .......

Discussione

Vengono presentate nuove opportunità per semplificare gli attuali flussi di lavoro liquid-EM utilizzando nuovi strumenti automatizzati e tecnologie adattate dal campo crio-EM. Le applicazioni che coinvolgono la nuova tecnica a sandwich di microchip sono significative rispetto ad altri metodi perché consentono l'analisi di imaging ad alta risoluzione in ghiaccio liquido o vetroso. Uno dei passaggi più critici del protocollo è la produzione di campioni con lo spessore liquido ideale per visualizzare dettagli squisiti a.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 Liter
Autoloader clipping tool	ThermoFisher Scientific	N/A	Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips	ThermoFisher Scientific	N/A	top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids	Electron Microcopy Sciences	CF400-AU-50	400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum	RayBiotech	CoV-Pos-S-500	500 microliters of PCR+ serum
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 Liter
Microwell-integrad microchips	Protochips, Inc.	EPB-42A1-10	10x10-mm window arrays
TEMWindows microchips	Simpore Inc.	SN100-A10Q33B	9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips	Simpore, Inc.	SN100-A05Q33A	9 small windows, 5-nm thick
Top microchips	Protochips, Inc.	EPT-50W	500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Equipment
DirectView direct electron detector	Direct Electron		6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector	ThermoFisher Scientific		14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot	ThermoFisher Scientific		state-of-the-art specimen preparation unit
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM	ThermoFisher Scientific		200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3	ThermoFisher Scientific		300 kV; Cryo-TEM
Freely available software	Website link		Comments (optional)
cryoSPARC	https://cryosparc.com/		other image processing software
CTFFIND4	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4		CTF finding program
MotionCorr2	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/		molecular structure analysis software package